Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Целью первого этапа проекта было получение мультитаргетных белков на основе DR5-селективного варианта цитокина TRAIL для воздействия на опухолевые клетки и микроокружение опухоли. Были получены две новые генетические конструкции для экспрессии гибридных белков на основе DR5-селективного варианта TRAIL DR5-B с антагонистическими пептидами к рецептору фактора роста фибробластов 1 (FGFR1), и к рецептору фактора роста сосудов человека VEGFR2. Гибридные белки были экспрессированы в штамме E.coli SHuffle B и очищены из растворимой клеточной фракции с помощью металл-аффинной и ионообменной хроматографии. Препараты сохраняли стабильность биологическую активность в течение не менее 6 месяцев при +4°С. Оценка аффинности полученных гибридных белков к целевым рецепторам DR5, VEGFR2 либо FGFR1 методом иммуноферментного анализа показала, что добавление анти-VEGFR2 либо анти-FGFR1 пептидов на N- и С- конец белка DR5-B не снижает его сродство к рецептору DR5, при этом сродство к VEGFR2 и FGFR1 находится в наномолярном диапазоне. Поверхностная экспрессия рецепторов DR5, FGFR1 и VEGFR2 исследовалась на клеточных линиях карцином желудка человека MKN-45, молочной железы MDA-MB-436, и поджелудочной железы BxPC-3 и MIA PaCa-2 с помощью проточной цитометрии. Во всех исследованных линиях наблюдался высокий уровень экспрессии DR5, при этом наивысшая экспрессия наблюдалась в клетках MIA PaCa-2. Также во всех линиях была обнаружена экспрессия VEGFR2 и FGFR1, причем абсолютный уровень VEGFR2 в среднем был выше. Была исследована биологическая активность гибридных белков на линиях мышиных фибробластах NIH-3T3 и эндотелиоцитов bEnd.3, обе из которых экспрессировали все три рецептора-мишени. Клетки NIH-3T3 были устойчивы ко всем препаратам, при этом фактор роста фибробластов FGF2 стимулировал их пролиферацию, которая предотвращалась гибридными белками, имеющими анти-FGFR1 пептид в своем составе, но не белком DR5-B. Гибридный белок с анти-VEGFR2 пептидом SRH также частично подавлял стимуляцию NIH-3T3 благодаря сродству к FGFR1. Все лиганды ингибировали рост клеток bEnd.3 на 10-15%. Однако только гибридные белки, содержащие анти-VEGFR2 пептид SRH, подавляли VEGFA-опосредованную стимуляцию bEnd.3. Поскольку наибольшей эффективностью отличался гибридный белок, имеющий пептиды-антагонисты к обоим рецепторам FGFR1 и VEGF2, можно предполагать, что он будет обладать наиболее выраженными противоопухолевыми свойствами in vivo. Была разработана in vitro модель опухолевого микроокружения на основе клеточных линий рака поджелудочной железы человека MIA PaCa-2, мышиных фибробластов NIH-3Т3 и эндотелиоцитов b.End.3. Клетки были окрашены флуоресцентными витальными красителями: NIH-3Т3 – зеленым CellTracker CFSE; b.End3 –красным CellTracker Red CMTPX; MIA PaCa-2 не окрашивали. Клеточный сортинг спустя 48 часов со-культивирования показал разделение ко-культуры на три субпопуляции: 14% b.End.3, 64,6% NIH-3Т3 и 21,4% MIA PaCa-2. Разработанная модель со-культивирования будет использована для оценки воздействия гибридных белков на разные субпопуляции клеток. Были подобраны условия для исследования метаболизма и ангиогенеза в опухолях. Был разработан и адаптирован протокол визуализации кислородного статуса опухолей in vivo методом PLIM (Phosphorescence Lifetime Imaging Microscopy). с использованием фосфоресцентного сенсора молекулярного кислорода PIr3 и проведена оценка кислородного статуса в нативных модельных опухолях U87MG. Время жизни фосфоресценции PIr3 составляло 2,01 ± 0,11 мкс, что соответствует гипоксии. Таким образом, исследуемые опухоли характеризуются низким содержанием кислорода, т.е. являются гипоксичными. Значение времени фосфоресценции в клетках in vitro составило 1,89 ± 0,07 мкс, что также соответствует гипоксичному состоянию. Однако, разработанная методика оказалась неэффективной для оценки кислородного статуса опухолей MIA PaCa-2. При увеличении концентрации PIr3 с 10 мкМ до 20 мкМ, а также увеличении времени накопления в тканях с 15 мин до 40 мин сигнал фосфоресценции являлся недостаточным для обработки полученных данных. Одновременно проводили анализ метаболического статуса модельных опухолей U87MG и MIA PaCa-2 in vivo по аутофлуоресценции метаболического кофактора НАД(Ф)Н методом FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). В ходе обработки кривых затухания флуоресценции НАД(Ф)Н получали значения короткой, длинной и средней компонент времен жизни (t1, t2 и tm), а также их вклады в процентном отношении (a1 и a2, a1 + a2 = 100%), которые соответствуют свободной и связанной с белками формам НАД(Ф)Н и отражают метаболический статус клеток (гликолиз или OXPHOS). Были получены типичные флуоресцентные изображения опухолевых клеток in vivo и типичные значения t1, t2, tm, a1 и a2, которые коррелировали с литературными данными. Был проведен анализ микрососудистого русла экспериментальных опухолей методами оптоакустической ангиографии (ОА) и оптической когерентной томографии с функцией микроангиографии (ОКТ-МА). Анализ ОА изображений опухолей U87MG и MIA PaСa-2, показал, что контрольные опухоли на обоих моделях характеризовались большим количеством извилистых, неравномерно распределенных сосудов различного калибра. В модели U87MG наблюдалась более высокая васкуляризация по сравнению с моделью MIA PaCa-2 со средними значениями фракций сосудов 5,2±0,7% и 4,2±1,0% соответственно. Анализ типичных ОКТ-МА изображений опухолей U87MG и MIA PaСa-2 показал, что плотность перфузируемых сосудов соответствовала плотности сосудов, визуализируемой с помощью ОА, на моделях U87MG и MIA PaCa-2. Опухолевые узлы модели MIA PaCa-2 содержали больше перфузируемых сосудов по сравнению с моделью U87MG (p<0,05). Также было проведено молекулярное моделирование мультимодальных гибридных белков на основе DR5-B. Были построены атомистические модели мультидоменных гибридных белков на основе DR5-B, соединенных с анти-FGFR1 и анти-VEGFR2 пептидами посредством гибких линкеров, и проведена их полноатомная молекулярной динамика. Анализ динамики показал, что домен DR5-B сохраняет свою глобулярную структуру, близкую к кристаллической. Взаимодействия мономеров гибридных белков в тримере обеспечивались остатками Y185, Q187, K224, Q244, I247 и Q271 домена DR5-B. Пептиды и линкеры имели неупорядоченную структуру и высокую степень подвижности. При сравнении амплитуды динамики пептида-антигониста FGFR1, присоединенного к N- или C-концу DR5-B, было замечено, что при N-концевом положении обеспечивается большая подвижность пептида. Анализ взаимодействий доменов в молекулярной динамике показал, что пептиды формируют контакты с DR5-B доменом в подавляющем числе кадров. Были построены модели взаимодействия пептидов с целевыми рецепторами методом молекулярного докинга. Результаты аланинового скрининга выявили наиболее важные аминокислотные остатки пептидов-антагонистов FGFR1 и VEGFR2 с соответствующими рецепторами-мишенями.