Аннотация результатов, полученных в 2025 году
За первый год реализации Проекта были решены все запланированные Задачи: 1. Установлены типы пептидных связей, гидролизуемых ферментами Blp, Л5 и Ami L. capsici XL1, в пептидогликанах бактерий с разными хемотипами (А2, A3α, A4α и A1γ). Пептидогликаны бактерий четырех разных хемотипов: Staphylococcus aureus 209P (A3α), Enterococcus faecium FS86 (A4α), Bacillus cereus 217 (A1γ), Micrococcus luteus Ac-2230T (A2), получали методом Шоу (Shaw et al., 1970, doi:10.1016/s0021-9258(18)62823-6) с модификацией. Для наработки пептидогликанов в достаточном количестве были подобраны среды и оптимизированы условия культивирования бактерий. Установлено, что оптимальными являются для B. cereus 217 и S. aureus 209P – среда BHI, 24 ч культивирования при 29 °С и 37 °С, соответственно; для M. luteus Ac-2230T – среда RM, 24 ч культивирования при 29 °С; для E. faecium FS86 – среда MRS, 14 ч культивирования при 29 °С. Методом ВЭЖХ подтверждено, что в полученных пептидогликанах присутствуют только характерные для данных хемотипов аминокислоты. Турбидиметрически установлено, что бактериолитическая амидаза Ami гидролизует пептидогликаны всех исследуемых бактерий: B. cereus 217 на 98% за 50 мин; S. aureus 209P – на 81% за 6 ч; E. faecium FS86 на 95% за 1.5 ч, а M. luteus Ac-2230T – на 86% за 4 мин. Методами динитрофенилирования, гидразинолиза (метод Акабори) (Ghuysen et al., 1966, doi.org/10.1016/0076-6879(66)08124-2, Akabori et al., 1952) и ТСХ впервые установлено, что бактериолитическая амидаза Ami гидролизует в пептидогликанах S. aureus 209P (A3α), E. faecium FS86 (A4α), B. cereus 217 (A1γ) и M. luteus Ac-2230T (A2) только амидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и L-Ala тетрапептида. Это подтверждает биоинформатическую аннотацию фермента как N-ацетилмурамоил-L-аланин амидаза. Турбидиметрически установлено, что бактериолитическая протеаза Blp гидролизует пептидогликаны S. aureus 209P на 80% за 1 ч; M. luteus Ac-2230T на 90% за 2 ч и E. faecium FS86 на 68% за 14 ч. Пептидогликан B. cereus 217 фермент Blp не гидролизует. Методами динитрофенилилирования, гидразинолиза и ТСХ установлено, что в пептидогликане S. aureus 209P Blp гидролизует связи Gly – Gly и Gly – D-Ala, в пептидогликане M. luteus Ac-2230T – связь L-Ala – D-Ala, в пептидоглиане E. faecium FS86 – связь D-Asp – D-Ala, которая показана впервые. Турбидиметрически было установлено, что бактериолитическая протеаза L5 гидролизует только пептидогликаны E. faecium FS86 и M. luteus Ac-2230T на 27% и 16%, соответственно за 15 ч. Методами динитрофенилилирования, гидразинолиза и ТСХ установлено, что в пептидогликане M. luteus Ac-2230T фермент L5 гидролизует связь L-Ala – D-Ala, которая показана впервые. Пептидогликаны S. aureus 209P и B. cereus 217 фермент L5 не гидролизует. 2. С помощью молекулярного моделирования определены возможные функционально-значимые участки/а.о. в структуре Blp, Л5 и Ami, которые отвечают за их связывание с клеточной поверхностью клеток-мишеней. Наиболее сложным оказался анализ амидазы Ami L. capsici XL1. В отличие от белков Blp (PDB ID 8AF1) и Л5 (PDB ID 5MRT), для белка Ami структуры в банке белковых структур PDB нет. Структура Ami была предсказана с помощью третьей версии программы AlphaFold. Согласно полученной модели, фермент состоит из двух глобулярных доменов, соединенных линкером. Был выполнен поиск в банке белковых структур PDB с помощью дескрипторов BioZernike ближайших структурных