Аннотация результатов, полученных в 2014 году
На данном этапе, во-первых, расширена выборка образцов РМЖ и РЯ – в рамках договора с РОНЦ собрано дополнительно 150 образцов РМЖ и РЯ. С использованием комплекса методов (МЧРА, бисульфитной конверсии с последующей МС-ПЦР и в ряде случаев бисульфитного секвенирования) исследовано изменение статуса метилирования 8 генов короткого плеча хромосомы 3 (RASSF1A, RARB2, SEMA3B, RHOA, DAG1, NKIRAS1, USP4, GPX1) на представительных выборках опухолей больных РМЖ (69-130 случаев) и РЯ (22-71 случаев). Изменение уровня мРНК определено для тех же восьми генов хромосомы 3 на выборках тех же образцов, включая 40-58 случаев РМЖ и 18-22 случая РЯ. В исследованиях применен метод обратной транскрипции с последующей полуколичественной и/или количественной ПЦР. Статистический анализ результатов выполнен с применением точного теста Фишера и непараметрической статистики с применением критерия ранговой корреляции Спирмана и t-теста Стьюдента. Показано гиперметилирование генов RASSF1A, RARB2, SEMA3B, и MGMT (P<10-3 по Фишеру) при РМЖ и РЯ, что указывает на супрессорные функции этих генов в опухолях. У генов NKIRAS1 и RHOA с учетом данных для доноров показано деметилирование этих генов при РМЖ (P < 0.05 по Фишеру) и на уровне выраженной тенденции – при РЯ, что указывает на функции онкогенов. Показано более частое подавление экспрессии гена SEMA3B, ассоциированное с гиперметилированием. К опухоль-специфичным по данным экспрессии можно предположительно отнести ген DAG1, который чаще повышает уровень мРНК при РМЖ, и чаще снижает экспрессию при РЯ. К тому же этот ген с высокой частотой гиперметилирован (50% против 9%) именно при РЯ (p=0.007), а при РМЖ частота метилирования этого гена возрастает только от 16% к 25%. К опухоль-специфичным можно отнести также ген GPX1, который при РМЖ повышает частоту метилирования от 6 до 28% (p=0.001), но практически не метилирован ни в опухоле РЯ, ни в условной норме больных РЯ, ни в ДНК донора без онкопатологии в анамнезе. Однако наиболее аномальные изменения наблюдаются у одних и тех же генов RASSF1A, RARB2, SEMA3B, NKIRAS1, RHOA, как при РМЖ, так и при РЯ. Статистически-значимые корреляции по Спирману между изменениями экспрессии и структурными изменениями, включая изменения метилирования и копийности, при РМЖ - установлены для SEMA3B, RARB2, GPX1, RHOA, NKIRAS1 и DAG1, а при РЯ – только для генов SEMA3B и RARB2, а также с меньшей достоверностью (p=10-6) – для RHOA и NKIRAS1. На данном этапе впервые проведена оценка вклада изменения метилирования в изменение экспрессии для 8 генов хромосомы 3 при РМЖ и РЯ, и показано, что эта величина при РМЖ варьирует от 15,6% (RHOA) до значений 54% (SEMA3B), 65% (RARB2) и 69% (NKIRAS1). При РЯ вклад изменения метилирования в изменение экспрессии составил 40% - у гена SEMA3B (главным образом, в подавление экспрессии); 27% - у гена RASSF1A; и 73% – у гена NKIRAS1. Причем, NKIRAS1 с высокой частотой изменяет экспрессию, например, в 79% случаев РЯ, и в половине случаев - инактивация гена NKIRAS1 связана с гиперметилированием, а в другой половине - активация гена, напротив, связана с деметилированием. Изучение других факторов, участвующих в регуляции NKIRAS1, а также функциональных связей для этого практически неизученного гена – интригующая задача в дальнейших исследованиях. Определены новые диагностические маркеры для выявления РМЖ и РЯ: RHOA (повышенный уровень мРНК), RASSF1A, RARB2, SEMA3B (гиперметилирование), RHOA, NKIRAS1 (деметилирование). Гиперметилирование GPX1 и DAG1 следует проверять на возможность