Элиминация ккзДНК вируса гепатита В при хронической инфекции за счет нуклеолитического действия CRISPR/Cas9 систем, эпигенетического ремоделирования и модуляции путей репарации двуцепочечных разрывов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 16-15-10426

НазваниеЭлиминация ккзДНК вируса гепатита В при хронической инфекции за счет нуклеолитического действия CRISPR/Cas9 систем, эпигенетического ремоделирования и модуляции путей репарации двуцепочечных разрывов

Руководитель Чуланов Владимир Петрович, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека , г Москва

Конкурс №13 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-231 - Инфекционные заболевания

Ключевые слова вирус гепатита В, хронический гепатит В, CRISPR/Cas9, иммуноцитохимия, нуклеазы, молекулярные маяки, эпигенетика, двуцепочечные разрывы, деградация ДНК, репарация ДНК, ккзДНК, реактивация инфекции, гепатоциты

Код ГРНТИ76.29.50

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Несмотря на тот факт, что последнее десятилетие было ознаменовано существенным прогрессом в области лечения многих опасных вирусных инфекций человека, до сих пор выделяют большое количество вирусных заболеваний, которые трудно поддаются лечению или являются неизлечимыми. Процессы, лежащие в основе патогенеза вирусной инфекции, включая образование новых поколений вирусных частиц, развитие резистентности к традиционным противовирусным препаратам и встраивание в геном клеток хозяина, связаны в первую очередь с функционированием вирусного генома (РНК- или ДНК-содержащего). Парадоксально, но до сегодняшнего момента не разработан ни один противовирусный препарат, способный селективно связываться с вирусным геномом и производить его эффективную деградацию. Дело в том, что целевое расщепление нуклеиновых кислот вирусов, не вызывающее образования разрывов ДНК в геноме инфицированных клеток человека, до недавнего времени было технически не выполнимо. Напротив, современная технология на основе систем нуклеаз CRISPR/Cas9 способна расщеплять нуклеиновые кислоты по запрограммированным сайтам, тем самым позволяя добиться инактивации и полной элиминации вируса, сохраняя геном зараженных клеток человека интактным. (Ye L et al., 2014; Kennedy E et al., 2014) Нуклеазы CRISPR/Cas9 адаптированы для работы как с РНК (O’Connell et al., 2014), так и с ДНК (Sternberg S et al., 2014), поэтому мишенью для нуклеолитического расщепления может выступать вирус любой природы, достаточно лишь знать нуклеотидную последовательность цели в геноме вируса. Однако для эффективного использования сайт-специфичных нуклеаз в качестве противовирусных агентов необходим поиск оптимальной конфигурации систем CRISPRs/Cas9 и создание условий, допускающих полное и необратимое разрушение нуклеиновых кислот вируса. Кроме того, некоторые особенности вирусного цикла могут препятствовать действию систем сайт-специфичных нуклеаз, снижая эффективность и полноту расщепления. Вирус гепатита В является высоко контагиозным вирусом, способным инфицировать человека и вызывать острый или хронический гепатит В. Случаи заражения вирусным гепатитом В отмечаются по всему миру, с наибольшей распространенностью в странах Среднего и Ближнего Востока, Азии, странах Карибского Бассейна, Африки и Южной Америки. По данным ВОЗ ежегодно регистрируются 350 млн новых случаев заражения вирусным гепатитом В, из которых 1 млн человек ежегодно погибает от его последствий, цирроза печени или гепатоклеточной карциномы. (Custer B et al., 2004; Wright TL, 2006) В Российской Федерации, как и в странах Западной Европы, США, Канаде, Австралии, мероприятия по вакцинации против HBV значительно снизили заболеваемость острым гепатитом В, однако ежегодно в нашей стране регистрируется более 40 (сорока) тысяч новых случаев хронической HBV-инфекции, основной причины цирроза и рака печени (гепатоклеточной карциномы), причем абсолютно большая доля заболевших гепатитом В приходится на молодое трудоспособное население (90%). Распространенность вирусного гепатита В в Российской Федерации составляет 2% от общего населения страны, то есть около 3 млн человек. Заболеваемость вирусом гепатита В - одна из самых серьезных проблем Российского здравоохранения. (Государственный доклад, 2013). Главная причина хронизации гепатита В заключается в активности особой стабильной формы ДНК вируса, кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (ккзДНК), которая, годами персистируя в гепатоцитах человека, вызывает их гибель или злокачественную трансформацию. Деградация ккзДНК посредством сайт-специфичных нуклеаз совместно со вспомогательными факторами на моделях клеток человека in vitro и испытание безопасности применения на гуманизированных моделях животных позволит определить их перспективы в качестве универсальных противовирусных агентов, может стать основой для разработки лекарственных препаратов для лечения хронического гепатита В (ХГВ), определить особенности патогенеза ХГВ и значительно продвинуть вперед технологии лечения вирусных заболеваний. Литература: Custer B,et al., (2004). "Global epidemiology of hepatitis B virus". J. Clin. Gastroenterol. 38 (10 Suppl 3): S158–68. Kennedy E et al., Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 2014 Dec 29;476C:196-205. doi: 10.1016/j.virol.2014.12.001. O’Connell et al., Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature 516, 263–266 (11 December 2014) doi:10.1038/nature13769 Sternberg S et al., DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 2014 Mar 6;507(7490):62-7. doi: 10.1038/nature13011. Wright TL. Introduction to chronic hepatitis B infection. Am J Gastroenterol. 2006;101 Suppl 1:S1-6. Ye L et al., Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jul 1;111(26):9591-6. doi: 10.1073/pnas.1407473111. Государственный доклад «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2013 году» (http://rospotrebnadzor.ru/documents/details.php?ELEMENT_ID=1984)

