Новые перспективы терапии глиомы: анализ иммуногенных механизмов ферроптоза

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00376

НазваниеНовые перспективы терапии глиомы: анализ иммуногенных механизмов ферроптоза

Руководитель Мищенко Татьяна Александровна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" , Нижегородская обл

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-108 - Иммунология

Ключевые слова ферроптоз, иммуногенная клеточная смерть, иммуногенность, DAMPs, противоопухолевая профилактическая вакцинация, противоопухолевая терапия

Код ГРНТИ76.03.55

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Мультиформная глиобластома (ГБМ, класс IV согласно классификации Всемирной организации здравоохранения) является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью центральной нервной системы с частотой 0.59-3.69 на 100 000 населения. Помимо высокой встречаемости, ГБМ считается наиболее агрессивным типом глиальных опухолей (Wen P. et al. N Engl J Med. 2008; Pearson J. et al. Signal Transduct Target Ther. 2017). При существующей схеме лечения, которая включает хирургическую резекцию опухоли, химиотерапию с использованием темозоломида, лучевую терапию, медиана общей выживаемости не превышает 14.6- 20.9 месяцев (Erhart F. et al. NPG Vaccines. 2020). В связи с низкой эффективностью применяемых методов лечения ГБМ, сохраняется острая необходимость в разработке прорывных терапевтических подходов, позволяющих достичь максимального уничтожения опухоли и нивелировать риск образования вторичных опухолей и метастазов. Особый интерес в рамках данной проблематики представляет иммунотерапевтический подход, который рассматривается в качестве независимой противоопухолевой стратегии, стоящей наравне с хирургической резекцией, радио- и химиотерапией (Goldberg M.S. et al. Nat Rev Cancer. 2019). К настоящему времени для ГБМ было апробировано несколько методов иммунотерапии (напр-р, использование ингибиторов контрольных точек, вирусная терапия), однако пока ни один из них не привел к прорывным результатам в клинике (Berghoff A. et al. Nat Rev Neurol. 2019). Одним из интенсивно развивающихся направлений иммунотерапии ГБМ является разработка вакцин на основе дендритных клеток (ДК) (Mastelic-Gavillet B. et a. Front Immunol. 2020), действие которых направлено на стимуляцию цитотоксических CD8+ Т-клеток, выполняющих функцию распознавания и уничтожения опухолевых клеток. Для активации ДК в отношении ГБМ известно применение специфических антигенных пептидов/РНК, либо самих клеток глиомы, погибших по пути случайного некроза вследствие нескольких циклов замораживания/оттаивания (Garg A. et al. Trends Immunol. 2017). Однако, оба подхода демонстрируют низкую эффективность. Если при применении специфических антигенных пептидов/РНК это связано с высокой антигенной гетерогенностью ГБМ, то второй подход обладает низким иммуногенным потенциалом. Поэтому, для создания анти-ГБМ вакцин нового поколения перспективным видится возможность повышения иммуногенности умирающих/мертвых клеток глиомы, используемых для активации ДК, а также стимуляции Тh1-опосредованного иммунитета. Исследования последних лет убедительно доказывают, что проявление иммуногенности умирающими опухолевыми клетками является одним из наиболее критических факторов, определяющих эффективность противораковой терапии. Индукция иммуногенной гибели клеток приводит к мобилизации молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (англ. damage-associated molecular patterns, DAMPs), выступающих в роли сигналов опасности и адъювантов для активации иммунной системы. Выброс DAMPs из умирающих опухолевых клеток облегчает проникновение антиген-презентирующих клеток (например, ДК) в ложе опухоли и способствует дальнейшей перекрестной презентации антигена главным комплексом гистосовместимости класса I клеткам адаптивной иммунной системы (CD8+T-клетки), мишенями для которых служат опухолевые клетки, не удаленные после проведения других методов терапии (Kepp O. et al. Cancer Metastasis Rev. 2011, Krysko D.V. et al. Nat Rev Cancer. 2012, Galluzzi L. et al. J ImmunoTher Cancer. 2020). К настоящему времени известно нескольких видов клеточной смерти с доказанным иммуногенными свойствами (апоптоз, некроптоз), однако для многих видов рака, в том числе и для ГБМ, сохраняется риск развития резистентности, что определяет уход опухолевых клеток из-под иммунологического контроля и устойчивость к терапии. Именно поэтому продолжается поиск альтернативных форм клеточной смерти, обладающих иммуногенными свойствами, посредством индукции которых можно добиться эффективного уничтожения опухоли. Ферроптоз - железо-зависимая форма регулируемого некроза, является недавно признанным типом клеточной смерти, который может играть существенную роль в биологии рака (Dixon S.J. et al. Cell. 2012, Angeli J.P.F. et al. Trends Pharmacol Sci. 2017). В недавнем исследовании было продемонстрировано, что вакцинация опухолевыми клетками, находящимися на ранних стадиях ферроптоза, способствует эффективной индукции специфического противоопухолевого иммунитета, что указывает на выраженный иммуногенный потенциал ферроптотических раковых клеток (Efimova I. et al. J Immunother Cancer. 2020). Эти результаты открывают многообещающие перспективы в разработке новых противоопухолевых стратегий, основанных на индукции ферроптоза, и тем самым позволят расширить современную концепцию иммуногенной клеточной смерти и возможности иммунотерапии рака, в том числе в отношении ГБМ. В данном проекте предлагается оценить иммуномодулирующую роль клеток глиомы, погибающих по пути ферроптоза, раскрыть роль ряда ключевых DAMPs (кальретикулин, HMGB1) в реализации иммуногенных свойств ферроптотических клеток глиомы и оценить эффективность профилактических и терапевтических ДК вакцин, загруженных ферроптотическими клетками глиомы, в экспериментальных ортотопических мышиных моделях глиомы (Рис. 1).