дифференциальной диагностики РМЖ и РЯ. Маркеры метилирования: SEMA3B, NKIRAS1, GPX1 и DAG1 предложены впервые для диагностики женщин, больных РМЖ и/или РЯ. Определены маркеры прогноза РМЖ и РЯ. Метилирование генов RASSF1A, RARB2, SEMA3B и MGMT связано с клинической стадией РМЖ и РЯ; метилирование гена SEMA3B связано с уровнем дифференцировки опухолевых клеток при РЯ; метилирование генов SEMA3B, DAG1 и MGMT связано с образованием метастазов в регионарных лимфоузлах и удаленных органах при РЯ, а гена MGMT – и при РМЖ (Р<0.05). Кроме того, метилирование генов RASSF1A и MGMT можно применять как маркеры предрасположенности к наиболее тяжелой форме РМЖ - трижды негативному РМЖ. Таким образом, на этом первом этапе Проекта нами впервые определены эпигенетические изменения и изменения уровня мРНК в наборе онкозначимых генов на общих коллекциях образцов РМЖ и РЯ и в сравнении с контрольной группой без онкопатологии. Нами дифференцированы эпигенетические изменения и изменения их экспрессии - общие и специфичные для этих двух наиболее распространенных у женщин видов рака. Впервые для этих генов установлены статистически-значимые корреляции между изменениями экспрессии и структурными изменениями, включая изменения метилирования и копийности. Впервые показана двойственная роль метилирования в регуляции экспрессии некоторых генов. Например, в половине образцов наблюдается подавление экспрессии гена NKIRAS1, ассоциированное с метилированием, а в другой половине – активация гена, ассоциированная с деметилированием исследованного участка CpG-островка этого гена. По-видимому, нам удалось локализовать в протяженном CpG-островке этого гена участок, метилирование которого четко связан с уровнем транскрипции гена. Впервые проведена оценка вклада изменения метилирования в изменение экспрессии для этой группы генов хромосомы 3 при РМЖ и РЯ, и показано, что эта величина варьирует от 15,6% (RHOA) до значений 54% (SEMA3B), 65% (RARB2), 69% (NKIRAS1) при РМЖ и до 73% у гена NKIRAS1 при РЯ. В купе эти результаты показывают, что метилирование играет важную роль в активации и/или в подавлении опухоль ассоциированных генов. Но в регуляции экспрессии генов в опухолях могут принимать и другие важные факторы, например, взаимодействие микроРНК с матричной РНК гена-мишени, что явится одной из главных задач в дальнейших исследованиях в рамках данного Проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Цель данного Проекта - исследование эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов в опухолях посредством метилирования их промоторных областей на геномном уровне и взаимодействия микроРНК с 3'-НТО мРНК белоккодирующих генов на пост-транскрипционном уровне. При этом планируется идентификация микроРНК, способных подавлять опухолевый рост, воздействуя на свои гены-мишени. На данном этапе изучены изменения уровня экспрессии и статуса метилирования в опухолях РМЖ и РЯ группы онкозначимых генов, включая гены системы апоптоза APAF1 (Apoptotic protease activating factor 1) и DAPK1 (Death-associated protein kinase); ген регуляции внеклеточного матрикса и адгезии, CHL1 (Close Homolog of L1); антогонист Wnt-пути, SFRP1 (Secreted Frizzled-Related Protein 1); ген регуляции транскрипции HIC1 (hypermethylated in cancer 1); протоонкоген BCL2 (B cell lymphoma/leukemia gene-2), кодирующий внутриклеточный мембраносвязанный белок, блокирующий запрограммированную клеточную гибель (апоптоз); протоонкоген BCL6 (B-cell CLL/lymphoma 6), кодирующий транскрипционный репрессор, стимулирующий эпителиально-мезенхимальный переход, опосредованно подавляя