Роль каспазы-2 и ее пост-трансляционных модификаций в регуляции гибели раковых клеток, индуцируемой химиотерапевтическими препаратами

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 17-75-20102

НазваниеРоль каспазы-2 и ее пост-трансляционных модификаций в регуляции гибели раковых клеток, индуцируемой химиотерапевтическими препаратами

Руководитель Копеина Гелина Сергеевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №24 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые слова Рак, апоптоз, каспаза, высокомолекулярный комплекс, пост-трансляционная модификация, фосфорилирование, убиквитинилирование.

Код ГРНТИ34.15.51

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на изучение роли пост-трансляционных модификаций (ПТМ) в регуляции функций и активности каспазы-2, инициирующей апоптотическую гибель раковых клеток в ответ на различные индукторы и в первую очередь на ДНК-повреждающие химиотерапевтические препараты. В рамках проекта планируется с помощью протеомного, биоинформатического и биохимических анализов идентифицировать ПТМ каспазы-2 в раковых клетках и оценить их влияние на процесс апоптоза. Изучение механизмов ПГК является одним из наиболее быстро развивающихся областей биомедицинских исследований. В настоящее время ясно, что не только апоптоз, но и другие виды клеточной гибели, например, такие как некроптоз и аутофагия, участвуют в регуляции тканевого гомеостаза, а нарушения их механизмов приводят к развитию многих патологических состояний. Успехи в данной области знаний были отмечены присуждением 2х Нобелевских Премий (2002 и 2016). Установлено, что некоторые неврологические (болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона) и иммунологические (СПИД) заболевания, связаны с избыточной клеточной гибелью, а такое заболевание как рак - с ее недостатком. Известно также, что нарушение функционирования механизмов гибели клеток связано с устойчивостью патологических клеток к терапии. Хотя многие молекулярные механизмы определенных видов клеточной гибели известны, их контроль за счет пост-трансляционных модификаций, как фундаментального механизма регуляции активности жизненно-важных молекулярных путей, остается слабо изученным. Кроме того, разработка ингибиторов тирозинкиназ, осуществляющих пост-трансляционное фосфорилирование белков, ответственных за рост, деление и устойчивость раковых клеток к апоптозу, как противораковых препаратов, началась более 20 лет назад, однако остается открытым вопрос о точных молекулярных механизмах влияния этих препаратов на процессы клеточной гибели. Поиск новых путей контроля и регулирования гибели клеток за счет механизмов ПТМ каспаз – необходимый этап разработки нового класса лекарств, способных как стимулировать апотоз при лечении рака, так и ингибировать его для лечения нейро-дегенеративных заболеваний. ПТМ играют существенную роль при активации и в регуляции активности каспаз, контролируя не только их про-, но и неапоптотические функции. Проведенное нами исследование (Zamaraev et al., 2017) показало, что в качестве основных ПТМ каспаз можно выделить фосфорилирование остатков серина, треонина или тирозина и присоединение убиквитина и его цепей к остаткам лизина – моно- и полиубиквитинилирование. Убиквитинилировние может способствовать как активации каспаз, так и опосредовать их деградацию в зависимости от типа модификации. Фосфорилирование же в большинстве случаев приводит к блокированию активации или ферментативной активности каспаз. Например, при митозе киназа Cdk1-CyclinB1 ингибирует активность инициаторных каспаз-8 и -9 для успешного прохождения клеточного цикла и избегания случайной гибели при делении. Более того, проведенный нами биоинформатический анализ показал, что некоторые сайты фосфорилирования каспаз эволюционно консервативны как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных. Также нами продемонстрировано, что наибольшее количество механизмов регуляции программируемой гибели за счет ПТМ описано для инициаторных каспаз-8 и -9, однако для инициаторной каспазы-2 в литературе описано только 3 случая фосфорилирования, причем один из них не подтвержден для человека (Рис.1). Каспаза-2 является одним из самых консервативных белков семейства цистеиновых протеаз, из которого только она обладает сигналом ядерной локализации. Этот фермент участвует в индукции и усилении апоптотического ответа при повреждении ДНК, например, после обработки химиотерапевтическими агентами, или индукторами, вызывающими стресс эндоплазматического ретикулума. Кроме того, каспаза-2 обладает онкосупрессорными функциями, участвует в поддержании генетической стабильности и регуляции клеточного цикла, толерантности к окислительному стрессу. Также было показано, что каспаза-2 может активироваться при заражении некоторыми микроорганизмами и участвовать в воспалительном ответе. В настоящее время исследование функций каспазы-2 и путей их регулирования является одной из «горячих точек» в изучении механизмов регуляции гибели клеток. Исследование ПТМ каспазы-2 в раковых клетках позволит установить механизм активации этого фермента, как один из механизмов регуляции апоптоза, а также даст новую информацию об его участии в процессах контролирования клеточного