КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 14-14-00585

НазваниеМолекулярный механизм убиквитин-независимого протеолиза белков протеасомой и его роль в норме и патологии

РуководительБелогуров Алексей Анатольевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2014 г. - 2016 г.  , продлен на 2017 - 2018. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№1 - Конкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словапротеасома; иммунопротеасома; основной белок миелина; гидролиз; гистоны; убиквитин; рассеянный склероз; презентация антигенов

Код ГРНТИ34.15.00

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Протеасома – высокомолекулярный белковый комплекс, обладающий протеолитической активностью с широкой субстратной специфичностью. 20S протеасома в качестве протеолитического ядра входит в состав 26S протеасомы. Основная функция протеасомы – деградация "отслуживших" и дефектных клеточных белков. Около 90% короткоживущих и 70% долгоживущих белков в клетке разрушаются 26S протеасомой. Для распознавания протеасомой белок, который необходимо разрушить, должен быть связан с одной или несколькими молекулами убиквитина – полипептида, содержащего 76 аминокислотных остатков. Маркировку белков осуществляет сложная система ферментов, называемая системой убиквитинилирования. Данная система включает в себя до 1000 белков, что составляет примерно 5% всего протеома, которая обеспечивает тотальный контроль за любым белком по той или иной причине подвергающимся протеасомной деградации. В последнее время в научной литературе появилось ряд свидетельств о возможности убиквитин-независимой деградации полипептидов. При этом маркером для деградации может служить аминокислотная последовательность внутри самого белка или некая вспомогательная молекула-переносчик. Принимая во внимание, что в этом случае взаимодействие субстрат-протеасома выходит за рамки регуляторной функции системы убиквитинилирования, данный факт однозначно свидетельствует о важности внимательного изучения подобных исключений. Ранее нами были получены предварительные данные, свидетельствующие об убквитин-независимом гидролизе ряда субстратов. Этот ряд включает в себя основный белок миелина, один из основных аутоантигенов при рассеянном склерозе – демиелинизирующей патологии центральной нервной системы, а также гистоны, высококонсервативные элементы структурной организации хроматина, присутствующие во всех без исключения эукариотических клетках. В настоящем проекте предполагается к изучению молекулярный механизм гидролиза данных белков протеасомой в отсутствие убиквитинилирования. Данный механизм, по нашим представлениям, имеет универсальный характер, поэтому есть все основания утверждать, что приведенный список далеко не окончательный и пополнится рядом физиологически важных убиквитин-независимых протеасомных субстратов. Значительное количество пепитдов, генерируемых протеасомой, далее презентируется на поверхности клеток в составе MHC I. Набор этих пептидов составляет своего рода "молекулярный паспорт" клетки, участвующий в опознавании "свой-чужой". Известно, что протеасома существует в двух основных состояниях – конститутивная и иммунопротеасома, каталитические субъединицы которых, в свою очередь, имеют разную специфичность расщепления полипептидов. Этот переход регулируется различными цитокинами и, в первую очередь, интерфероном гамма. Экспериментально доказано, что уровень иммунопротеасомы значительно повышается при аутоиммунных патологиях. Этот процесс может быть одним из факторов индукции и развития аутоиммунных состояний. Можно предположить, что отсутствие регуляции со стороны системы убиквитинилирования при аутоиммунных состояниях приводит к тому, что паттерн пептидов, презентируемых на поверхности клеток, определяется каталитическими субъединицами протеасомы. В результате выполнения проекта в экспериментах in vitro, на клеточных и животных моделях будет (1) исследован механизм убиквитин-независимой деградации белков протеасомой (2) доказана или опровергнута гипотеза коллектива заявителей о физиологической роли убиквитин-независимой деградации антигенов протеасомой в развитии аутоиммунных патологий (3) предложены подходы к созданию агентов – блокаторов иммунопротеасомы – для направленной терапии аутоиммунных заболеваний.