Е-кадхерин. В поиск генов-мишеней были включены также гены RASSF1A и RHOA, исследованные в 2014г. Отобраны 20 микроРНК, предсказанные как потенциально взаимодействующие с мРНК данных генов с использованием 3 или более алгоритмов из 9 программ, содержащихся в miRWalk 2.0 (http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/ index.html) (miRWalk, Microt4, miRanda, miRMap, Pictar2, PITA, RNA22, Targetscan, RNAhybrid). Согласно данным miRWalk 2.0, каждая из 20 микроРНК предсказана как потенциально регуляторная для 3-х или более из исследуемых нами белоккодирующих генов (CHL1, APAF1, DAPK1, SFRP1, HIC1, BCL2, BCL6, RASSF1A, RHOA). На данном этапе расширены выборки образцов РМЖ и РЯ, включая случаи с метастазированием. Тотальная РНК выделена гуанидинизотиоцианат-фенол-хлороформенным методом с дополнительной очисткой от ДНК в модификации автора (Пронина и др., 2012; Pronina et al., 2016). Анализ экспрессии 9 белковых генов (CHL1, APAF1, DAPK1, SFRP1, HIC1, BCL2, BCL6, RASSF1A, RHOA) выполнен ПЦР в реальном времени в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (USA) с использованием B2M в качестве референсного гена. Анализ уровня экспрессии 20 микроРНК (miR-34a, -34b-3p, -34c-3p, -9-5p, -124a, -148a-3p, -132-3p, -137, -17-5p, -191-5p, 127-5p, -129-5p, -125b-5p, -193-5p, -203a, -212-3p, -219a-5p, -24-2-5p, -339-3p, -375) выполнен также методом ПЦР в реальном времени. Использованы сертифицированные наборы фирмы Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific, USA), включая входящие в набор TaqMan® MicroRNA Assays той же фирмы. Амплификацию проводили в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (USA) с применением 2 референсных микроРНК - RNU6B и RNU48. Метилирование промоторных районов генов микроРНК и белоккодирующих генов изучали методом бисульфитной конверсии с последующей метил-специфичной ПЦР. Для некоторых генов, изученных впервые при РМЖ и РЯ (APAF1, MIR-132, MIR-193), результат МС-ПЦР проверяли с помощью секвенирования продукта МС-ПЦР. Исследования выполнены на представительных выборках образцов РМЖ (28-40 T/N) и РЯ (20 T/N). Получены следующие результаты: По данным МС-ПЦР частоты гиперметилирования в первичных опухолях РМЖ и РЯ составили: APAF1 – 50%, 55%; DAPK1 – 40%, 45%; CHL1 – 30%, 35%; SFRP1 – 60%, 55%; HIC1 – 65%, 55%, соответственно. Метилирование гена APAF1 изучено нами при РМЖ и РЯ впервые. Для образцов РМЖ показано значимое снижение уровня экспрессии для CHL1 (p≤0.001) и DAPK1 (p≤0.05), а значимое повышение – для BCL2 (p=0.0015), BCL6 (p≤0.05) и RASSF1(A) (p≤0.05). Для образцов РЯ также обнаружено преобладание случаев с пониженной экспрессией генов CHL1 и DAPK1 и с повышенным уровнем мРНК у генов BCL2, BCL6 и RASSF1(A) (p≤0.05). Значимая корреляция по Спирмену между изменением статуса метилирования и уровнем мРНК в опухолях определена при РМЖ для APAF1, RASSF1(A) и DAPK1 (Rs=0.62-0.76, p=0.011-0.055). Для образцов РЯ корреляции выявлены для тех же генов APAF1, RASSF1(A) и DAPK1, значения коэффициентов корреляции изменялись в интервале Rs: 0.3-0.5 при значимости p: 0.05. Полученные результаты соответствуют представлениям об онкосупрессорной функции CHL1 и DAPK1 и онкогенной функции BCL2, BCL6. Для RASSF1(A) и APAF1 отмечены двойственные свойства – частое гиперметилирование и преобладание образцов опухолей с повышенной экспрессией. В группе с нашим участием (Kashuba et al., 2009) выявлена гипермутабельность RASSF1(A) в эпителиальных опухолях разных локализаций. По-видимому, высокая частота мутаций RASSF1(A) запускает его онкогенные свойства, как это ранее