цикла, репарации и/или репликации ДНК. Настоящее исследование будет включать несколько этапов. В недавно (2016 г) проведенном нами масс-спектрометрическом анализе интерактомы каспазы-2 при индукции повреждений ДНК были обнаружены киназы, фосфатазы и белки, регулирующие клеточный цикл (белок 14-3-3, CaMKII, фосфатаза P1), а также Е3 убиквитин-лигазы. Регуляция каспазы-2 за счет ПТМ для некоторых из этих белков в литературе показана, однако роль большинства белков остается невыясненной. Для дальнейшего поиска белков, участвующих в регуляции ПТМ каспазы-2, предполагается выделить высокомолекулярный комплекс активации каспазы-2, формирующийся в раковых клетках в ответ на повреждение ДНК. Далее будут проведены масс-спектрометрический и протеомный анализы полученных образцов с целью идентификации белков, способных регулировать формирование этого комплекса за счет ПТМ. На следующем этапе будет проведено сравнение белков, идентифицированных в данном анализе, с выявленными ранее потенциальными партнерами с целью обнаружения общих кандидатов. Соответственно, дальнейшее исследование предполагает экспериментальную проверку идентифицированных кандидатов с применением методов иммунопреципитации, аффинного выделения, гель-фильтрации и метода siRNA. Для обнаружения сайтов фосфорилирования на втором этапе будет проведен биоинформатический анализ сайтов ПТМ каспазы-2 с целью выявления наиболее консервативных остатков среди различных организмов. Сравнение эволюционно-консервативных остатков в последовательности каспазы-2 и других каспаз даст информацию о предпочтительном с точки зрения эволюции расположении сайтов фосфорилирования в третичной структуре каспаз. Данный анализ может выявить потенциальные сайты фосфорилирования, еще не описанные в литературе. В качестве дополнительного подтверждения будет проведен биоинформатический анализ последовательности каспазы-2 с использованием алгоритмов и баз данных, предназначенных для предсказания ПТМ (NetPhos, PhosphoSite, Disphos, NetPhorest и т.д.). Сравнительный анализ полученных с помощью этих двух подходов сайтов ПТМ далее будет использован с целью нахождения общих сайтов. На следующем этапе предполагается экспериментальная проверка предсказанных участков фосфорилирования с использованием генетических конструктов, содержащих последовательности дикого или мутантных вариантов гена каспазы-2. Будет проведено сравнение способности этих мутированных вариантов каспазы-2 расщеплять специфические и эндогенные субстраты, а также влиять на развитие апоптоза в ответ на повреждение ДНК в раковых клетках. Для этих экспериментов будут использованы созданные нами с помощью системы CRISPR/Cas9 линии раковых клеток дефицитных по каспазе-2. Данный анализ предполагается проводить с помощью современных методов исследования клеточной гибели и ее молекулярных путей, таких как масс-спектрометрия, разные виды проточной цитометрии, иммуноблотинг, измерение активности каспаз и конфокальная флуоресцентная микроскопия. В литературе не встречаются данные, подтверждающие факт убиквитинилирования каспазы-2. Однако для других каспаз описаны механизмы регуляции их функции за счет данного вида ПТМ. Таким образом, одной из целей настоящего исследования является анализ убиквитинилирования каспазы-2. Для этого будет проведена иммунопреципитация каспазы-2 из раковых клеток в оптимизированных условиях с последующим иммуноблотингом полученных образцов и окраской антителами как к общему убиквитину, так и специфических антител к различным цепям полиубиквитина. Такой анализ выявит, в первую очередь, происходит ли убиквитинилирование каспазы-2 в раковых клетках. В ходе дальнейшего исследования будет выявлено, меняется ли степень и характер убиквитинилирования каспазы-2 при повреждениях ДНК химиотерапевтическими агентами, что позволит сделать вывод о регуляции активации и уровня каспазы-2 за счет этого вида ПТМ. Помимо этого, поскольку в проведенном в 2016 году масс-спектрометрическом анализе была выявлена Е3 убиквитин-лигаза (ТРИМ21), то будет проанализировано возможное взаимодействие данного фермента с каспазой-2 и его влияние на ее работу. Также, используя разработанный нами метод выделения ядер апоптотических клеток, будет проводиться оценка убиквитинилирования каспазы-2 я ядре. Такой анализ позволит выявить характер убиквитинилирования каспазы-2 в ядре (моно-, поли-, тип цепей), что даст ключ к пониманию ее роли в ядре в необработанных и подвергшихся генотоксическому стрессу раковых клетках. Таким образом, проект предполагает детальное исследование ПТМ каспазы-2 и их влияние на ее функции и активность после воздействия ДНК-повреждающих препаратов, используемых в терапии опухолей. Полученные знания в первую очередь будут использованы для оценки, каким образом нарушения механизмов ПТМ каспаз влияют на процессы, отвечающие за выживание/гибель здоровых и патологических клеток, а также каким образом возможно преодолеть устойчивость патологических клеток к терапии.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Прохорова Е.А., Копеина Г.С., Лаврик И.Н., Животовский Б. Apoptosis regulation by subcellular relocation of caspases Scientific Reports, 15;8(1):12199. (год публикации - 2018)
10.1038/s41598-018-30652-x.

