КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 14-15-00268

НазваниеИзучение механизмов действия диаденозиновых полифосфатов на сократительную, биоэлектрическую активность сердца, а также выяснение их роли в нервном контроле работы сердца

РуководительАбрамочкин Денис Валерьевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2014 г. - 2016 г.

, продлен на 2017 - 2018. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№1 - Конкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-104 - Физиология

Ключевые словадиаденозиновые полифосфаты, никотинамидадениндинуклеотид, сердце, биоэлектрическая активность, аритмия, ионные токи, потенциал действия, сократительная активность, пуриновые рецепторы, кардиомиоцит

Код ГРНТИ34.39.49

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Диаденозиновые полифосфаты представляют собой группу или класс молекул, в структуру которых входят два аденозиновых основания, соединенных несколькими остатками фосфорной кислоты (и имеют аббревиатуру АpnA), и таким образом, являются производными пуриновых нуклеотидов. Диаденозиновые полифосфаты являются эндогенными соединениями: они образуются при помощи специфических ферментных систем в большинстве тканей организма, они присутствуют в цитоплазме, во внеклеточной середе и плазме крови (Baxi MD, Vishwanatha JK. J Pharmacol Toxicol. Methods 1995;33:121–128). В настоящее время показано, что диаденозиновые полифосфаты их производные являются новым классом регуляторных соединений, паракринных факторов, обладающих широким спектром физиологической активности. Некоторые диаденозиновые полифосфаты выделяются совместно с классическими нейромедиаторами (норадреналином) в составе синаптических везикул, т.е. являются комедиаторами (Flores NA1, Stavrou BM, Sheridan DJ. Cardiovasc Res. 1999 Apr;42(1):15-26.). Показано, что ряд диаденозиновых полифосфатов самостоятельно способен регулировать кровоток и тонус гладкой мускулатуры сосудов, полых органов, агрегацию тромбоцитов, клеточную пролиферацию (Flores NA1, Stavrou BM, Sheridan DJ. Cardiovasc Res. 1999 Apr;42(1):15-26.). Действие диаденозиновых полифосфатов частично связывают с активацией P2Y и Р2Х пуриновых рецепторов (Hoyle CH1, Ziganshin AU, Pintor J, Burnstock G., Br J Pharmacol. 1996 Jul;118(5):1294-300), показано прямое их действие на ионные каналы. Однако, полностью рецепторные, внутриклеточные и ионные механизмы действия диаденозиновых соединений в различных типах тканей не установлены. Предполагается, что диаденозиновые полифосфаты, имеющие разную длину цепи остатков фосфорной кислоты (от 1 - АpA, до 6 – Аp6A) обладают различной биологической активностью и рецепторными механизмами действия. Наибольший интерес, как регуляторные соединения, обладающие потенциальной практической и/или фармакологической значимостью, вероятно представляют диаденозин тетра- и пентафосфат. Физиологической активностью также обладают специфические метаболиты (например АДФ-рибоза), а также соединения, сходные по структуре с диаденозиновыми полифосфатами, например, молекулы, в которых замещен один из остатков аденозина. Наиболее известным примером, является никотинамидаденидинуклеотид (НАД+). Внеклеточный или экзогенный НАД+ в настоящее время рассматривается, как новый, полноценный нейромедиатор (Bobalova and Mutafova-Yambolieva, 2006; Durnin L, Sanders KM, Mutafova-Yambolieva VN. Neurogastroenterol Motil. 2013 Mar;25(3):e194-204., Mutafova-Yambolieva VN. IUBMB Life. 2012 Oct;64(10):817-24). Физиологическая активность НАД+ как нейромедиатора малоизученна, но механизмы его действия связывают с пуринорецепторами. Диаденозиновые полифосфаты вероятно играют важную регуляторную роль как в норме, так и при патологии. Показано, что уровень диаденозиновых полифосфатов существенно увеличивается в ткани сердца при ишемическом повреждении и гибели кардиомиоцитов. Большое количество различных подтипов пуриновых рецепторов, вероятно, являющихся мишенью для диаденозиновых полифосфатов и НАД+, имеется на мембране кардиомиоцитов. Тем не менее, практически полностью отсутствуют сведения о влиянии и механизмах действия диаденозиновых полифосфатов на рабочий миокард сердца, проводящую систему сердца, сведения об участии в симпатическом и парасимпатическом контроле работы сердца. Среди диаденозиновых полифосфатов могут присутствовать соединения, оказывающие существенное влияние на сократимость кардиомиоцитов, влияющие на выживание кардиомиоцитов в условиях ишемии, оказывающие действие на ионные токи кардиомиоцитов, и, соответственно, распространение возбуждения в сердечной ткани. Диаденозиновые полифосфаты привлекают в настоящее время внимание, как важный фактор, определяющий изменение сократительной активности, формирование нарушений ритма при повреждении миокарда или нарушении нервной регуляции сердца. Реализация проекта позволит определить возможность практического применения новых эндогенных регуляторов работы сердца при коррекции ишемического повреждения миокарда, коррекции биоэлектрической активности, способствующей возникновению нарушений ритма сердца. В связи с вышесказанным, цель настоящего проекта заключается в выявлении эффектов и изучении механизмов действия определенных диаденозиновых полифосфатов (Аp4A, Аp5A) и их производных (НАД+) на биоэлектрическую и сократительную активность сердца, нервный контроль работы сердца. Ранее подобных исследований не проводилось.