Ожидаемые результаты
В рамках представляемого проекта предполагается получить следующие важнейшие результаты: подтверждение и детализация механизма, а также изучение физиологической значимости убиквитин-независимого гидролиза основного белка миелина и гистонов протеасомой; поиск альтернативных убиквитин-независимых протеасомных субстратов со сходным механизмом гидролиза, понимание важности их метаболизма; обобщение экспериментальных данных с описанием универсального механизма убиквитин-независимого протеолиза изученных белков; создание подходов к направленной терапии социально-значимых аутоиммунных нарушений. К публикации планируется серия статей в высокорейтинговых научных изданиях и глава в монографии.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Рассеянный склероз (РС) – это системное аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы человека, характеризующееся множественными повреждениями белого вещества. Среди главных аутоантигенов при РС выделяют несколько белков миелиновой оболочки, в том числе оснóвный белок миелина (MBP), в значительных количествах присутствующий в мембране олигодендроцитов. В процессе метаболизма внутриклеточный протеолиз MBP может происходить под действием различных протеаз, а также мультикаталитического протеиназного комплекса – протеасомы. Абсолютное большинство белков разрушаются 26S протеасомой по убиквитин-зависимому пути. Нами было установлено, что МВР принадлежит к крайне малочисленной группе белков, способных подвергаться протеолизу 26S протеасомой в отсутствии молекул убиквитина. Молекулярный механизм гидролиза МВР предположительно является заряд-опосредованным. Протеасома является главным протеолитическим комплексом, генерирующим пептиды, презентируемые на поверхности клетки в контексте комплексов гистосовместимости I класса. Отсутствие контроля за гидролизом МВР со стороны системы убиквитинилирования означает, что качественный и количественный спектр пептидов МВР, презентируемых на поверхности олигодендроцитов, практически полностью определяется каталитическими субъединицами протеасомы. Нами было установлено, что при развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) – животной модели рассеяного склероза – в головном мозге иммунизированных животных конститутивная протеасома в значительной степени замещается иммунопротеасомой, при этом имуносубъединица β1i локализуется преимущественно в олигодендроцитах. Показано, что повышенное содержание иммунопротеасомы в головном мозге мышей с ЕАЕ приводит к образованию повышенного количества ряда патогенных пептидов МВР, включая пептид ENPVVHFF, являющийся частью энцефалитогенного региона MBP. Активированные СD8+ T-клетки, специфичные к данному пептиду, эффективно лизировали олигодендроциты, обработанные интерфероном-гамма. Специфический ингибитор иммуносубъединицы β1i селективно воздействовал на иммунопротеасому in vitro, а также эффективно подавлял развитие EAE in vivo у экспериментальных животных. Полученные факты указывают на возможную связь между убиквитин-независимой протеолитической активностью иммунопротеасомы в отношении оснóвного белка миелина и развитием рассеянного склероза, а также на перспективность специфических ингибиторов иммунопротеасомы как потенциальных лекарственных средств.

 

Публикации

1. Belogurov A Jr, Kudriaeva A, Kuzina E, Smirnov I, Bobik T, Ponomarenko N, Kravtsova-Ivantsiv Y, Ciechanover A, Gabibov A. Multiple sclerosis autoantigen myelin basic protein escapes control by ubiquitination during proteasomal degradation J Biol Chem, 289(25):17758-66 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1074/jbc.M113.544247

2. Belogurov A. Jr, Kuzina E., Kudriaeva A., Kononikhin A., Kovalchuk S., Surina E., Smirnov I., Lomakin Y., Bacheva A., Stepanov A., Karpova Y., Lyupina Y., Kharybin O., Melamed D., Ponomarenko N., Sharova N., Nikolaev E., Gabibov A. Ubiquitin-independent proteosomal degradation of myelin basic protein contributes to development of neurodegenerative autoimmunity FASEB J, pending for final decision (год публикации - 2014)

3. Kuzina E, Kudriaeva A, Smirnov I, Dubina MV, Gabibov A, Belogurov A Jr. Glatiramer acetate and nanny proteins restrict access of the multiple sclerosis autoantigen myelin basic protein to the 26S proteasome Biomed Res Int, 2014:926394 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1155/2014/926394

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Поиск структурных элементов, необходимых для убиквитин-независимого гидролиза основного белка миелина (myelin basic protein, МВР) протеасомой, выявил в составе МВР множественные «композиционные дегроны», инвариантные по отношению к их линейной последовательности. Субъединица Rpn10 регуляторной 19S субчастицы определена в качестве акцептора МВР при его убиквтин-независимом гидролизе протеасомой. На основе полученных данных можно утверждать, что механизм убиквитин-независимого гидролиза МВР полноразмерной 26S протеасомой включает в себя заряд-опосредованное взаимодействие множественных положительно заряженных дегронов МВР с отрицательно заряженными мотивами субъединиц регуляторной 19S субчастицы протеасомы с последующей транслокацией в протеолитическую камеру коровой 20S субчастицы. Имеющиеся экспериментальные данные, а также структурная схожесть гистонов и МВР в терминах аминокислотного состава, свидетельствуют об аналогичном механизме убиквитин-независимого гидролиза линкерного гистона Н1.3 протеасомой.