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Анастасия Костюшева, Дмитрий Костюшев, Сергей Брезгин, Елена Волчкова и Владимир Чуланов Clinical Implications of Hepatitis B Virus RNA and Covalently Closed Circular DNA in Monitoring Patients with Chronic Hepatitis B Today with a Gaze into the Future: The Field Is Unprepared for a Sterilizing Cure Genes, Genes 2018, 9(10), 483 (год публикации - 2018)
10.3390/genes9100483

2. Костюшева А.П., Брезгин С.А., Зарифьян Д.Н., Чистяков Д.С., Гегечкори В.И., Баюрова Е.О., Волчкова Е.В., Костюшев Д.С., Чуланов В.П. Вирус гепатита В и сайт-специфические нуклеазы: влияние генетических модификаций CRISPR/Cas9 на противовирусную активность Инфекция и иммунитет (год публикации - 2019)

3. Костюшева А.П., Костюшев Д.С., Брезгин С.А., Зарифьян Д.Н., Волчкова Е.В., Чуланов В.П. Низкомолекулярные ингибиторы путей репарации двухцепочечных разрывов ДНК усиливают противовирусное действие системы CRISPR/Cas9 на моделях вируса гепатита В Молекулярная Биология (год публикации - 2019)
10.1134/S0026898419010075

4. Костюшев Д.С., Брезгин С.А., Костюшева А.П., Зарифьян Д.Н., Чуланов В.П. A novel CRISPR/Cas9‐based approach to transient activation of intracellular host restriction factors results in strong suppression of hepatitis B virus and degradation of cccDNA Journal of Viral Hepatitis, Volume25, IssueS2 (год публикации - 2018)
10.1111/jvh.20_12922

5. Анастасия Костютшева, Сергей Брезгин, Екатерина Баюрова, Илья Гордейчук, Мария Исагулянц, Ирина Гоптарь, Феликс Урусов, Анастасия Никифорова, Елена Волчкова, Дмитрий Костюшев и Владимир Чуланов ATM and ATR Expression Potentiates HBV Replication and Contributes to Reactivation of HBV Infection upon DNA Damage Viruses, Viruses 2019, 11(11), 997 (год публикации - 2019)
10.3390/v11110997

6. Сергей Брезгин, Анастасия Костюшева, Екатериина Баюрова, Илья Гордейчук, Мария Исагулянц, Ирина Гоптарь, Анастасия Никифорова, Валерий Смирнов, Елена Волчкова, Дитер Глебе, Дмитрий Костюшев и Владимир Чуланов Replenishment of Hepatitis B Virus cccDNA Pool Is Restricted by Baseline Expression of Host Restriction Factors In Vitro Microorganisms (год публикации - 2019)
10.3390/microorganisms7110533

7. С. А. Брезгин, А. П. Костюшева, В. Н. Симирский, Е. В. Волчкова, Д. С. Чистяков, Д. С. Костюшев, В. П. Чуланов Подавление цикла вируса гепатита в под действием нуклеолитических систем CRISPR/Cas9 и белка HBx Инфекция и Иммунитет, Т. 9, № 3–4, с. 476–484 (год публикации - 2019)
10.15789/2220-7619-2019-3-4-476-484

8. Костюшев Д.С., Брезгин С.А., Зуева А.П., Липатников А.Д., Симирский В.Н., Мамонова Н.А., Волчкова Е.В., Малеев В.В., Чуланов В.П. Усиление образования фокусов фосфорилированного пистона Н2АХ в ядрах клеток при инфекции вирусами гепатита В и D Вопросы Вирусологии (год публикации - 2017)

9. Костюшев Д.С., Зуева А.П., Брезгин С.А., Липатников А.Д., Волчкова Е.В., Малеев В.В., Чуланов В.П. Роль ДНК-метилтрансфераз в жизненном цикле вируса гепатита В и патогенезе хронического гепатита В Вопросы Вирусологии (год публикации - 2017)

10. Костюшев Д., Костюшева А., Брезгин С., Зарифьян Д., Уткина А., Гоптарь И., Чуланов В. Suppressing the NHEJ pathway by DNA-PKcs inhibitor NU7026 prevents degradation of HBV cccDNA cleaved by CRISPR/Cas9. Scientific Reports, Feb 12;9(1):1847. doi: 10.1038/s41598-019-38526-6. (год публикации - 2019)
10.1038/s41598-019-38526-6.

11. В.П. Чуланов, А.П. Зуева, Д.С. Костюшев, С.А. Брезгин, Е.В. Волчкова, В.В. Малеев Гепатит С стал излечим. Гепатит В - следующий? Терапевтический Архив (год публикации - 2017)

12. Костюшев Д.С., Зуева А.П., Брезгин С.А., Липатников А.Д., Симирский В.Н., Глебе Д., Волчкова Е.В., Шипулин Г.А., Чуланов В.П. Роль гиперэкспрессии ДНК-метилтрансфераз в персистентности пула ккзДНК при хроническом гепатите В Издательство Медиа Сфера, журнал "Терапевтический Архив" (год публикации - 2016)

13. Костюшев Д., Брезгин С., Костюшева А., Зарифьян Д., Гоптарь И., Чуланов В. Orthologous CRISPR/Cas9 systems for specific and efficient degradation of covalently closed circular DNA of hepatitis B virus Cellular and Molecular Life Sciences, 2019 Jan 23. doi: 10.1007/s00018-019-03021-8. [Epub ahead of print] (год публикации - 2019)
10.1007/s00018-019-03021-8

Публикации