Ожидаемые результаты
Проект направлен на исследование кардиотропной активности и механизмов действия нового класса физиологически активных соединений – диаденозиновых полифосфатов, а также эффектов и механизмов действия в сердце внеклеточного никотинамидаденидинуклеотида (НАД+), рассматриваемого как производное диаденозиновых полифосфатов. В настоящее время физиологическая активность диаденозиновых полифосфатов интенсивно исследуется, предполагается, что эти соединения являются эндогенными нейрогуморальными факторами. Однако, преобладающее количество работ направлено на изучение роли данных соединений в регуляции тонуса и функционирования гладкой мускулатуры. Комплексного исследования эффектов диаденозиновых полифосфатов в сердце ранее не проводилось. В то же время в ряде работ указывается, что в ткани сердца, а также в нервных окончаниях вегетативной нервной системы в значительном количестве содержатся определенные соединения, относящиеся к классу диаденозиновых полифосфатов - это диаденозин тетрафосфат (Ар4А) и диаденозин пентафосфат. В настоящее время показано, что никотинамидадениндинуклеотид (НАД+) может рассматриваться как нейромедиатор, и содержится в нервных окончаниях иннервирующих различные отделы сердца. В связи с вышесказанным, в ходе выполнения проекта планируется впервые исследовать прямое влияние внеклеточного (экзогенного) диаденозин тетрафосфата (Ар4А), диаденозин пентафосфата (Ар5А) и НАД+ на сократительную и биоэлектрическую активность сердца, будет предпринята попытка выяснить рецепторы-мишени для вышеуказанных соединений, определить внутриклеточные механизмы передачи сигнала, а также ионные токи кардиомиоцитов, на которые оказывают влияние, в конечном итоге Ар4А, Ар5А и НАД+. Исследование роли диаденозиновых полифосфатов и их производных в регуляции работы сердца будет проводится на органном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. Для решения данной задачи на уровне целого сердца будет использована методика перфузии изолированного сердца крысы по Лангендорфу, позволяющая оценить изменение сократительной активности желудочкового миокарда при действии Ар4А, Ар5А, НАД+. В ходе данных экспериментов будут определены индексы сократимости миокарда, индексы, отражающие работу, выполняемую сердцем, характер развития диастолы. Впервые будет изучено влияние Ар4А, Ар5А, НАД+ на скорость проведения возбуждения в рабочем миокарде и проводящей системе сердца млекопитающих. С помощью методики перфузии изолированного сердца крысы будет оценено влияние Ар4А, Ар5А, НАД+ на проведение возбуждения в атрио-вентрикулярном узле, иными словами – на величину атриовентрикулярной задержки. В следующей части работы предполагается исследовать влияние вышеуказанных соединений на «локальную» биоэлектрическую активность. Будет изучено влияние диаденозиновых полифосфатов и НАД+ на потенциалы действия (ПД) миокарда млекопитающих. Будет оценено влияние Ар4А, Ар5А, НАД+ на скорость фронта, длительность потенциалов действия, рефрактерность в миокарде левого и правого предсердия, легочных венах, желудочковом миокарде и миокарде межпредсердной перегородки. Для решения данной задачи будет использована микроэлектродная техника, регистрация ПД будет проводится с использованием изолированных многоклеточных препаратов миокарда. В результате выполнения данных экспериментов будут получены данные о чувствительности различных отделов сердца к диаденозиновым полифосфатам и НАД+. Следует особо отметить, что в ходе выполнения проекта впервые будет изучено влияние вышеуказанных соединений на аритмогенный субстрат, которым является миокард легочных вен (Haissaguerre M., Jais P., Shah D.C. N. Engl. J. Med. 339 : 659–666. 