Разработка технологии создания высокоэффективных животных-биопродуцентов клинически значимых рекомбинантных белков человека

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 16-14-00095

НазваниеРазработка технологии создания высокоэффективных животных-биопродуцентов клинически значимых рекомбинантных белков человека

Руководитель Баттулин Нариман Рашитович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" , Новосибирская обл

Конкурс №11 - Конкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые слова Трансгенные животные, редактирование генома, биопродуценты, CRISPR/Cas9, GM-CSF человека, эмбриональные стволовые клетки, биофабрики

Код ГРНТИ34.23.27

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Получение клинически значимых рекомбинантных белков человека является сложной биотехнологической задачей. Несмотря на достижения синтетической биологии в дизайне молекул и ферментов, главной проблемой для эффективного производства белков остается выбор организма-продуцента. Даже учитывая ряд успехов, достигнутых при производстве белков человека в бактериальных биореакторах (например, производство инсулина и гормона роста), очевидно, что многие из представляющих интерес для медицины биологически активных белков не могут быть произведены в бактериальных и дрожжевых системах из-за необходимости осуществлять посттрансляционные модификации сложных эукариотических белков. Многие белки человека в микробных системах продуцируются в нерастворимом виде, что затрудняет их выделение. Получение терапевтически ценных белков человека с использованием трансгенных молочных животных имеет ряд преимуществ. Молочная железа обладает огромным потенциалом синтеза различных веществ и успешно используется для производства рекомбинантных белков (Kues, Niemann, 2011). Секретируемые с молоком белки не попадают в кровь, благодаря этому, высокая концентрация биологически активного чужеродного белка в молоке не представляет опасности для организма животного-продуцента. Стадо трансгенных животных достаточно легко содержать и размножать, без нужды прибегать к сложному оборудованию, как в случае дрожжевой экспрессии. Технология очистки белков из молока хорошо известна. По этим причинам, способы для рутинного и быстрого получения трансгенных сельскохозяйственных животных с геном интереса являются крайне важными для биотехнологий производства лекарственных препаратов и медицинских изделий. К сожалению, выбор интересующего рекомбинантного белка и рождение трансгенного животных разделяет ряд сложных этапов. В первую очередь, необходимо выбрать и охарактеризовать регуляторные области генома животного-продуцента, способные обеспечить экспрессию рекомбинантного белка на достаточно высоком уровне. Более того, район генома, в который вводится трансген, должен быть выбран таким образом, чтобы трансген экспрессировался исключительно в клетках молочной железы при лактации – в противном случае, эктопическая экспрессия трансгена может оказать серьезное влияние на жизнеспособность и физиологические характеристики трансгенных животных. После выбора целевого участка в геноме животного-продуцента, исследователь должен найти способ ввести трансген в выбранное место гена трансгена. Интеграция экзогенной ДНК в целевой участок генома по механизму гомологической рекомбинации проходит с крайне низкой частотой, и поэтому не может быть использована при получении трансгенных организмов. Существующие способы получения трансгенных животных основаны на спонтанной интеграции экзогенного фрагмента ДНК, содержащего трансген и регулирующие его экспрессию элементы, в случайное место генома. Такой подход имеет относительно высокую эффективность, однако сопряжен с неконтролируемым влиянием участков генома в месте интеграции на работу трансгена. Это влияние приводит к некорректной работе находящихся в составе трансгена регуляторных элементов, что зачастую проявляется в низкой эффективности продукции целевого белка у трансгенных животных, мозаичной и эктопической экспрессии трансгена. Для решения этой проблемы, необходима высокоэффективная технология получения животных, содержащих трансген в целевом (не случайном) участке генома. Наш проект нацелен на разработку такой технологии, и заключается в разработке метода эффективной направленной модификации локуса молочных генов млекопитающих для создания животных-биопродуцентов рекомбинантных белков человека. Другими словами, наш проект направлен на создание современной высокоэффективной технологии получения лекарственных препаратов в эукариотических системах, а именно в животных – «биофабриках». В разрабатываемой нами технологии будет использоваться система редактирования геномов CRISPR/Cas9 – наиболее эффективный из используемых на сегодняшний день методов внесения направленных геномных модификаций. Мы планируем существенно повысить эффективность работы этой системы создав линии животных, конститутивно экспрессирующих ген Cas9. Кроме того, проект предполагает создание нового способа повышения частоты таргетированной встройки за счет присоединения к Cas9 белковых доменов факторов гомологичной рекобинации. В рамках разрабатываемой нами технологии будет создана методика быстрой оценки эффективности регуляторных элементов генома животных, контролирующих работу трансгена, при помощи dCas9-активатора. Мы оценим, как разработанные подходы влияют на эффективность трансгенеза, их возможную токсичность и неспецифические эффекты Cas9 в геноме трансгенных животных (off-targets). Наконец, мы проведем апробацию разработанной технологии, получив трансгенных животных, несущих ген GM-CSF человека под эндогенным промотором альфа-S1-казеина. Разработка и апробация технологии будет проводится на мышиной модели, что делает реалистичным выполнение проекта в течение трех лет. Однако подходы, которые будут использованы в работе, в частности CRISPR/Cas9-механизм редактирования ДНК, консервативны среди живых организмов, и разработанная нами технология будет применима и для биоинженерных опытов с сельскохозяйственными животными. Таким образом, выполнение проекта позволит создать современную высокоэффективную биотехнологию производства лекарственных препаратов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Смирнов А.В., Юнусова А.М., Баттулин Н.Р. Увеличение эффективности CRISPR/ Cas9 опосредованного трансгенеза с помощью сверхэкспрессии белков, участвующих в репарации ДНК Ген и клетки, Приложение, №2, стр 48 (год публикации - 2018)

