Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Настоящий проект направлен на изучение структуры, экспрессии и тканеспецифичных функций регуляторных некодирующих белки РНК (нкРНК) позвоночных. В рамках указанной проблемы мы поставили перед собой следующую задачу: изучить локализацию, особенности экспрессии и функции регуляторных и структурных нкРНК в соматических клетках и растущих ооцитах доместицированных видов птиц – представителей отряда Galliformes. В отчетном году с помощью биоинформатического анализа генома и транскриптома курицы был проведен отбор перспективных для дальнейшего исследования длинных некодирующих РНК (нкРНК). Впервые получено экспериментальное подтверждение транскрипции тандемных повторов ДНК в соматических клетках птиц на примере субтеломерного и интерстициального повторов домашней курицы. С помощью РНК-FISH впервые охарактеризовано распределение длинных нкРНК – транскриптов субтеломерного и теломерного повторов – в митозе и в интерфазных ядрах культивируемых клеток курицы. Проанализирована чувствительность этих нкРНК к перевариванию различными рибонуклеазами, что позволило высказать предположения о структуре транскриптов. С помощью совместной детекции с высоким разрешением белков и РНК на гигантских хромосомах типа ламповых щеток домашней курицы определен состав РНП-матрикса (перихроматиновых фибрилл) локусов транскрипции нкРНК, сформированных тандемно повторяющимися последовательностями ДНК. В частности были изучены транскрипцтонные единицы тандемного повтора LL2R. Получены новые данные о составе перихроматиновых фибрилл транскрипционных единиц тандемного повтора LL2R: впервые показано, что новообразующиеся РНП LL2R обогащены сплайсинговой мяРНК U6 и обеднены РНК-связывающими белками PSF/SFPQ и гяРНП L. Разработан уникальный метод микродиссекции индивидуальных транскрипционных единиц гигантских хромосом типа ламповых щеток, а также методы получения флуоресцентных зондов и библиотек для высокопроизводительного секвенирования как из ДНК, так и из РНК диссектированных транскрипционных единиц. Адаптирован метод получения фракции кольцевых РНК (circРНК) из ооцитов и соматических клеток птиц с помощью экзорибонуклеазы R. Полученные результаты представлены на трех международных и трех российских конференциях, в том числе в виде двух устных докладов. Новые сведения о транскриптах длинных регуляторных РНК использованы для совершенствования авторского курса лекций «Функции некодирующих РНК» для студентов магистратуры биологического факультета СПбГУ. Полученные результаты подготовлены к публикации в международных журналах (три рукописи статей) в соответствии с заявленным планом работ.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В отчетный период мы продолжили исследование некодирующей белки РНК на хромосомах, в ооцитах, в соматических клетках и в транскриптоме домашней курицы (G. gallus). Мы показали, что использование гигантских хромосом типа ламповых щеток из ядер растущих ооцитов в качестве исходного материала для механической микродиссекции позволяет преодолеть барьер в размере диссектируемых фрагментов хромосом. При этом высокопроизводительное секвенирование (NGS) ДНК из образцов, полученных с помощью микродиссекции хромосом типа ламповых щеток, позволяет определить, какие последовательности транскрибируются одной латеральной петлей или группой петель, исходящих из одного хромомера. Так, показано, что крупные DAPI-позитивные хромомеры (размером до 2 млн.п.н.) хромосом типа ламповых щеток соответствуют обедненным генами и обогащенным повторяющимися последовательностями (в том числе ретротранспозонами) участкам генома. Вместе с тем, необычные транскрипционные единицы, такие как «глыбчатые петли», и маркерные структуры типа «спаггети-маркер» формируются в локусах, содержащих гены. Продолжено исследование феномена транскрипции тандемных повторов ДНК у домашней курицы. На примере короткого повтора РО41 (от англ. “pattern of 41 bp”) курицы мы продемонстрировали транскрипцию субтеломерной тандемно повторенной ДНК в эмбриогенезе. Показано наличие транскриптов обеих нитей повтора РО41 во всех эмбриональных тканях, что соответствует повсеместной транскрипции некодирующей РНК Xist у млекопитающих и человека. Для многих видов птиц характерно формирование гигантских РНП-аггрегатов в терминальных районах хромосом, получивших название GIant TErminal RNP-Aggregates (GITERA). В ходе выполнения работ отчетного этапа мы показали, что GITERA на хромосомах типа ламповых щеток курицы не аккумулируют или не содержат белки гетерогенных ядерных РНП L, K и I (PTB), а также белки параспеклов p54nrb, PSF/SFPQ и белок FUS. Хотя основной массив структуры одного из подвидов GITERA – так называемых «метелок» – имеет такой же состав РНП что и канонические GITERA, основания «метелок» содержат белки p54nrb и hnRNP I/PTB. При этом белки p54nrb и hnRNP I/PTB выявляются в составе длинных фибрилл, напоминающих амилоидоподобные фибриллы, формируемые белками hnRNP A1 и FUS. Согласно предложенной нами модели формирования GITERA транскрипция некодирующих белки субтеломерных последовательностей и связывание этих транскриптов с белковыми комплексами служит пусковым механизмом к агрегации РНП. Аккумулирующиеся РНП-комплексы связывают РНП из нуклеоплазмы через белок-белковые взаимодействия, что приводит к формированию гигантских РНП-агрегатов на концах хромосом типа ламповых щеток, удерживающих поли(А) РНК в ядре. Полученные результаты представлены на 5 международных конференциях, в том числе в виде двух устных докладов. С целью популяризации полученных в ходе выполнения проекта результатов исполнители проекта приняли участие в съемках телепередачи "Матрица Науки" (при поддержке Комитета по науке и высшей школе Санкт-Петербурга) (http://cell-nucleus-lab.bio.spbu.ru/MATRIX_09_DNA.mp4). В результате выполнения проекта опубликовано 5 статей в журналах Chromosoma, Chromosome Research, Molecular Cytogenetics, Вавиловский журнал генетики и селекции, в том числе – 4 статьи, в журналах, индексируемых в базе данных Web of Science Core Collection (в соответствии с заявленным планом работ).