1998). Влияние Ар4А, Ар5А, НАД+ на биоэлектрическую активность легочных вен будет оцениваться в нормальных условиях, а также при альфа-адренергической стимуляции, приводящей к индукции автоматической активности в данной ткани. Полученные данные позволят оценить потенциальную про- или антиаритмогенную активность диаденозиновых нуклеотидов и их производных. Помимо выяснения возможного действия исследуемых соединений на потенциальные очаги аномальной активности, предполагается с помощью микроэлектродной техники выявить влияние Ар4А, Ар5А, НАД+ на ритм и биоэлектрическую активность синоатриального узла млекопитающих. Будет оценено изменение скорости фронта пейсмекерных ПД, скорости медленной диастолической деполяризации, максимального диастолического потенциала, длительности ПД при действии вышеуказанных соединений. Наконец, впервые будет проведено исследование влияния диаденозиновых полифосфатов и НАД+ на биоэлектрическую активность элементов проводящей системы сердца. Для этого будет проведена серия экспериментов с внутриклеточной регистрацией ПД в свободных волокнах Пуркинье. Выполнение данных экспериментов возможно только с использованием препаратов, выделенных из сердца кролика. Будет определено влияние Ар4А, Ар5А, НАД+ на конфигурацию ПД, способность к автоматии, а также интенсивность и тяжесть аритмогенных постдеполяризаций, вызванных адренергической стимуляцией в волокнах Пуркинье. Поскольку электрическая активность миокарда определяется ионными токами в кардиомиоцитах, на следующем этапе выполнения проекта предполагается исследовать ионные механизмы действия диаденозиновых полифосфатов и НАД+ в сердце с помощью техники фиксации потенциала patch-clamp в конфигурации whole-cell. Для этого будет исследовано влияние Ар4А, Ар5А, НАД+ на все известные основные калиевые токи (IKr, IKs, IKur, Ito, IK1, IKATP, IKACh), кальциевые токи (ICaL, ICaT), быстрый натриевый ток (INa), а также ток натрий-кальциевого обменника (INCX) в изолированных предсердных и желудочковых кардиомиоцитах. Поскольку наиболее часто используемые в электрофизиологических экспериментах виды лабораторных животных различаются по набору экспрессируемых в кардиомиоцитах ионных каналов, предполагается использовать как минимум два вида: мышь или крысу (выраженные ультрабыстрый и транзиторный калиевый токи, но отсутствуют быстрый и медленный калиевые токи задержанного выпрямления), а также морскую свинку или кролика (напротив, быстрый и медленный токи задержанного выпрямления выражены сильно). Ранее подобных исследований не проводилось. Показано, что Ар4А, Ар5А, НАД+ содержатся в синаптических везикулах симпатических постганглинаров, а также высвобождаются при возбуждении и стимуляции нервных волокон, и таким образом могут принимать участие в нервном контроле работы сердца. Для изучения вклада эндогенных Ар4А, Ар5А, НАД+ в опосредование нервной регуляции работы сердца будет применено несколько подходов. Во-первых, с помощью микроэлектродной техники в изолированных многоклеточных препаратах правого предсердия кролика, включающего синоатриальный узел, будет проводится регистрация изменений электрической активности пейсмекера, развивающихся при высокочастотной стимуляции интрамуральных нервов в норме и на фоне действия блокаторов пуриновых рецепторов, адренорецепторов и мускариновых холинорецепторов. Как известно, пейсмекер сердца обладает повышенной плотностью холинергической и адренергической иннервации, поэтому именно в таких экспериментах есть возможность зарегистрировать максимальные эффекты стимуляции внутрисердечных нервов. Следующая серия экспериментов будет проводиться по такому же протоколу, но с использованием многоклеточных препаратов, полученных у животных, которым будет предварительно внутривенно введен резерпин, обеспечивающий опустошение депо катехоламинов в симпатических окончаниях. Данные эксперименты позволят выявить роль диаденозиновых полифосфатов и НАД+ как комедиаторов в симпатических волокнах сердца в условиях отсутствия норадреналина в синаптических везикулах. Согласно современным литературным данным, по меньшей мере некоторые из эффектов диаденозиновых полифосфатов реализуются посредством активации мембранных рецепторов пуриновых нуклеотидов (пуринорецепторов). В ходе выполнения проекта будет предпринята попытка выяснить рецепторные механизмы действия Ар4А, Ар5А, НАД+ в сердце. Для этого в экспериментах с внутриклеточной регистрацией биоэлектрической активности в различных отделах сердца будет использован ряд блокаторов пуринорецепторов Р1, Р2Х и Р2Y подтипа. Также будут проведены эксперименты, направленные на определение внутриклеточных посредников (фосфолипаз), связанных с пуринорецепторами и участвующих в реализации влияния Ар4А, Ар5А, НАД+ на биоэлктрическую и сократительную активность сердца. После идентификации специфических пуриновых рецепторов, ответственных за реализацию эффектов Ар4А, Ар5А, НАД+ методом RT-PCR будет проведена оценка уровня транскрипции мРНК данных рецепторов в различных отделах сердца млекопитающих. На основе работ по проекту предполагается подготовка и публикация одной монографии и четырнадцати статей в индексируемых научных журналах.