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Савюк М.О., Турубанова В.Д., Мищенко Т.А., Ефимова Ю., Слепцова Е.Е., Редькин Т.С., Горшкова Е.Н., Ведунова М.В., Крысько Д.В., Крысько О.А. Analysis of the DAMPs release from ferroptotic glioma cells Fbstact book of BACR Annual meeting 2022: Tumour plasticity and heterogeneity during cancer progression, P. 1 (год публикации - 2022)

2. Турубанова В.Д., Савюк М.О., Слепцова Е.Е., Редькин Т.С., Ведунова М.В., Крысько Д.В. Анализ иммуногенного потенциала ферроптотически-индуцируемой клеточной гибели глиомы с использованием RSL3. IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков — 2022: Cборник тезисов, АНО «Иннов. центр Кольцово». — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2022. С. 681 (год публикации - 2022)

3. Мищенко Т.А., Балалаева И.В., Турубанова В.Д., Савюк М.О., Шилягина Н.Ю., Крысько О., Ведунова М.В., Крысько Д.В. Gold standard assessment of immunogenic cell death induced by photodynamic therapy: From in vitro to tumor mouse models and anti-cancer vaccination strategies Methods in Cell Biology, Academic Press, Амстердам, P. 1-62 (год публикации - 2023)
10.1016/bs.mcb.2023.05.003

4. Перенков А.Д., Сергеева А.Д., Ведунова М.В., Крысько Д.В. In Vitro Transcribed RNA-Based Platform Vaccines: Past, Present, and Future Vaccines, 11(10), 1600 (год публикации - 2023)
10.3390/vaccines11101600

5. Мищенко Т.А.,Турубанова В.Д., Горшкова Е.Н., Крысько О., Ведунова М.В., Крысько Д.В. Targeting immunogenic cell death for glioma immunotherapy Trends in Cancer, S2405-8033(23)00216-9 (год публикации - 2023)
10.1016/j.trecan.2023.10.005

6. Мищенко Т.А., Турубанова В.Д., Горшкова Е.Н., Крысько О., Ведунова М.В., Крысько Д.В. Glioma: Bridging the Tumor Microenvironment, Patient Immune Profiles for Novel Personalized Immunotherapy Frontiers in Immunology (год публикации - 2023)

