Молекулярные и клеточные эффекты ультракороткого импульсного излучения

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 19-14-00151

НазваниеМолекулярные и клеточные эффекты ультракороткого импульсного излучения

Руководитель Осипов Андреян Николаевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №35 - Конкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-211 - Радиобиология

Ключевые слова линейный ускоритель с лазерным фотокатодом, ультракороткие электронные импульсы, фемтосекундные лазерные импульсы, двунитевые разрывы ДНК, репарация ДНК, клеточный цикл, пролиферация, клеточная гибель, клетки человека, сигнальные пути, анализ транскриптомных данных

Код ГРНТИ34.49.19

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В последние годы стремительными темпами разрабатываются ускорители нового поколения, принцип действия которых основан на ускорении заряженных частиц электромагнитной волной, создаваемой импульсным лазерным изучением. Предполагается, что ускорители этого типа могут сделать революцию в радиационной терапии опухолей. Помимо существенно меньших размеров и стоимости, несомненным преимуществом лазерных ускорителей является возможность создания направленных ультракоротких (фемто- и пикосекундных) моноэнергетических пучков ускоренных частиц с минимальным боковым рассеиванием. Это дает возможность ювелирно-дозированного локального воздействия на солидные опухоли с минимальным облучением нормальных тканей. При этом конструкторские разработки в этой области намного опережают радиобиологические исследования. Существуют лишь единичные публикации о биологических эффектах, индуцированных воздействием ультракоротких импульсов электронных пучков. Исследования особенностей формирования этих эффектов лишь начинаются, фактически речь идет о новом направлении в радиационной биологии и медицине. В тоже время фемтосекундное лазерное излучение в ближнем инфракрасном диапазоне (800-1100 нм) широко используется в биологических исследованиях, в том числе в качестве сверхточного «скальпеля» для осуществления микрохирургических воздействий. В основе такого применения лежат принципы нелинейного поглощения лазерных импульсов с высокой пиковой мощностью и последующего создания в области поглощения плазмы низкой плотности. Воздействие этой плазмы на биологический материал также может приводить к возникновению желательных радиобиологических эффектов. Поскольку длительность облучения (и в случае ускоренных электронов, и в случае лазерных импульсов) короче времени протекания многих химических реакций в облученных клетках, можно предположить возникновение иных/новых радиационных процессов, которые могут повлиять на радиобиологическую эффективность облучения. Целью настоящего проекта является изучение особенностей формирования молекулярных и клеточных радиобиологических эффектов при облучении нормальных и опухолевых клеток человека пикосекундными импульсами пучков ускоренных электронов и лазерными импульсами фемтосекундной длительности. Такой комплексный подход преследует две основных задачи: 1) оба вида воздействия вызывают биологические эффекты за счёт ионизации биологического материала, совместное рассмотрение этих эффектов позволит получить информацию о механизмах воздействия как импульсов ускоренных электронов, так и фемтосекундных лазерных импульсов; 2) применяя стандартизованные методы исследования биологических эффектов, вызываемых этими методами воздействия, удастся развить подходы терапии для обоих видов облучения одновременно. Для импульсного облучения будет использоваться лазерный ускоритель электронов AREAL (Advanced Research Electron Accelerator Laboratory, Армения) и комплекс фемтосекундной лазерной нанохирургии, разработанный в лаборатории био- и нанофотоники ИХФ РАН. В качестве референтного источника электронного излучения будет использоваться линейный ускоритель электронов Varian Trilogy (Varian Medical Systems, США). Исследования будут проводиться на первичных культурах нормальных клеток (фибробласты кожи) и перевиваемых культурах опухолевых клеток (SK-MEL-2,MCF7, A549). В ходе выполнения проекта планируется исследовать: 1) индукцию и репарацию повреждений ДНК; 2) задержку клеточного цикла и пролиферативную активность; 3) клеточную гибель. При изучении особенностей