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Цель данного этапа проекта заключалась в выявлении эффектов Ар4А, Ар5А и НАД+ на сократительную активность сердца млекопитающего, получении детальных данных о влиянии вышеуказанных соединений на биоэлектрическую активность в различных отделах рабочего миокарда сердца, а также изучения их действия на ионные трансмембранные токи, относящиеся к группе аномального выпрямления, на натриевый ток, формирующий фронт потенциала действия в рабочем миокарде. Для достижения поставленных целей применяли методику ретроградной перфузии изолированного сердца в различных модификациях, которые позволяли оценить влияние исследуемых соединений на ритм работы сердца, сократимость миокарда, прочие параметры. С помощью стандартной микроэлектродной техники регистрировали потенциалы действия (ПД) и оценивали рефрактерность в изолированных перфузируемых многоклеточных препаратах рабочего миокарда левого и правого предсердия, межпредсердной перегородки и желудочкового миокарда. На основе микроэлектродных записей рассчитывали длительность потенциалов действия (ДПД90%), длительность рефрактерных периодов (РП), скорость нарастания фронта ПД в ходе действия Ар4А, Ар5А и НАД+. Технику фиксации потенциала применяли для определения влияния диаденозиновых полифосфатов и НАД+ на быстрый натриевый потенциалзависимый ток (INa), калиевый ток аномального выпрямления IK1, калиевый АТФ-зависимый ток (IKATP), калиевый ацетилхолинзависимый ток (IKACh) в изолированных желудочковых и предсердных кардиомиоцитах. В ходе выполнения этапа проекта получены следующие результаты. Впервые показано, что Ар4А, Ар5А и НАД+ оказывают существенное влияние на сократительную активность сердца млекопитающего. Основными эффектами, связанными с прямым действием соединений на миокард, являются снижение сократимости, а также увеличение скорости расслабления желудочкового миокарда. В ходе экспериментов впервые было установлено, что Ар4А, Ар5А в высокой концентрации способны вызывать снижение коронарного протока, вероятно за счет, сужения просвета сосудов сердца. Впервые продемонстрировано, что Ар4А, Ар5А и НАД+ вызывают снижение длительности ПД и рефрактерного периода в рабочем миокарде правого предсердия, левого предсердия, межпредсердной перегородке, желудочковом миокарде. Наибольшей чувствительностью к диаденозиновым полифосфатам и НАД+ обладает желудочковый миокард. Установлено, что Ар4А, Ар5А и НАД+ не оказывают влияния на скорость нарастания фронта ПД ни в одном из вышеперечисленных отделов рабочего миокарда. Впервые поведено изучение действия экзогенных внеклеточных полифосфатов и НАД+ на отдельные ионные токи кардиомиоцитов. Показано, что Ар4А, Ар5А и НАД+ не оказывали влияния на быстрый натриевый ток (INa), базальный калиевый ток входящего выпрямления IK1, ацетилхолинзависимый калиевый ток IKACh. Однако, диаденозин пентафосфат вызывал подавление предварительно индуцированного ингибитором окислительного фосфорилирования АТФ-зависимого калиевого тока. Полученные в ходе выполнения первого этапа проекта данные позволяют сделать вывод о том, что диаденозиновые полифосфаты и их производные обладают самостоятельным прямым действием на желудочковый и предсердный миокард. Они вызывают изменение механической активности сердца, биоэлектрической активности различных отделов рабочего миокарда, а также способны влиять на отдельные ионные токи, формирующие биоэлектрическую активность кардиомиоцитов. Помимо прочего, диаденозиновые полифосфаты могут оказывать непрямое влияние на работу сердца, вызывая уменьшение коронарного кровотока.