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В отчетный период мы продолжили исследование некодирующих белки РНК на хромосомах, в ооцитах, в соматических клетках и в транскриптоме домашней курицы (G. gallus). Подготовлен аналитический обзор, опубликованный в журнале RNA Biology, впервые систематически охватывающий исторические и современные данные о транскрипции сателлитной ДНК амфибий и птиц в соматических клетках и во время мейоза, когда хромосомы приобретают особую форму ламповых щеток. По отношению к актуальным знаниям о биогенезе некодирующей РНК, некоторые из транскриптов тандемных повторов вероятно участвуют в регуляторных механизмах развития эмбриона, эпигенетической наследственности, образовании гетерохроматина путем гашения транскрипции, удержании определенных типов РНК в ядре клетки или имеют рибозимную активность. Для определения функций некодирующих РНК тандемного субтеломерного повтора PO41, мы провели эксперименты по гашению РНК в клетках, используя химически модифицированные антисенс олигонуклеотиды Locked Nucleic Acids. С использованием ресурсов CISBP-RNA, RBPDB и RPBmap спрогнозирован набор белков, связывающих последовательность нкРНК тандемного повтора PO41. С помощью иммунопрецепитации РНК также впервые показано формирование комплекса между нкРНК тандемного повтора LL2R и фактором сплайсинга SR-белком SC35. Для исследования генетического состава и транскрипционного статуса гетерохроматиновых районов хромосом японского перепела (Coturnix c. Japonica, представитель отряда Курообразные) мы провели механическую микродиссекцию гигантских хромосом из растущих ооцитов. Продемонстрирована перспективность использования подхода микродиссекции гигантских хромосом из растущих ооцитов в целях исследования транскрипционной активности гетерохроматиновых районов хромосом, состоящих из некодирующих белки последовательностей ДНК. С помощью низковольтной сканирующей электронной микроскопии получены уникальные снимки поверхности нкРНК-содержащих ядерных структур. Использованный метод микроскопии позволил применить малоинвазивную пробоподготовку и избежать необходимости напыления проводящих металлов. Помимо морфологии ядерных доменов впервые описано распределение ряда маркерных компонентов (дцДНК, мяРНК, коилина) на поверхности ядерных структур с помощью иммуноокрашивания со специфичными антителами с последующей электронной детекцией наночастиц золота. Полученные данные свидетельствуют о секвестрирующей функции экстрахромосомных телец в ядрах ооцитов. Известно, что вместе с генетическими и эпигенетическими факторами пространственная архитектура генома является еще одним уровнем контроля тканеспецифичной экспрессии генов. В ходе выполнения проекта впервые получены HiC-библиотеки эмбриональных фибробластов и эритроцитов курицы. HiC-библиотеки были секвенированы на приборе Illumina HiSeq 2500 в РЦ «Биобанк» Научного парка СПбГУ. Получены карты HiC-контактов эмбриональных фибробластов и эритроцитов курицы и впервые в мире проведена аннотация пространственных взаимодействий в геноме курицы с помощью высокопроизводительного метода HiC. Показано, что топологически-ассоциированные домены характерны как для эмбриональных фибрабластов, так и для эритроцитов курицы. Проанализированы некоторые элементы генома, определяющие границы топологических доменов. Показано, что в эмбриональных фибробластах топологические домены обеднены генами, в то время как границы доменов и участки между ними обогащены генами, в том числе генами нкРНК. В 2016 году в результате выполнения проекта опубликовано 5 статей в журналах Scientific Reports, RNA Biology, BMC Genomics, Цитология, Российский орнитологический журнал, и глава в монографии на английском языке (издательство Springer); еще одна статья принята к печати (в соответствии с заявленным планом работ). Полученные результаты представлены в виде нескольких устных докладов на крупных международных конференциях. Кроме того, новые сведения использованы для совершенствования авторского курса лекций «Функции некодирующих РНК» для студентов магистратуры биологического факультета СПбГУ.