 

Публикации

1. Belogurov, A., Jr., Kuzina, E., Kudriaeva, A., Kononikhin, A., Kovalchuk, S., Surina, Y., Smirnov, I., Lomakin, Y., Bacheva, A., Stepanov, A., Karpova, Y., Lyupina, Y., Kharybin, O., Melamed, D., Ponomarenko, N., Sharova, N., Nikolaev, E., Gabibov, A. Ubiquitin-independent proteosomal degradation of myelin basic protein contributes to development of neurodegenerative autoimmunity FASEB J., Volume 29, Issue 5, 1 May 2015, Pages 1901-1913 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1096/fj.14-259333

2. Е.С. Кузина, А.А. Кудряева, Д.В. Мальцева, А.А. Белогуров Пептидилальдегид, специфически взаимодействующий с иммуносубъединицей протеасомы β1i: эффекты in vitro и in vivo. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2016)

3. Кузина Е.С., Кудряева А.А., Глаголева И., член-корреспондент РАН Габибов А.Г. и Белогуров А.А. Деиминирование основного белка миелина замедляет его протеасомо-опосредованный метаболизм. Доклады Академии Наук. Биохимия и биофизика, - (год публикации - 2016)

4. Igor A Zavalishin, Alexey A Belogurov Jr, Yakov A Lomakin, Natalia A Ponomarenko, Sofia N Morozova, Zinaida A Suslina, Michael A Piradov, Sergey N Illarioshkin, Alexander G Gabibov Clinical and experimental studies of multiple sclerosis in Russia: experience of the leading national research centers Degenerative Neurological and Neuromuscular Disease, vol. 2015:5 p. 83—90 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.2147/DNND.S46023

5. А.Г. Габибов, О.О. Фаворова, О.Г. Кулакова, А.Н. Бойко, А.А. Белогуров, Н.А. Пономаренко Рассеянный склероз: патогенез, диагностика и лечение "Нейродегенеративные заболевания: от генома до целостного организма" под ред. М.В. Угрюмова, "Научный Мир", Москва, т.1, сс. 496-557 (год публикации - 2014)

6. A. Kudriaeva, E. Kuzina, A. Belogurov, A. Gabibov Myelin basic protein binds the Von Willebrand domain of ubiquitin receptor Rpn10 to enable ubiquitin-independent proteasomal degradation FEBS J., Volume 282, Issue Supplement S1, Page 302 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1111/febs.13339

7. E. Kuzina, A. Kudriaeva, A. Kononikhin, S. Kovalchuk, A. Bacheva, A. Belogurov, A. Gabibov Ubiquitin-independent degradation of myelin basic protein by immunoproteasome contributes to cytotoxic T-cell-mediated demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis FEBS J., Volume 282, Issue Supplement S1, Pages 138-139 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1111/febs.13339

8. А.А. Белогуров, А.Г. Габибов Прямой захват основного белка миелина 19S регуляторной субчастицей в обход системы убиквитинилирования обуславливает патологическую значимость миелин-реактивных цитотоксических лимфоцитов при рассеянном склерозе Цитология, т.57,№9 (год публикации - 2015)

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В рамках выполнения проекта получены данные, указывающие на незначительную роль 19S регуляторного комплекса в убиквитин-независимом гидролизе МВР. Показано, что гидролиз МВР протеасомой АТР-независим и ускоряется в присутствии регуляторных элементов типа REG альфа и гамма. Путем широкомасштабного транскриптомного анализа зафиксирован повышенный уровень регуляторной субчастицы REG альфа в культуре олигодендроцитов при воздействии воспалительного стимула. В рамках биоинформатического анализа нами были идентифицирован ряд МВР-подобных белков – потенциальных убиквитин-независимых субстратов. Наиболее интересными представителями данного списка можно назвать коровые гистоны. Последующие эксперименты продемонстрировали, что коровые гистоны, слитные с флуоресцентными белками, могут подвергаться внутриклеточному гидролизу протеасомой без участия убиквитина. Разработан и валидирован метод прижизненного мониторинга внутриклеточного гидролиза белков в физиологических условиях с применением резоруфин-лигазы. Сформулирована обобщенная теория убиквитин-независимого протеасомного гидролиза оснОвных белков, постулирующая ограничение на заряд, размер и фолдинг субстратов. http://ponedelnikmag.com/post/zagnat-zhivuyu-sistemu-v-ramki http://biomolecula.ru/content/1902

 

Публикации

1. Кудряева А.А., Хаустова Н.А., Мальцева Д.В., Кузина Е.С., Глаголева И.С., Сурина Е.А., Кнорре В.Д., Белогуров А.А., Тоневицкий А.Г., Габибов А.Г. Экспрессионный профиль мрнк олигодендроцитов мыши в условиях воспаления ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1134/S1607672916040086

2. Кузина Е.С. Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита Москва, - (год публикации - 2016)

3. - Загнать живую систему в рамки Понедельник, - (год публикации - )

4. - Лаборатория биокатализа ИБХ: дизайнерские ферменты и клоны-мятежники Биомолекула, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
не указано