Публикации

1. Абрамочкин Д.В., Тапилина С.В. Различия в чувствительности миокарда новорожденных и взрослых крыс к избирательной стимуляции М3-холинорецепторов Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Т.159, №1, С.11-14 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1007/s10517-015-2876-y

2. Кузьмин В.С., Абрамов А.А., Егоров Ю.В., Розенштраух Л.В. Влияние гипотермии на рефрактерность в желудочковом миокарде якутского суслика Citellus undulatus Российский физиологический журнал имени И.М.Сеченова, Том 100, №12, С.1399-1408 (год публикации - 2014)

3. Кузьмин В.С., Егоров Ю.В., Каримова В.М., Розенштраух Л.В. Оценка константы длины в предсердном миокарде и миокардиальной обкладке легочных вен млекопитающих Доклады Академии Наук, том 460, № 3, с. 359-363 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1134/S0012496615010093

4. Пустовит К.Б., Кузьмин В.С., Сухова Г.С. Влияние внеклеточного никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) на биоэлектрическую активность пейсмекера и проводящей системы сердца Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Т.159, №2, С.144-147 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1007/s10517-015-2919-4

5. Kuzmin V.S., Egorov Y.V. Electrical propagation in the various sites of the pulmonary veins of mammalian Acta Physiologica, Vol. 211(s697), P.10 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1111/apha.12361

6. Poustovit K.B., Kuzmin V.S., Abramochkin D.V. Exogenous nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+): effects and mechanisms of action on the mammalian heart Acta Physiologica, Vol. 211(s697), P.80 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1111/apha.12362

7. Каримова В.М., Кузьмин В.С. Conduction of excitation in the rat atria and pulmonary veins under normal condition and after octanol application Acta Physiologica, Vol.211 (s697), P.100 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1111/apha.12362