7. Крысько Д.В., Демьюнк Р., Ефимова Ю.,Нэссенс Ф., Крысько О.А., Катанзаро Е. In Vitro Veritas: From 2D Cultures to Organ-on-a-Chip Models to Study Immunogenic Cell Death in the Tumor Microenvironment Cells, 11(22), 3705 (год публикации - 2022)
10.3390/cells11223705

8. Крысько Д.В., Балалаева И.В., Мищенко Т.А. Photodynamic Therapy in Cancer: Principles, State of the Art, and Future Directions Pharmaceutics, 16, 1564 (год публикации - 2024)
10.3390/pharmaceutics16121564

9. Мищенко Т.А., Гурьев Е.Л., Балалаева И.В., Крысько Д.В., Ведунова М.В. Получение стабильной клеточной линии глиомы мыши с нокаутом гена кальретикулина Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 15–19 апреля 2024 г.). , Университет Лобачевского. 2024. 425 с. (год публикации - 2024)

10. Мищенко Т.А., Клименко М.О., Гурьев Е.Л., Савельев А.Г., Крысько Д.В., Гудков С.В., Хайдуков Е.В., Звягин А.В., Ведунова М.В. Enhancing glioma treatment with 3D scaffolds laden with upconversion nanoparticles and temozolomide in orthotopic mouse model Frontiers in chemistry, 12:1445664 (год публикации - 2024)
10.3389/fchem.2024.1445664

11. Савюк М.О., Турубанова В.Д., Ефимова Ю.В., Мищенко Т.А., Ведунова М.В., Крысько Д.В. Иммуногенный ферроптоз защищает от развития опухолевого роста Гены и клетки, Том 18, № 4, С. 550-553 (год публикации - 2023)
10.17816/gc623271