2. Сенечкин В.В., Стрелецкая А.Ю., Животовский Б.Д. и Копеина Г.С. Molecular Comprehension of Mcl-1: From Gene Structure to Cancer Therapy Trends in Cell Biology (год публикации - 2019)
10.1016/j.tcb.2019.03.004

3. А. В. Замараев, А.Ю. Егоршина, И. Н. Лаврик, Б. Д. Животовский, Г. С. Копеина Выделение высокомолекулярных комплексов активации инициаторных каспаз при повреждениях ДНК Клеточные технологии в биологии и медицине (год публикации - 2019)

4. Г. С. Копеина, А. В. Замараев, Е. Прохорова, А.Ю. Егоршина, И. Н. Лаврик, Б. Д. Животовский, The role of caspase-2 in the regulation of apoptosis, necroptosis and mitotic catastrophe upon genotoxic stress in ovarian carcinoma cells CELL DEATH DISCOVERY, V 5, 47 (год публикации - 2019)

5. Базанов Д.Р., Первушин Н.В., Савитская В.Ю., Аникина М.В., Проскуминаь М.В., Лозинская Н.А, Копеина Г.С. 2,4,5-Tris(alkoxyaryl)imidazoline derivatives as potent scaffold for novel p53-MDM2 interaction inhibitors: Design, synthesis, and biological evaluation Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, том 29, № 16, с. 2364-2368 (год публикации - 2019)
10.1016/j.bmcl.2019.06.007

6. Сенечкин В.В., Стрелецкая А.Ю., Горбунова А.С., Животовский Б.Д., Копеина Г.С. Saga of Mcl-1: regulation from transcription to degradation Cell Death & Differentiation, 27, pages 405–419 (год публикации - 2020)
10.1038/s41418-019-0486-3

7. А. Ю. Егоршина, А. В. Замараев, И. Н. Лаврик, Б. Д. Животовский, Г. С. Копеина. КАСПАЗА-2 – ОНКОСУПРЕССОР И РЕГУЛЯТОР МЕТАБОЛИЗМА: ЧТО ДЕНЬ ГРЯДУЩИЙ НАМ ГОТОВИТ? Молекулярная Биология (год публикации - 2018)

8. Копеина Г.С., Прохорова Е.А., Лаврик И.Н., Животовский Б.Д. Alterations in the nucleocytoplasmic transport in apoptosis: Caspases lead the way Cell Proliferation, Oct;51(5):e12467. Epub 2018 Jun 26. (год публикации - 2018)
10.1111/cpr.12467

9. Копеина Г.С., Замараев А.В., Животовский Б.Д., Лаврик И.Н. Каспаза-2 как инициаторный белок апоптоза в клетках карциномы яичника в ответ на повреждения ДНК Гены и Клетки, Том XII, № 3, 2017, c. 127 (год публикации - 2017)

Публикации