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В 2015 году были проведены эксперименты на изолированном сердце крысы, перфузируемом по Лангендорфу, с целью определения влияния диаденозиновых полифосфатов (Ар4А, Ар5А) и никотинамидадениндинуклеотида (НАД+) на проведение возбуждения в атриовентрикулярном узле и рабочем миокарде. Установлено, что Ар4А, Ар5А, НАД+ в концентрации 10-100 мкМ вызывают значимое замедление атриовентрикулярного проведения в изолированном сердце крысы, но не влияют на скорость проведения возбуждения в желудочках. Впервые показано, что Ар4А, Ар5А и НАД+ оказывают существенное проаритмическое влияние на сердце за счет воздействия на миокардиальные элементы легочных вен млекопитающих. Методом внутриклеточной регистрации электрической активности с помощью стеклянных микроэлектродов было исследовано действие Ар4А, Ар5А, НАД+ на конфигурацию вызванных потенциалов действия, а также на уровень потенциала покоя в отсутствие электрической активности, в миокарде легочных вен крысы. Кроме того было изучено влияние этих соединений на характер спонтанной активности в легочных венах, вызванной адренергической стимуляцией. Все три соединения существенно укорачивают вызванные электростимуляцией потенциалы действия (ПД) в легочных венах крысы, а в отсутствие электрической активности гиперполяризуют кардиомиоциты. Кроме того, Ар4А, Ар5А и НАД+ ускоряют автоматическую аритмогенную активность, вызванную норадреналином в миокарде легочных вен. На следующем этапе исследования мы изучили действие диаденозиновых полифосфатов и НАД+ не на аномальную эктопическую автоматию, а на нормальную пейсмекерную активность. Нами впервые были описаны эффекты этих соединений в пейсмекере сердца, синоатриальном узле (САУ), млекопитающих на примере морской свинки. Все три вещества в концентрации 100 мкМ вызывают существенное замедление ритма, обусловленное снижением скорости медленной диастолической деполяризации, и сопровождаемое также увеличением скорости фронта нарастания ПД и уменьшением длительности ПД. В концентрации 10 мкМ вещества вызывали сопутствующие эффекты без достоверного замедления ритма. Полученные на пейсмекере морской свинки результаты побудили нас провести аналогичные эксперименты на препаратах рабочего предсердного миокарда этого животного, в которых была показана способность исследуемых соединений укорачивать ПД. Поэтому в следующей части работы был выяснен механизм эффектов Ар4А, Ар5А и НАД+ в суправентрикулярном миокарде морской свинки. Оказалось, что у свинки эффекты веществ реализуются через Р1-рецепторы и последующую активацию калиевого ацетилхолинзависимого тока, продемонстрированную нами в пэтч-кламп экспериментах с предсердными кардиомиоцитами. В 2015 году было продолжено изучение ионных механизмов электрофизиологических эффектов диаденозиновых полифосфатов и НАД+ в миокарде. Методом пэтч-кламп исследовалось вероятное действие соединений на калиевые токи IKur и Ito в кардиомиоцитах крысы и IKs и IKr в кардиомиоцитах морской свинки, поскольку у крысы эти токи отсутствуют. Как калиевые токи задержанного выпрямления (IKr, IKs, и IKur), так и транзиторный калиевый ток оказались нечувствительны к исследуемым соединениям даже в высокой концентрации 100 мкМ. Также в истекшем году мы начали проверку возможности участия диаденозиновых полифосфатов и НАД+ в регуляции нервных влияний на сердце на примере синоатриального узла кролика, имеющего плотную адренергическую и холинергическую иннервацию. Показано, что Ар4А, Ар5А и НАД+ снижают электрофизиологический эффект стимуляции симпатических нервов в синоатриальном узле кролика, но не влияют на эффект стимуляции парасимпатических нервов. Наконец, нам удалось в значительной степени раскрыть рецепторные механизмы эффектов диаденозиновых полифосфатов и НАД+ в миокарде крысы, которые оказались значительно сложнее, чем в сердце морской свинки. Для решения данной задачи были использованы многоклеточные препараты левого предсердия крысы, а также следующие блокаторы пуриновых рецепторов: DPCPX - блокатор пуриновых рецепторов Р1 типа; сурамин, PPADS - блокаторы пуриновых рецепторов Р2 типа; iso-PPADS, Evans Blue - блокаторы рецепторов Р2Х-подтипа; coomassie G-250 - соединение, рассматриваемое как блокатор рецепторов P2X7 подтипа; NF340 - блокатор рецепторов P2Y11 подтипа. Показано, что в миокарде крысы эффекты Ар4А, Ар5А и НАД+ реализуются посредством активации Р2 пуринорецепторов, причем задействованы представители как группы Р2Х, так и группы Р2Y. Среди них наиболее вероятными кандидатами на роль посредника полифосфатов и НАД+ являются Р2Х7 и Р2Y11 рецепторы.