обнаружено для гена P53. Для образцов РМЖ показано снижение уровня экспрессии следующих 10 микроРНК: (miR-124a, -125b-5p, -129-5p, -132-3p, -193а-5p, -34b-3p, -212-3p, -127-5p, -17-5p, -24-2-5p) (p≤0.05 по Фишеру). Также, для двух микроРНК - miR-191-5р и miR-375 показано повышение уровня экспрессии. При этом показано значимое (по Фишеру) увеличение частоты метилирования (в опухолях против условной нормы) следующих 11 генов микроРНК: MIR-124a-1, MIR-125b-1, MIR-129-2, MIR-132, MIR-137, MIR-193a, MIR-34b/c, MIR-9-1, MIR-9-3 и MIR-1258. Следует отметить, что изменение статуса метилирования 7 генов MIR-129-2, -132, -193a, -191, -130b, -107, -1258 в настоящей работе показано при РМЖ впервые. Сопоставление этих данных позволило выявить значимые положительные корреляции для 11 микроРНК: miR-125b-5p, -148a-3p, -129-5p, -132-3p, -193а-5p, -34b-3p, -34c-3p, -203a, -375, -9-5p, -191-5p. Коэффициенты корреляции по Спирмену Rs~0.55-0.93, p≤0.001. Для образцов РЯ значимые положительные корреляции определены для 6 микроРНК: miR-125b-5p, -129-5p, -132-3p, -137, -193а-5p, -203a; Rs~0.4-0.6, p≤0.05. Гены 5 микроРНК: miR-125b-5p, -129-5p, -132-3p, -193а-5p, -203a регулируются посредством метилирования в обоих изученных видах рака. Эти результаты показывают значимую роль метилирования в регуляции экспрессии ряда генов микроРНК при этих видах рака у женщин. На эту тему имеются публикации, но они касаются только нескольких микроРНК, например, miR-125b, -148a, -34. Основные результаты получены нами впервые. Для образцов РМЖ и РЯ сопоставлены данные по изменению экспрессии 9 белоккодирующих генов, с данными по изменению уровня экспрессии 20 микроРНК. Так, выявлены отрицательные корреляции по Спирмену для следующих пар: miR-129-5р – RASSF1(A), miR-129-5р – DAPK1, miR-375 – RHOA, miR-203а – APAF1, miR-219а-5р – APAF1 (Rs= -0.44 – -0.50, p=0.01-0.03, FDR=0.05) при РМЖ. Выявленные обратные зависимости по экспрессии в первичных опухолях РМЖ и РЯ позволяют предполагать прямое или опосредованное взаимодействие между микроРНК и мРНК в этих парах. Однако полученные результаты носят предварительный характер и требуется их валидация на расширенных выборках образцов. Для верификации предположения о прямом связывании микроРНК с мРНК требуется также функциональное подтверждение на клеточных культурах. Проведение таких экспериментов запланировано в рамках данного Проекта в 2016г. Кроме того, выявленные в данной работе гены с наиболее частыми аномальными изменениями статуса метилирования или уровня экспрессии могут быть использованы для разработки диагностических и прогностических маркёров и систем маркёров.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Цель данного Проекта - исследование многоуровневых механизмов регуляции экспрессии генов в опухолях: метилирование промоторных областей белок-кодирующих генов на геномном уровне, взаимодействие микроРНК с 3'-НТО мРНК белок-кодирующих генов на пост-транскрипционном уровне, а также роль метилирования генов микроРНК в подавлении их способности к регуляции генов-мишений и связанных с ними процессов. Исследования проводились на клинических образцах рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ), а также на клеточной линии РМЖ MCF7. Помимо фундаментальных вопросов в задачи Проекта входило выявление новых перспективных биомаркеров для диагностики и прогноза РМЖ и РЯ и мишеней для таргетной терапии. На этапе 2016г построены профили экспрессии и метилирования суммарно 15 онкозначимых белок-кодирующих генов, предсказанных как гены-мишени для 20 исследуемых микроРНК. Эти 15 генов