Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Препараты аспарагиназ являются неотъемлемой частью стандартных методов лечения различных видов рака, включая лейкемию. Несмотря на разнообразие лекарственных форм, доступных во всем мире, они демонстрируют недостаточную эффективность и высокую токсичность, обусловленную иммунным ответом организма. Исследуя различные аспарагиназы, полученные из разных источников, мы обнаружили, что не всегда существует прямая зависимость между каталитической активностью фермента и его способностью ингибировать рост клеток. Мы выдвинули гипотезу, что ключевым фактором, определяющим терапевтическую эффективность аспарагиназы, является её способность проникать в раковые клетки и связываться с ними. Перспективным в этом отношении является АСП Rhodospirillum rubrum (RrA), внутриклеточный фермент. RrA характеризуется высокой KM (2мМ), неоптимальным рН профилем (рН оптимум 9.2). При этом RrA имеет выраженную противоопухолевую активность. Мы установили, что RrA способна интернализоваться в лейкозные клетки, что объясняет повышенную противоопухолевую активность фермента (по сравнению с ожидаемой исходя из активности по L-аспарагину). Ряд других изученных нами L-аспарагиназ не способны проникать внутрь клеток. Нами продемонстрировано, что «аномально» высокая цитотоксическая активность RrA обусловлена тем, что она расщепляет аспарагин внутри раковых клеток, а не в системном кровотоке! Аспарагиназа, работающая внутри раковых клеток – представляется перспективным направлением решения проблем с эффективностью, стабильностью, иммуногенностью и токсичностью. Мы показали, что способность фермента интернализироватся в раковые клетки может быть значительно улучшена путём конъюгации его с катионными полимерами, такими как хитозан, полиэтиленимин или спермин и сополимеров на их основе. Кроме того, процесс конъюгации изменяет оптимальный уровень pH фермента, приближая его к физиологическим значениям, что может привести к увеличению активности в 2-3 раза в этих условиях. Полимер способствует и снижению иммуногенности за счет экранирования поверхности белка от контакта с компонентами иммунной системы. Используя конфокальную микроскопию, мы продемонстрировали, что конъюгация аспарагиназы с поликатионными полимерами значительно увеличивает степень взаимодействия с раковыми клетками, а также повышает активность ферментов, внутри раковых клеток в 5-10 раз. Предложен механизм цитотоксического действия ферментов, который связан с гидролизом аспарагина внутри раковых клеток и вблизи них. Ферменты адсорбированные на поверхности клеток создают область с локально сниженной концентрацией Asn. Таким образом, мы предлагаем многообещающий подход к повышению терапевтической эффективности ферментов, расщепляющих аспарагин, путём их конъюгирования с катионными полимерами. Эта стратегия может привести к дальнейшему клиническому применению ферментов в терапии рака. В рамках проекта был изучен L-аспарагиназы из Rhodospirillum rubrum, а также мутантные формы L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum, содержащие замены, влияющие на каталитические параметры фермента, а также замены, усиливающие его цитотоксическую активность. Эти исследования включали анализ кинетических характеристик и стабильности мутантных форм в различных условиях, а также цитостатическую активность на лейкозных клетках. Отработаны методики определения активности L-аспарагиназы в различных системах, включая оптически непрозрачные системы- сыворотку крови, мицеллярную систему и клеточную среду. Исследования каталитических характеристик проводились с использованием новых высокопроизводительных, «безреагентных» и чувствительных методов определения параметров, таких как метод спектроскопии кругового дихроизма (КД), ИК спектроскопии Фурье, флуоресцентные методы, и разработаны ФРЕТ-системы для определения каталитической активности ферментов внутри раковых клеток. Разработан подход к созданию стабильных и высокоэффективных биокатализаторов с использованием методов ХитоПЭГилирования и АминоПЭГилирования. Были синтезированы и изучены конъюгаты RrA и мутантных форм L-аспарагиназы с сополимерами различной молекулярной архитектуры, а также ферменты, модифицированные олигоаминами. Полиэлектролитные свойства разработанных полимеров способствует их многоточечному электростатическому взаимодействию с поверхностью белка, что позволяет модулировать каталитические свойства фермента, в том числе за счёт сдвига рН оптимума активности фермента в область физиологических значений рН. Оптимизация молекулярной архитектуры и состава конъюгатов позволяет достичь увеличения каталитической эффективности L-аспарагиназ в требуемых условиях (kcat/KM) до 3-6 раз. С другой стороны, нами было найдено, что некоторые из видов химической модификации аспарагиназ не только повышают их удельную ферментативную активность и стабильность в физиологических условиях, но также и делают их воспроизводимо более активными на клеточных линиях. В опытах in vitro конъюгаты EwA и RrA и мутантных форм с поликатионами проявляли более высокую противоопухолевую активность (на порядок) по сравнению с нативным ферментом в отношении клеток хронического миелоидного лейкоза человека К-562 и клеток аденокарциномы молочной железы MCF7. В результате конъюгирования активность на клеточных культурах возрастает кратно, в том числе, по сравнению с EcA и ErA, зарегистрированными в качестве фармацевтических препаратов в России и за рубежом. На основе разработанной нами технологии – формирования конъюгатов с биодеградируемыми сополимерами – поликатионами разработаны формуляции RrA, обеспечивается повышение цитостатической активности (в том числе за счет интернализации в опухолевые клетки) – на культурах как лейкозных, так и солидных опухолей. Что обуславливает потенциал для расширения показаний в отношении солидных опухолей (где АСП до сих пор не показывали эффективность). Разработанные методики и подходы могут быть использованы для создания более эффективных и безопасных препаратов для лечения онкологических заболеваний.