Публикации

1. Абрамочкин Д.В., Кузьмин В.С., Розенштраух Л.В. Effects of new class III antiarrhythmic drug niferidil on electrical activity in murine ventricular myocardium and their ionic mechanisms Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology, V. 388(10), P. 1105-1112 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1007/s00210-015-1146-x

2. Абрамочкин Д.В., Пустовит К.Б., Филатова Т.С. Действие диаденозиновых полифосфатов на калиевые токи входящего выпрямления в кардиомиоцитах крысы Вестник Московского университета. Серия 16. Биология., №4, С. 3-7 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.3103/S0096392515040021

3. Богус С.К., Абрамочкин Д.В., Галенко-Ярошевский П.А., Суздалев К.Ф. Effects of a new antiarrhythmic drug SS-68 on electrical activity in working atrial and ventricular myocardium of mouse and their ionic mechanisms Journal of Pharmacological Sciences, V. 128(4), P. 202-207 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1016/j.jphs.2015.07.020

4. Пустовит К.Б., Абрамочкин Д.В. Действие никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) и диаденозинтетрафосфата (Ар4А) на электрическую активность рабочего и пейсмекерного предсердного миокарда морской свинки Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Т. 160(12), С. 693-697 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1007/s10517-016-3297-2

5. Пустовит К.Б., Кузьмин В.С., Абрамочкин Д.В. Diadenosine tetra- and pentaphosphates affect contractility and bioelectrical activity in the rat heart via P2 purinergic receptors Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology, V. 389, № 3, P. 303-313 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1007/s00210-015-1199-x

6. Каримова В.М., Кузьмин В.С. Adrenergic regulation of bioelectrical activity of rat pulmonary veins myocardium Acta Physiologica, V. 215(S705), P. 66 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1111/apha.12626

7. Пустовит К.Б., Кузьмин В.С., Абрамочкин Д.В. Effects of diadenosine polyphosphates on bioelectrical and contractile activity of the rat heart Acta Physiologica, V. 215(S705), P. 63 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1111/apha.12626