индукции и репарации ДНК особый акцент будет сделан на изучении критических радиационно-индуцированных повреждений ДНК - двунитевых разрывов (ДР). Считается, что именно ДР ДНК являются основным триггером запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения. Репарация ДР ДНК происходит довольно медленно, в то время как ДР, не устраненные в ходе репарации ДНК, приводят к серьезным цитогенетическим нарушениям, гибели клеток, инактивации генов супрессоров опухолей или активации онкогенов. Для изучения механизмов репарации, количества и характера распределения ДР в клеточном ядре будет использоваться иммуноцитохимический анализ белков, участвующих в процессах репарации ДР ДНК. Во время распознавания и репарации двунитевых разрывов (ДР) ДНК происходит образование динамических микроструктур, получивших название foci и содержащих от сотен до тысяч копий различных белков, задействованных в этих процессах (гамма-Н2АХ, фосфо-АТМ, 53BP1, RAD51 и др.). Количественный анализ фокусов белков репарации ДНК и их локализации/солокализации в пострадиационный период позволяет дать ответ не только о количестве ДР и их пространственном распределении в клеточном ядре, но и эффективности и механизмах их репарации. В зависимости от количества повреждений и эффективности репарации ДНК в клетках может запускаться арест клеточного цикла, вплоть до полного ингибирования пролиферации. Поэтому для оценки радиобиологических эффектов чрезвычайно важно оценивать продолжительность клеточного цикла и пролиферативную активность клеток. Для этого в ходе настоящего проекта будет использоваться иммуноцитохимический анализ соотношения клеток позитивных по белкам маркерам клеточной пролиферации (Ki-67) и фазам клеточного цикла (Cyclin-A, CENPF и т.д.), а также проточно-цитометрический анализ клеточного цикла. И наконец, для оценки интегральных клеточных эффектов будет оцениваться доля репродуктивно погибших клеток (клоногенный анализ) и соотношение клеток, гибнущих по механизмам апоптоза и аутофагии. Клоногенный анализ являются «золотым стандартом» для оценки радиобиологических эффектов. Именно потеря репродуктивной способности является наиболее общей характеристикой клеточной популяции. Так, клетка, сохраняющая способность к биосинтезу белков и ДНК, а также способная митотически поделиться один или два раза, но не образующая большого числа потомков, считается погибшей в качестве репродуктивной единицы в популяции клеток. Для оценки общей биологической эффективности (ОБЭ) ультракоротких импульсов пучков ускоренных электронов будет проведено сравнение с эффектами референтного излучения. Для понимания молекулярных механизмов действия ультракоротких импульсов пучков ускоренных электронов по сравнению с другими режимами облучения клеток человека будут использованы подходы массового транскриптомного анализа клеточных образцов на основе технологии полногеномного секвенирования. Сравнительный анализ транскриптомов облученных образцов с транскриптомами необлученных контролей будет проводиться при помощи одного из наиболее совершенных алгоритмов анализа сигнальных путей iPANDA (insilico Pathway Activation Network Decomposition Analysis), авторы которого являются участниками проекта (Ozerov et al., Nature Commun., 2016). Используя данный метод, будут определены наиболее значимые сигнальные пути, определяющие клеточный ответ на воздействие ультракоротких импульсов ускоренных электронов. Особое внимание будет уделено анализу сравнительной активации сигнальных каскадов, ассоциированных с репарацией ДНК, пролиферативной активностью и клеточной гибелью.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Бабаян Н.С., Григорян Б., Хондкарян Л., Тадевосян Г., Саркисян Н., Григорян Р., Апресян Л., Арутюнян Р.М., Воробьева Н.Ю., Пустовалова М.В., Грехова А.К., Осипов А.Н. Laser-Driven Ultrashort Pulsed Electron Beam Radiation at Doses of 0.5 and 1.0 Gy Induces Apoptosis in Human Fibroblasts International Journal of Molecular Sciences, V. 20. No. 20. pii: E5140. (год публикации - 2019)
10.3390/ijms20205140

2. Ованнисян Г., Арутюнян Т., Арутюнян Р., Лиер Т. DNA Copy Number Variations as Markers of Mutagenic Impact International Journal of Molecular Sciences, V. 20. No. 19, pii 4723 (год публикации - 2019)
10.3390/ijms20194723