включали 7 генов, частично исследованных ранее (APAF1, DAPK1, BCL2, RASSF1A, CHL1, RHOA, BCL6), и 8 новых генов, отобранных с помощью расчетов корреляций с применением оригинального алгоритма (CrossHub, Krasnov et al., 2016). Этот алгоритм основан на данных ресурса TCGA c наложением данных предсказательных (TargetScan, DIANA microT, mirSVR, PicTar) и экспериментальной (miRTarBase) баз данных по микроРНК-мРНК взаимодействию. Расчет позволил определить от 2 до 10 потенциальных мишеней для каждой из 20 микроРНК, исследуемых в данном проекте. Среди пула мишеней были отобраны 8 генов, для которых предсказаны взаимодействия с наибольшим числом (не менее 10) исследуемых микроРНК. К вновь отобранным генам относятся: CCND1, (Cyclin D1), регулирующий клеточный цикл в фазе G1/S; онкозначимый транскрипционный фактор NF1B (Nuclear factor 1 B-type), многофункциональный TGFB2 (Transforming growth factor beta 2), вовлеченный в регуляцию апоптоза, клеточного цикла и пролиферации; ACSL1, ацил-КоА-синтетаза 1 (acyl-CoA synthetase-1); AURKA (Aurora kinase A, или serine/threonine-protein kinase 6), регулирующий p53/TP53-путь; c-MYC (v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), активирующий транскрипцию множества генов; SNAI2 (snail family transcriptional repressor 2), подавляющий апоптоз, ингибирующий транскрипцию Е-кадгерина и участвующий в эпителиально-мезенхимальном переходе; AXL(AXL receptor tyrosine kinase), участвующий в процессах миграции клеток. Профиль экспрессии 15 белок-кодирующих генов исследован методом ПЦР в реальном времени на представительной выборке РМЖ (40 парных образцов, опухоль/норма) и в 25 образцах РЯ. При РМЖ значимо частое (р<0.01, по Фишеру) преобладание снижения экспрессии показано для 10 генов: RASSF1(A) (30/41, 73%), RHOA (23/41, 56%), CHL1 (31/41, 76% ), APAF1 (22/41, 54%), DAPK1 (24/41, 58%), NF1B (28/41, 68%), TGFB2 (35/41, 85%), ACSL1 (23/39, 59%), AURKA (24/36, 67%), c-MYC (21/36, 58%); значимо частое повышение экспрессии выявлено для 4 генов: BCL2 (21/41, 51%), CCND1 (23/41, 56%), BCL6 (20/39, 51%), AXL (19/36, 53%); дифференциальная экспрессия показана для SNAI2 (снижение 16/36, 44% против повышение 12/36, 33%). При РЯ к "даун-регулируемым" отнесены 5 генов: RASSF1(A) (12/25, 48%), APAF1 (10/25, 40%), DAPK1 (9/25, 36%), NF1B (12/25, 48%), ACSL1 (12/25, 48%). К генам с повышением экспрессии при РЯ отнесены: BCL2 (10/25, 40%), CCND1 (15/25, 75%), BCL6 (12/25, 48%), SNAI2 (14/25, 56%), AXL (13/25, 52%), CHL1 (11/25, 44%) и TGFB2 (10/25, 40%), а 3 гена дифференциально изменяли экспрессию: RHOA (10/25, 40% против 5/25, 20%), AURKA (10/25, 40% против 8/25, 32% ), c-MYC (10/25, 40% против 5/25, 20%). Анализ метилирования промоторных CpG-островков 9 генов: RASSF1(A), RHOA, BCL2, CHL1, APAF1, DAPK1, CCND1, NF1B, BCL6, выполненный методом МС-ПЦР и МС-ПЦР в реальном времени на выборках РМЖ (40 парных (опухоль/норма) образцов ДНК) и рака яичников (25 парных образцов ДНК) позволил выявить гены, со значимо высокой частотой изменяющие статус метилирования. Гиперметилирование преобладало у 5 генов (RASSF1(A), CHL1, APAF1, DAPK1, NF1B) в 30-55% образцов, а у генов RHOA, BCL2, BCL6 и CCND1 преобладало деметилирование в 25-35% образцов. Для 5 генов RASSF1(A), APAF1, DAPK1, BCL2 и BCL6 показана высоко-значимая корреляция между изменениями статуса метилирования и уровня экспрессии при РМЖ, коэффициент корреляции Спирмена (Rs) составил 0.3-0.5, р<0.01; p<0.001. Причем, главным образом, гиперметилирование вносит вклад в подавление экспрессии генов RASSF1(A), APAF1, DAPK1, деметилирование, характерное