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Мультиформная глиобластома (ГБМ) является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью центральной нервной системы. В связи с низкой эффективностью ныне существующих методов лечения ГБМ сохраняется острая необходимость в разработке прорывных терапевтических подходов, позволяющих достичь максимального уничтожения опухоли и нивелировать риск образования вторичных опухолей и метастазов. Особый интерес представляет иммунотерапевтический подход, который рассматривается в качестве независимой противоопухолевой стратегии, стоящей наравне с хирургической резекцией, радио- и химиотерапией. Одним из интенсивно развивающихся направлений иммунотерапии ГБМ является разработка вакцин на основе дендритных клеток (ДК), действие которых направлено на стимуляцию цитотоксических CD8+ Т-клеток, выполняющих функцию распознавания и уничтожения опухолевых клеток. Для активации ДК в отношении ГБМ известно применение специфических антигенных пептидов/РНК, либо самих клеток глиомы, погибших по пути случайного некроза вследствие нескольких циклов замораживания/оттаивания, однако пока ни один из них не привел к прорывным результатам в клинике. Проект направлен на изучение роли молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPs) в проявлении иммуногенности клеток глиомы, погибающих по пути регулируемой клеточной смерти, а также исследование эффективности профилактических и терапевтических ДК вакцин, загруженных мертвыми клетками глиомы, в экспериментальной модели опухоли in vivo. На третьем этапе проекта было подтверждено отсутствие экспрессии белка CRT в полученной постоянной клеточной линии GL261-bCRT. Охарактеризован профиль фенотипического созревания дендритных клеток (ДК) в присутствии клеток глиомы GL261-bCRT на поздних (24 ч) стадиях исследуемой регулируемой клеточной смерти и проведено сравнение с профилем ДК в присутствии клеток глиомы исходной линии GL261. Оценена эффективность профилактических ДК вакцин на основе лизатов клеток GL261-bCRT в модели ортотопической глиомы in vivo. Проведена генетическая трансформация клеток глиомы GL261 c целью получения стабильной клеточной линии с нокаутом гена ключевого DAMPs – амфотерина (GL261-bHMGB1). Методом оптического сортинга было получено 26 моноклональных культур GL261-bHMGB1, эффективность которых анализировалась методом ПЦР и секвенированием. Результаты одного из моноклонов позволяли рассчитывать на отсутствие экспрессии полноразмерного белка HMGB1, однако, последующее создание биобанка не представилось возможным вследствие утраты способности клеток к делению и естественной гибели культуры. Оценена эффективность проведения профилактической ДК вакцинации на основе лизатов индуцированных клеток глиомы GL261 в условиях блокады ключевых DAMPs - АТФ, HMGB1 и всех трех DAMPs (АТФ, HMGB1, CRT). Показано, что на эффективность ДК вакцин, основанных на лизатах клеток глиомы, погибающих по пути регулируемой клеточной смерти, можно повлиять, блокируя АТФ и CRT, но не HMGB1, что говорит о важности данных DAMPs в реализации противоопухолевого иммунного ответа. Исследованы особенности гибели культуры клеток глиомы мыши GL261 и первичной культуры клеток глиомы человека при применении индуктора регулируемой клеточной смерти и препарата первой линии химиотерапии темозоломида (TMZ). Показано, что первичные культуры клеток глиомы человека обладают большей резистентностью к действию TMZ по сравнению с клетками постоянной клеточной линии мыши GL261. Применение индуктора регулируемой клеточной смерти приводит к выраженной активации процессов гибели TMZ-индуцированных клеток через 24 ч. При сочетанном применении индуктора и TMZ наибольший вклад в гибель культур GL261 вносит активация механизмов ферроптоза, в первую опосредованных накоплением липидных радикалов, в то время как для первичной культуры клеток глиомы человека показана активация смешанного типа клеточной смерти. В модели ортотопической глиомы in vivo показано, что проведение профилактической иммунотерапии на основе клеток глиомы GL261, погибающих по механизму регулируемой клеточной смерти, повышает эффективность курса химиотерапии TMZ. На заключительном этапе проекта опубликованы результаты комплексной оценки эффективности применения трехмерных конструктов на основе метакрилированной гиалуроновой кислоты в качестве интраоперационной системы доставки темозоломида для терапии глиом в ортотопической модели опухоли in vivo – Mishchenko et al. Front Chem. 2024 (WoS 3.8, Scopus, Q1). Концепция о возможных путях преодоления резистентности клеток глиобластомы к действию темозоломида с помощью применения регулируемых механизмов клеточной смерти, обладающих иммуногенными свойствами, находится на рассмотрении в журнале Trends in Cancer (WoS 18.4, Scopus Q1). Члены научного коллектива проекта (Мищенко Т.А., Крысько Д.В.) выступали в качестве приглашенных редакторов спецвыпуска журнала Pharmaceutics (WoS 5.4, Scopus, Q1), в котором обсудили перспективность применения фотодинамической индукции механизмов регулируемой клеточной смерти для стратегий противоглиомной иммунотерапии. Результаты проекта были освещены на всероссийской и международных конференциях. Доклад Мищенко Т.А. принял участие в конкурсе докладов молодых ученых и был поощрен дипломом за высокий научный уровень исследования и качество владения материалом.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта вносят весомый вклад в развитие как фундаментальной, так и клинической медицины. Уникальные данные о возможности индукции альтернативных апоптозу и некроптозу механизмов гибели клеток глиомы, обладающих иммуногенным потенциалом, значительно расширяют представления об особенностях формирования противоопухолевого иммунного ответа и открывают перспективы развития иммунотерапевтических стратегий, направленных на борьбу с высоко резистентными и агрессивными опухолями головного мозга. В ходе выполнения проекта был создан и экспериментально апробирован дизайн дендритноклеточных вакцин на основе RSL3-индуцированных клеток глиомы, который может быть использован для ускорения трансфера достижений фундаментальных исследований в методы онкотерапии нового поколения. Дальнейшее развитие исследований, полученных в результате выполнения проекта на первичных культурах клеток глиомы человека, о вкладе альтернативной формы иммуногенной регулируемой клеточной смерти в преодолении резистентности к действию химиотерапевтического препарата темозоломида позволит определить пациент-специфичную тактику проведения иммунотерапии для снижения рисков роста и метастазирования злокачественных новообразований головного мозга.