гомологов, содержащих субстраты ряда пептидогликанов (или их углеводных/пептидных фрагментов). Далее, три лучших найденных структурных гомолога были попарно структурно выравнены с предсказанной структурой белка Ami методом TM align, что позволило нам правильнее расположить имеющиеся лиганды в целевом белке и определить консервативные остатки активного сайта. Также был выполнен молекулярный докинг углеводного фрагмента пептидогликана (NAG-NAM)2 по гомологии на основании структурно близких белков. В результате были предсказаны а.о. Ami, участвующие в связывании с углеводной частью пептидогликана: R154, M32, E33, Y155. В качестве потенциальных мишеней были выбраны аминокислоты R154 и E33. Среди остатков, отвечающих за связывание углеводного фрагмента у двух других белков, методами молекулярного докинга были идентифицированы остатки R144 и Y160 у Blp, Q46 и L13 у L5. 3. Сконструированы экспрессионные плазмиды с генами мутантных белков. Была проведена молекулярно-генетическая работа по замене R154 и E33 у Ami, R144 и Y160 у Blp, Q46 и L13 у L5 на аланин с помощью сайт-направленного мутагенеза. Сборка конструкции происходила в несколько этапов с использованием метода ПЦР с перекрывающимися праймерами. Были амплифицированы фрагменты FR_1 и FR_2 каждого из генов бактериолитических ферментов с использованием пары специфических праймеров. Один из пары праймеров содержал сайт распознавания соответствующей эндонуклеазой рестрикции. Второй праймер на 5ˊ-конце содержал последовательность, частично комплементарную другому праймеру с точечной заменой нуклеотида, приводящей к замене аминокислоты на аланин. На финальном этапе использовали пару праймеров, комплементарных последовательности полноразмерного гена. Экспрессионные плазмиды с генами мутантных белков Blp, Ami и L5 получали в результате клонирования ампликонов соответствующих генов в ранее полученном нами векторе pBBR1-MCS5 PGroEL(A)–gfp (Kudryakova et al., 2022, doi: 10.3390/ijms23105722). Отсутствие спонтанных мутаций и правильность сборки конструкций было подтверждено посредством секвенирования с использованием специфических праймеров. 4. Получен мутантный штамм L. capsici XL1Δami с делецией в гене ami. Мутантный штамм L. capsici XL1Δami с делецией в гене ami получали методом гомологичной рекомбинации. На первом этапе была получена плазмида pJQ200SKΔ5’ami в результате клонирования в суицидном векторе pJQ200SK фрагмента 914 п.о. ДНК (3’ гена ami и downstream прилегающий регион). На втором этапе была получена плазмида pJQ200SKΔami в результате клонирования в векторе pJQ200SKΔ5’ami фрагмента 960 п.о. ДНК (5’ гена ami и upstream прилегающего региона). И на последнем этапе была введена маркированная мутация геном кассеты устойчивости к TcR в плазмиду pJQ200SKΔami. Плазмиду pJQ200SKΔami::tet вводили в клетки L. capsici XL1 посредством электропорации. В результате гомологичной рекомбинации на последнем этапе отбирали клоны с фенотипом SucRTcRGmS, что свидетельствовало об успешной рекомбинации. Подтверждение мутации проводили ПЦР с использованием селективных праймеров. Было выявлено, что размер ампликонов составляет 1831 п.о., что соответствует замене участка гена ami в 1592 п.о. на кассету TcR размером 1430 п.о. Размер полученных ампликонов полностью соответствует размеру ампликона с рекомбинантной плазмиды pJQ200SKΔami::tet. Полученные результаты свидетельствуют о мутации в гене ami и, соответственно, об успешно полученном мутантном штамме L. capsici XL1Δami.