для BCL2 и BCL6, ассоциировано с повышенным уровнем мРНК этих генов. Эти данные указывают на важную роль метилирования в регуляции генов RASSF1(A), APAF1, DAPK1, BCL2 и BCL6 при РМЖ, причем эти зависимости для генов APAF1, DAPK1, BCL2 и BCL6 установлены ВПЕРВЫЕ. Параллельно выполнен анализ профилей экспрессии и метилирования 20 онкозначимых микроРНК, предположительно (по данным биоинформатики) вовлеченных в регуляцию данных 15 белковых генов, а именно: miR-34a-5p, miR-34b-3p, miR-34c-3p, miR-9-5p, miR-124-3p, miR-148a-3p, miR-125b-5p, miR-127-5p, miR-129-5p, miR-132-3p, miR-137, miR-17-5p, miR-191-5p, miR-193-5p, miR-203a, miR-212-3p, miR-219a-5p, miR-24-2-5p, miR-339-3p, miR-375. При РМЖ показано значимо частое снижение экспрессии 7 из 20 исследованных микроРНК (miR124-3p, -125b-5p, 129-5р, -127-5p, -132-3p, -193a-5p, и -34b-3p). Например, уровень miR-124-3p был снижен в 68% образцов РМЖ, miR-125b-5p - в 76%, miR-132-3p - в 50%, miR-193a-5p - в 79%, и miR-34b-3p - в 47% (p ≤ 0.05, Wilcoxon test), что согласуется с онко-супрессорными свойствами этих микроРНК. Выявлено также повышение уровня экспрессии miR-375, что согласуется с про-онкогенными свойствами этой микроРНК. Построены профили метилирования для 20 генов, кодирующих исследуемые микроРНК, с использованием представительных выборок образцов РМЖ (58 пар опухоль/норма). Получены ПРИОРИТЕТНЫЕ результаты по идентификации 5 новых гиперметилируемых генов микроРНК при РМЖ (MIR-127, -132, -193a, -1258 и -137) и впервые выявлено гипометилирование гена MIR-191. Значимое преобладание частоты метилирования в опухоли по сравнению гистологически неизмененной тканью показано для 12 генов: MIR-124-1, 124-3, 125b-1, -127, -129-2, -132, -148a, -193a, -34b/c, -9-1, -9-3, -1258. Гиперметилирование этих генов показано в 30-74% образцов РМЖ. Ранее на представительных выборках РМЖ из этих генов были исследованы только MIR-148a, -34b/c, -9-1, -9-3, а гиперметилирование 8 генов на представительных выборках РМЖ показано впервые, как и гипометилирование гена MIR-191. Для 12 микроРНК (miR-124-3p, -125b-5p, -127-5p, -132-3p, -137, -148a-3p, -191-5p, -193a-5p, -203a, -34b-3p, -375, -9-5p) ВПЕРВЫЕ методом корреляционного анализа установлены значимые корреляции между изменениями уровня экспрессии и статуса метилирования при РМЖ. Значения коэффициента корреляции Спирмена (Rs) составили 0.51-0.77, p ≤ 0.002. Построены профили метилирования для 20 генов, кодирующих исследуемые микроРНК, с использованием представительных выборок образцов РЯ (54 пары опухоль/норма). Получены ПРИОРИТЕТНЫЕ результаты по выявлению частых изменений метилирования при РЯ для 15 генов микроРНК. Так, ВПЕРВЫЕ с высоко значимой достоверностью показано гиперметилирование 14 генов (MIR-124-1/-2/-3, -125b-1, -127, -129-2, -132, -137, -193a, -203, -375, -148a, -107, -1258) и гипометилирование гена MIR-191. Кроме того, показана связь гиперметилирования 9 генов микроРНК с показателями прогрессии РЯ, в том числе с метастазированием (MIR-124-2, -125b-1, -129-2, -137, -193a, -203, -34b/c, 130b и 1258). Ранее такие данные были известны только для генов MIR-130b и -34b/c. Статистически значимая ассоциация метилирования 7 генов микроРНК с метастазированием РЯ показана ВПЕРВЫЕ. Методом ПЦР в реальном времени проведён анализ изменения содержания 12 зрелых онкозначимых микроРНК (miR-124-3p, miR-125b-5p, miR-127-5p, miR-129-5p, miR-132-3p, miR-137, miR-191-5p, miR-193-5p, miR-34a-5p, miR-34b-3p, miR-34c-3p, miR-9-5p) в 20 парных образцах РНК первичных опухолей РЯ. Показано частое снижение экспрессии 11 микроРНК (всех кроме miR-191-5p) и частое повышение экспрессии miR-191-5p. Все эти данные показывают важную роль метилирования в регуляции экспрессии генов микроРНК как при РМЖ, так и при РЯ. В диагностические системы РМЖ могут быть включены гены: MIR-124-1, -125b-1, -127, -132, -193а, -34b/c и -1258, а в прогнозирование метастазирования РМЖ - MIR-125b и MIR-127, метилирование которых значимо связано с патогенезом и прогрессией РМЖ. На основе данных по метилированию генов микроРНК при РЯ составлены две СИСТЕМЫ маркеров с высокой чувствительностью и специфичностью - для диагностики РЯ (MIR-124a-3, -129-2, -193a, -107) и для прогнозирования метастазирования (MIR-137, -193a, -1258, -203, -127) (Заявка на изобретение, Регистрационный №2016146084, 24.11.2016). Идентификация потенциально взаимодействующих пар микроРНК и мРНК белок-кодирующих генов-мишеней, проявляющих значимую обратную зависимость по экспрессии в первичных опухолях при РМЖ и РЯ. Методом корреляционного анализа по Спирмену сопоставлены данные по уровням экспрессии 20 микроРНК и 15 опухоль-ассоциированных белоккодирующих генов (RASSF1(A), RHOA, BCL2, CHL1, APAF1, DAPK1, CCND1, NF1B, TGFB2, BCL6, ACSL1, AURKA, c-MYC, SNAI2, AXL), полученные на общей выборке 40 образцов РМЖ. Значимая отрицательная корреляция установлена между уровнями экспрессии miR-127-5p и DAPK1 (Rs = -0.41, p = 0.01), miR-375 и RASSF1(A) (Rs = -0.33, p = 0.05), miR-124-3p и BCL2 (Rs = -0.32, p = 0.05), а также между miR-34c-3p и мРНК гена CCND1 (Rs= -0.33, p=0.04). При РЯ отрицательная корреляция выявлена между уровнями экспрессии miR-34a-5p и AXL (Rs= -0.23, p=0.09), miR-127-5p и BCL6 (Rs = -0.32, p = 0.05). Эти данные могут указывать как на прямое связывание микроРНК с мРНК в этих парах, так и на опосредованное взаимодействие. Действительно, найденные нами новые потенциально взаимодействующие пары miRNA-mRNA вовлечены в общие сигнальные процессы и пути в опухолях, что показано при анализе данных KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, FDR < 0.05) и GO (Gene Ontology, FDR < 0.001), а также данных литературы. Например, BCL2 и мишени miR-124-3p вовлечены в супрессию процессов апоптоза и фокальной адгезии (Deng et al., 2016; Xu et al., 2016). RASSF1(A) и miR-375 вовлечены в PI3K/Akt-путь (http://www.kegg.jp/kegg-bin/highlight_pathway?scale=1.0&map=map05200&keyword=RASSF1). Взаимодействие hsa-miR-124-3p и мРНК BCL2 исследовано на клеточной линии РМЖ MCF-7 посредством трансфекции клеток искусственно синтезированными (ДНК-синтез, г.Москва) РНК-дуплексами hsa-miR-124-3p, имитирующими микроРНК-дуплексы. При трансфекции использовали отрицательный контроль на основе cel-miR-67-3p (Caenorhabditis elegans) и положительный контроль на основе hsa-miR-1-3p. Трансфекции дуплексов hsa-miR-124-3p, hsa-miR-1-3p и cel-miR-67-3p в клетки линии MCF-7 проводили с использованием катионных липидов (Lipofectamine 2000, Invitrogen, США). При анализе уровня экспрессии BCL2 в трансфицированных клетках методом RT-qPCR в качестве дополнительных контролей служили валидированные мишени для hsa-miR-124-3p (IQGAP1 и CD164) и для hsa-miR-1-3p (TWF1), показавшие достоверное снижение (p<0.05 во всех случаях). Показано, что трансфекция 40 нМ и 80 нМ hsa-miR-124-3p приводит к снижению экспрессии BCL2 в 1.3 раза (0.75±0.09 относительно контроля, p-val=0.016651) и в 1.4 раза (0.74±0.20 относительно контроля p-val=0.039517) соответственно. Таким образом, показано, что hsa-miR-124-3p вовлечена в регуляцию экспрессии гена BCL2 при РМЖ, и мРНК BCL2 может служить мишенью hsa-miR-124-3p при РМЖ (p-val <0.05).