3. Бабаян Н.С., Воробьева Н.Ю., Григорян Б.А., Грехова А.К., Пустовалова М.В., Роднева С.М., Федотов Ю.А., Цаканова Г.В., Арутюнян P.M., Осипов А.Н. Low Repair Capacity of DNA Double-Strand Breaks Induced by Laser-Driven Ultrashort Electron Beams in Cancer Cells International Journal of Molecular Sciences, V. 21, №24, pii 9488 (год публикации - 2020)
10.3390/ijms21249488

4. Залесский А.Д., Федотов Ю.А., Яшкина Е.И., Надточенко В.А., Осипов А.Н. Immunocytochemical Localization of XRCC1 and γH2AX Foci Induced by Tightly Focused Femtosecond Laser Radiation in Cultured Human Cells Molecules, V. 26, No. 13, pii 4027 (год публикации - 2021)
10.3390/molecules26134027

5. Цаканова Г., Бабаян Н., Каралова Э., Акопян Л., Аброян Л., Аветисян А., Авагян Х., Акопян С., Погосян А., Багдасарян Б., Аракелова Э., Айвазян В., Матевосян Л. ., Навасардян А., Давтян Г., Апресян Л., Еремян А., Арутюнян Р., Осипов А.Н. Low-Energy Laser-Driven Ultrashort Pulsed Electron Beam Irradiation-Induced Immune Response in Rats International Journal of Molecular Sciences, V. 22, No 21, pii 11525 (год публикации - 2021)
10.3390/ijms222111525

6. Бабаян Н.С., Гурьев Д.В., Воробьева Н.Ю., Григорян Б.А., Тадевосян Г.Л., Апресян Л.С., Чигасова А.К., Яшкина Е.И., Роднева С.М., Цишнатти А.А., Федотов Ю.А., Саркисян Н.К., Манукян А.Т., Арутюнян Р.М., Осипов А.Н. Colony-Forming Ability and Residual Foci of DNA Repair Proteins in Human Lung Fibroblasts Irradiated with Subpicosecond Beams of Accelerated Electrons Bulletin of Experimental Biology and Medicine, V. 172, No. 1, P. 22-25. (год публикации - 2021)
10.1007/s10517-021-05323-z

7. Воробьева Н.Ю., Бабаян Н.С., Григорян Б.А., Саргсян А.А., Хондкарян Л.Г., Апресян Л.С., Чигасова А.К., Яшкина Е.И., Гурьев Д.В., Роднева С.М., Цишнатти А.А., Федотов Ю.А., Арутюнян Р.М., Осипов А.Н. Повышенный выход остаточных фокусов γН2АХ в р53-дефицитных клетках рака легкого человека, облученных субпикосекундными пучками ускоренных электронов Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (год публикации - 2021)

8. Осипов А.Н., Клоков Д.Ю. Dose-rate effect in radiation biology: DNA double-strand breaks repair efficiency Meeting in Nor Amberd: Fifth International Conference, Dedicated to N. W. Timofeeff-Ressovsky and His Scientific School “Modern Problems of Genetics, Radiobiology, Radioecology, and Evolution”, Nor Amberd, Armenia, 5–10 Oct. 2021 — Dubna: JINR, P. 71 (год публикации - 2021)

9. Осипов А.Н., Бабаян Н., Воробьева Н., Григорян Б., Чигасова-Грехова А., Пустовалова М., Роднева С., Федотов Ю., Цаканова Г., Арутюнян Р. DNA double-strand break repair efficiency in cancer cells exposed to laser-driven ultrashort electron beams Book of abstracts: Ninth international conference on radiation in various fields of research (RAD 2021) 14–18.06.2021. Herceg Novi, Montenegro, P. 235 (год публикации - 2021)
10.21175/rad.abstr.book.2021.32.13

10. Федотов Ю.А., Залесский А.Д., Яшкина Е.И., Зрилова Ю.А., Осипов А.Н. Направленное фемтосекундное лазерное излучение индуцирует двунитевые разрывы ДНК в опухолевых клетках человека Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (год публикации - 2021)

Публикации