2. Смирнов А.В., Фишман В.С., Юнусова А.М., Кораблев А.Н., Серова И.А., Скрябин Б.В., Рождественский Т.С.,Баттулин Н.Р. DNA barcoding reveals that injected transgenes are predominantly processed by homologous recombination in mouse zygote Nucleic Acids Research (год публикации - 2019)
10.1093/nar/gkz1085

3. А. В. Смирнов, Т. А. Шнайдер, А. Н. Кораблев, А. М. Юнусова, И. А. Серова, Н. Р. Баттулин ГИПОМОРФНАЯ МУТАЦИЯ ГЕНА CSN1S1 МЫШИ, ПОЛУЧЕННАЯ ПРОНУКЛЕАРНОЙ МИКРОИНЪЕКЦИЕЙ CRISPR/СAS9 Вавиловский журнал генетики и селекции (год публикации - 2021)
10.18699/VJ21.036

4. Смирнов А. В., Концевая Г. В., Шнайдер Т. А., Юнусова А. М., Феофанова Н. А., Герлинская Л. А., Серова И. А., Серов О. Л., Баттулин Н. Р. Evaluation of the α‑casein (CSN1S1) locus as a potential target for a site‑specifc transgene integration Scientific reports, Scientific Reports volume 12, Article number: 7983 (2022) (год публикации - )
10.1038/s41598-022-12071-1

5. Концевая Г.В., Феофанова Н.А., Мензоров А.Г., Пристяжнюк И.Е., Смирнов А.В., Баттулин Н.Р., Герлинская Л.А. Эффективное получение химерных мышей с использованием новой линии эмбриональных стволовых клеток Вавиловский журнал генетики и селекции (год публикации - 2016)
10.18699/VJ16.213

6. Концевая Г.В., Феофанова Н.А., Мензоров А.Г., Пристяжнюк И.Е., Смирнов А.В., Баттулин Н.Р., Герлинская Л.А. Efficient Chimeric Mouse Production Using a Novel Embryonic Stem Cell Line Russian Journal of Genetics: Applied Research, Vol. 7, No. 8, pp. 806–810. (год публикации - 2017)

7. Смирнов А.В., Феофанова Н.А., Концевая Г.В., Анисимова М.В., Ковригин И.И., Серова И.А., Мошкин М.П., Герлинская Л.А., Баттулин Н.Р. Морфофизиологические эффекты инсерционного мутагенеза гена контактин 5 (Cntn5) у трансгенных мышей Вавиловский журнал генетики и селекции (год публикации - 2016)
10.18699/VJ16.212

8. Смирнов А.В., Юнусова А.М., Лукьянчикова В.А., Баттулин Н.Р. Система CRISPR/Cas9 – универсальный инструмент геномной инженерии Вавиловский журнал генетики и селекции, 2016;20(4):493-510 (год публикации - 2016)

9. Смирнов А.В., Феофанова Н.А., Концевая Г.В., Анисимова М.В., Ковригин И.И., Серова И.А., Мошкин М.П., Герлинская Л.А., Баттулин Н.Р. Morphophysiological Effects of Insertional Mutagenesis of the Contactin 5 (Cntn5) Gene in Transgenic Mice Russian Journal of Genetics: Applied Research, Vol. 7, No. 8, pp. 799–805. (год публикации - 2017)

10. Смирнов А.В., Юнусова А.М., Лукьянчикова В.А., Баттулин Н.Р. CRISPR/Cas9, a universal tool for genomic engineering Russian Journal of Genetics: Applied research (год публикации - 2017)

11. Смирнов А.В., Концевая Г.В., Феофанова Н.А., Анисимова М.В.,Серова И.А., Герлинская Л.А., Баттулин Н.Р., Мошкин М.П., Серов О.Л. Unexpected phenotypic effects of a transgene integration causing a knockout of the endogenous Contactin-5 gene in mice Transgenic Research (год публикации - 2017)

Публикации