Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект разрабатывает наноматериалы для трансформации стволовых клеток из жировой ткани в клетки в шванно-подобные клетки с целью в дальнейшем создать конструкции для восстановления нервной ткани. Был сравнительный анализ процесса фототермической стимуляции при разной локализации термоплазмонных агентов. Были исследованы различные наночастицы для нагрева внутри клеток и выбраны самые эффективные. В качестве основы для иммобилизации фототермических наночастиц использовались скаффолды, изготовленные из высокоориентированных нейлоновых нановолокон, имитирующих структуру внеклеточного матрикса. Материалы с иммобилизованными термоплазмонными агентами (покрытие PDA) продемонстрировали высокую фотостабильность и биосовместимость без недостатков, связанных с внутриклеточной доставкой наночастиц, таких как цитотоксичность и постепенное выведение из организма. Показано, что температура при внутриклеточной локализациия наночастиц-нанонагревателей варьируется от 5 до 15°C. При использовании фототермических скаффолдов наблюдается более стабильное и управляемое повышение температуры. Локальное выделение тепла от модифицированных нановолокон активирует нейроны и способствует высвобождению кальция в клетках нейробластомы SH-SY5Y. Ультраструктура волокнистого материала направляет рост нейритов и усиливает их удлинение в модельной культуре нейробластомы человека. Фототермическая стимуляция дополнительно усиливает этот процесс, увеличивая долю клеток с более длинными нейритами, что способствует нейрональной дифференциации. Были получены фототермические скаффолды на основе полидофаминовых (PDA) покрытий для изучения их влияния на трансдифференцировку мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в шванно-подобные клетки. Для создания эффективной ультраструктуры скаффолды из ультратонких волокон были модифицированы дофамином и дополнены вторым слоем ультратонких волокон. Полученный материал, обозначенный как PDA-MIX, состоит из субмикронных волокон диаметром около 250 нм и ультратонких волокон диаметром 60 нм. Были протестированы два режима воздействия ближнего инфракрасного (БИК) излучения с длиной волны 808 нм: однократное облучение в течение 7 дней и многократное (трижды) в течение 3 дней с мощностью 3 Вт/см². Оба режима не вызывали гибели клеток, сохраняя их жизнеспособность выше 90%, и не приводили к морфологическим изменениям, указывающим на снижение адгезии или апоптоз. На скаффолдах клетки приобретали вытянутую вдоль волокон форму, что способствует реорганизации цитоскелета и сонаправленности волокнам скаффолда актиновых филаментов. В ходе выполнения проекта показано, что PDA-MIX матриксы способствуют более чем двукратному увеличению экспрессии генов S100b и миелинового нулевого белка (MPZ), маркеров шванновских клеток, по сравнению с контрольными МСК. Это подчеркивает благоприятное воздействие PDA-MIX на культивирование и трансдифференцировку МСК в шванно-подобные клетки. Показано, что фототермическая стимуляция увеличивает секрецию фактора роста нервов (NGF) в трансдифференцированных МСК до уровня, сравнимого с нативными шванновскими клетками, даже при сокращении времени инкубации в среде с херегулином до 5 дней. На подложках PDA-MIX экспрессия белка S100b увеличивалась в 5 раз. При этом облучение с длиной волны 808 нм и мощностью 3 Вт/см² значительно повышало экспрессию S100b и p75, тогда как облучение при 1 Вт/см² не оказывало такого эффекта. Результаты подтверждают, что сокращение времени трансдифференцировки до 5 дней на PDA-MIX подложках не снижает эффективности дифференцировки МСК в шванно-подобные клетки. В проведенном исследовании in vitro и ex vivo оценивалось влияние нанотопологии скаффолдов из высокоориентированных нейлоновых нано- и микроволокон на рост нервной ткани, включая стволовые клетки (ШК) и нейроны ДКГ. Все типы волокнистых материалов способствовали пролиферации, удлинению отростков ШК и образованию структур, подобных тяжам Бюнгнера, что способствует контролю роста аксонов и миелинизации. Также впервые изучено влияние матрицы на старение клеток, показавшее, что на волокнистых материалах доля «стареющих» клеток ниже. Показано, что наибольшая средняя длина аксонов наблюдалась на скаффолде из субмикронных волокон. При этом скаффолд из смешанного материала (ультратонкие 100 нм и субмикронные волокна 200 нм) способствовал более высокой миграции ШК. На волокнистых субстратах SCs мигрировали вдоль волокон, тогда как в контрольной группе наблюдалось радиальное распределение от центра ДКГ. Рост аксонов ДКГ на волокнистых анизотропных скаффолдах направленный, в отличие от разветвленных разнонаправленных аксонов ДКГ при культивировании на контрольных подложках. Эти материалы могут быть перспективными для использования как наполнители в искусственных нервных проводниках и для создания тканеинженерных конструкций. Показано, что МСК на скаффолдах PDA-MIX способствуют росту аксонов нейронов ДКГ даже в условиях гипергликемического стресса, и несмотря на отсутствие дифференцировки в шванноподобные клетки. При этом плотность аксонов при фототермической стимуляции в 1.8 раза выше, что подтверждает стимулирующее действие облучения и высокий регенеративный потенциал МСК, культивированных на PDA-MIX скаффолдах. В ходе разработки кондуита как основы клеточно-инженерного конструкта были испытаны несколько вариантов комбинированных искусственных графтов, представляющих собой полую трубку, заполненную наноструктурированным материалом. Создан прототип искусственного нервного кондуита с биорезорбируемой трубкой из смеси поликапролактона и коллагена I типа, внутри которой расположен трубчатый вкладыш из нановолокнистого композитного материала с нейлоновыми волокнами диаметром 60 и 200 нм, ориентированными вдоль оси кондуита. Эта конструкция может быть использована для имплантации без фототермического покрытия, а также для создания имплантатов, стимулируемых внешним воздействием. В качестве предварительных исследований по разработке клеточно-инженерной конструкции был выбран менее травматичных для клеток вариант с заселением МСКж готовой конструкции. Показано, что композитный материал, покрытый ПДА обладает высокой адгезией и биосовместимостью и при культивировании МСКж в полости кондуита с вкладышем из композитного материала, покрытого ПДА клетки сохраняют жизнеспособность. Разработанные в ходе реализации проекта подходы и композитные наноматериалы могут быть использованы для управления функциональной активностью клеток, особенно в случаях, когда необходим направленный рост, например, при регенерации периферической нервной ткани. Полученные результаты приближают к созданию биосовместимых и простых в изготовлении “smart” материалов для разработки масштабируемых технологий тепловой стимуляции для целей регенеративной медицины.