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 году было проведено исследование влияния диаденозин пентафосфата (Ар5А), диаденозин тетрафосфата (Ар4А) и никотинамидадениндинулеотида (НАД+) на характеристики биоэлектрической активности волокон Пуркинье млекопитающих. Волокна Пуркинье являются компонентом проводящей системы желудочков сердца. В отличие от других частей проводящей системы, пучка Гиса и его левой и правой ножек, волокна Пуркинье сравнительно легко можно изолировать и затем исследовать в электрофизиологическом эксперименте, если сердце имеет достаточно крупный размер. Сердце кролика идеально подходит для этой цели. Мы изучили действие Ар5А, Ар4А и НАД+ на электрическую активность в препаратах волокон Пуркинье кролика, работавших в фиксированном навязанном ритме (это соответствует их работе в нормальных, физиологических условиях), а также их эффекты в спонтанно возбуждающихся волокнах Пуркинье. Оказалось, что все 3 соединения уменьшают длительность вызванных потенциалов действия в изолированных волокнах Пуркинье, а также тормозят их собственную автоматическую активность как в норме, так и на фоне адренергической стимуляции. Также в прошедшем году было продолжено выяснение ионных механизмов кардиотропных эффектов диаденозиновых полифосфатов и НАД+. Мы оценили действие этих соединений на кальциевый ток L-типа и ток натрий-кальциевого обменника в желудочковых кардиомиоцитах крысы. Оказалось, что Ар5А (10, 100 мкМ) снижает пиковую амплитуду кальциевого тока L-типа в кардиомиоцитах крысы не влияя на форму его вольт-амперной зависимости. Ар4А и НАД+ не вызывают аналогичных статистически достоверных эффектов. Диаденозиновые полифосфаты и НАД+ не влияют как на входящую, так и на выходящую компоненты тока натрий-кальциевого обменника. В 2016 году мы завершили исследование модуляции диаденозиновыми полифосфатами и НАД+ эффектов внутрисердечных холинергических и адренергических нервов. У предварительно резерпинизированных кроликов, то есть животных с опустошенным депо катехоламинов, диаденозиновые полифосфаты и НАД+ не влияют на эффект стимуляции интрамуральных нервов в синоатриальном узле. В 2016 году была скорректирована оценка влияния диаденозиновых полифосфатов на эффекты активации симпатических нервов – на фоне 10 мкМ Ар4А и Ар5А положительный хронотропный эффект стимуляции нервов слабее, чем в контроле, на 43,7% и 37,8%, соответственно. Итак, диаденозиновые полифосфаты и НАД+ подавляют эффекты адренергических нервов, но не влияют на действие активированных холинергических волокон. Наконец была проведена оценка уровня экспрессии генов преобладающих в сердце крысы подтипов Р2Х и P2Y-пуринорецепторов, которые по данным, полученным в 2015 году, играют основную роль в опосредовании эффектов диаденозиновых полифосфатов и НАД+. Количество мРНК Р2Х7-пуринорецепторов составляет 3,16 ± 1,23 отн. ед. в предсердном миокарде крысы и 0,31 ± 0,07 отн. ед. в желудочковом. Количество мРНК Р2Y1-пуринорецепторов составляет 3,19 ± 0,77 отн. ед. в предсердном миокарде крысы и 0,36 ± 0,1 отн. ед. в желудочковом. Итак, гены обоих подтипов пуринорецепторов экспрессируются как в предсердном, так и, в значительно меньшей степени, в желудочковом миокарде крысы.

Публикации

1. Абрамочкин Д.В., Пустовит К.Б., Кузьмин В.С. Диаденозиновые полифосфаты подавляют эффекты стимуляции симпатических нервов в пейсмекере сердца кролика Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2017)

2. Абрамочкин Д.В., Филатова Т.С., Каримова В.М., Камкин А. Diadenosine pentaphosphate affects electrical activity in guinea pig atrium via activation of potassium acetylcholine-dependent inward rectifier The Journal of Physiological Sciences, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1007/s12576-016-0510-z

3. Каримова В.М., Пустовит К.Б., Абрамочкин Д.В., Кузьмин В.С. Влияние пуриновых комедиаторов на автоматическую активность, вызванную норадреналином в миокардиальных рукавах легочных вен Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Т.162, №11, С.536-541 (год публикации - 2016)

4. Кузьмин В.С., Пустовит К.Б., Абрамочкин Д.В. Effects of exogenous nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) in the rat heart are mediated by P2 purine receptors Journal of biomedical science, V.23:50, P.1-11 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1186/s12929-016-0267-y

5. Пахомов Н.В., Пустовит К.Б., Абрамочкин Д.В., Кузьмин В.С. Роль диаденозин-пентафосфата и никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) как потенциальных нуклеотидных комедиаторов в адренергической регуляции работы сердца Нейрохимия, Т.34, №1, С.1-10 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.7868/S1027813317010113

6. Хаверинен Я., Абрамочкин Д.В., Камкин А., Ворнанен М. The maximum heart rate in brown trout (Salmo trutta fario) is not limited by firing rate of pacemaker cells American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1152/ajpregu.00403.2016

7. Кузьмин В.С., Пустовит К.Б. Эффекты и механизмы действия диаденозиновых полифосфатов и их производных в сердце млекопитающих Эффекты и механизмы действия диаденозиновых полифосфатов и их производных в сердце млекопитающих : монография / В.С. Кузьмин, К.Б. Пустовит. – М. : Университетская книга, Эффекты и механизмы действия диаденозиновых полифосфатов и их производных в сердце млекопитающих : монография / В.С. Кузьмин, К.Б. Пустовит. – М. : Университетская книга, 2016. – 116 с. : табл., ил. (год публикации - 2016)

Возможность практического использования результатов
не указано