Аннотация результатов, полученных в 2014 году
1) Были определены профили экспресии потенциальных маркеров инвазивности в клетках РМЖ с различной молекулярной таксономией: MCF7 (люминальный подтип, неинвазивный) и MDA-MB-231 (базальный подтип, инвазивный) при нормальных условиях культивирования (Рисунок 4). 2) Было проведено сравнение профилей экспрессии молекулярных маркеров инвазивности, полученных с помощью количественной ПЦР в реальном в ремени и с помощью микрочипов. В результате анализа данных были отобраны наиболее эффективные маркеры инвазивности, которые будут использоваться в дальнейших исследованиях: Zeb1, Vimentin, Snail1, E-cadherin (Рисунки 4, 6, 7).Snail1 не является убедительным маркеров инвазивности. 3) Была проведена оценка вляния сверхэкспрессии различных сплайс-изоформ MDM2 (A, B и С) в клетках РМЖ с различной молекулярной таксономией: MCF7 (люминальный подтип, неинвазивный) и MDA-MB-231 (базальный подтип, инвазивный), на уровень экспрессии потенциальных маркеров инвазивности (E-cadherin, CD44, MMP9, Snail1, Vimentin, Zeb1). Выявлено дифференцированное влияние конкретных изоформ на уровень экспрессии пяти исследованных маркеров инвазивности (Рисунок 5). 4) Был проведен биоинформатический анализ наиболее дифференцированно-экспрессирующихся генов между клетками РМЖ MCF7 и MDA-MB-231. В результате была построена сеть возможных молекулярных взаимодействий и были определены основные клеточные процессы, в которые вовлечены данные молекулярные взаимодействия (элонгация трансляции, способность к миграции, способность к адгезии и др.) (Рисунок 8), что указывает на участие дифференцированно-экспрессированных генов в регуляции ЭМТ и инвазивности, что, соответственно влияет на выживаемость пациентов. 5) Был осуществлен биоинформатический анализ выживаемости пациентов в зависимости от экспрессии генов, экспрессирующихся преимущественно в клетках неинвазивной линии РМЖ MCF7.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Для более подробного анализа влияния изоформ MDM2 на опухолевый потенциал клеток в контексте эпителиально-мезенхимного перехода и проапоптотических молекулярных путей, регулируемых транскрипционными факторами E2F1 и NF-κB, были выбраны две клеточные линии: линия РМЖ линия мезенхимного типа MDA-MB-231 и линия эпителиального типа MDA-MB-468. В этих клетках были генетически сконструированы стабильно-экспрессирующиеся изоформы Mdm2 и полноразмерный белок. В результате проведенных экспериментов мы установили, что экспрессия мишеней E22F1 и NFkB регулируется изоформами Mdm2 разнонаправленно, в зависимости от клеточного контекста. Можно сделать вывод о том, что по-видимому, на экспрессию мишеней E2F1 и NFkB влияют также другие факторы транскрипции, которые усложняют картину. При этом, наиболее достоверное влияние на мишени E2F1 и NFkappaB имеют изоформы Mdm2 A и B. В свою очередь, в клетках MDA-MB-231 на уровне регуляции транскрипции оказывают максимальное влияние на маркеры ЭМТ (Е-кадгерин и виментин) изоформы В и С, а на уровне белка – только изоформа С. На основе наших данных по экспрессии р53-зависимых генов, полученных с помощью гибридизации РНК с микрочипами, в качестве одних из кандидатов на новые гены-мишени, участвующие в ЭМТ, были выбраны гены семейства белков ядерных рецепторов NR4A1, NR4A2, NR4A3. Результаты исследования показали, что уровень экспрессии NR4A3 при активации транскрипционного фактора p53 достоверно отличается от уровня экспрессии в клеточной линии, где p53 не активирован, или отсутствует. Эти данные свидетельствуют о регуляции экспрессии гена NR4A3 транскрипционным фактором p53 в ответ на повреждения ДНК. Было также показано, что мутантный белок p53 активирует экспрессию гена NR4A3 сильнее, чем p53 “дикого типа” особенно после обработки клеток лигандом TGFbeta. Мы также изучили связывание р53 дикого типа и его мутанта с промотором NR4A3 с помощью метода хроматиновой иммунопреципитации. Данные хроматиновой иммунопреципитации свидетельствуют о том, что р53 лучше всего связывается с первым интроном гена. Такая же регуляция наблюдается и в гене Mdm2. Был определен спектр белков, взаимодействующих с основной и сплайс-изоформами MDM2 в клеточных линиях карциномы молочной железы человека. Общий анализ интерактантов с Mdm2 свидетельствует о том, что максимальное количество взаимодействующих белков относится к трансляции, белкам цитоскелета, регуляторам транскрипции и метаболизма. При этом, изоформа А специфически взаимодействовала с онкосупрессорным белком лактоферрином, который подавляет экспрессию и активность фосфоинозитол-зависимой киназы АКТ за счет активации МАРК/c-jun сигнального пути. Мы также установили, что Mdm2 специфически взаимодействует с лизин-специфической метилтрансферазой Set7/9 (Lezina et at al, 2015; http://www.impactjournals.com/oncotarget/index.php?journal=oncotarget&page=article&op=view&path[]=4584&pubmed-linkout=1). Оказалось, что подавление Set7/9 за счет малой интерферирующей РНК приводит к повышению экспрессии Mdm2 в ответ на генотоксический стресс. Полученные данные свидетельствуют о наличии в клетках петли положительной связи, в соответствии с которой повышение уровня экспрессии MDM2, увеличивающее чувствительность к генотоксическому стрессу, ведет к снижению уровня Set7/9, что, в свою очередь, способствует повышению экспрессии MDM2. Наши данные, основанные на анализе изменения экспрессии генов в клетках с подавленной экспрессии гена Set7/9 по сравнению с контрольными клетками с помощью ДНК-микрочипов показали, что подавление экспрессии гена Set7/9 приводит к повышению экспрессии гена NR4A3, который участвует в процессе ЭМТ. Нами была получена клеточная линия рака молочной железы MDA-468, которая является эпителиальной клеточной линией и характеризуется низким метастатическим потенциалом, стабильно экспрессирующая белок NR4A3. Наши эксперименты показали, что увеличение экспрессии гена NR4A3, приводит к увеличению экспрессии виментина, при этом уровень экспресии E-кадгерина практически не меняется.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проведены эксперименты по Mdm2-опосредованному убиквитинилированию и протеасомной деградации белков-регуляторов ЭМТ. Для этой цели использована in vitro система с рекомбинантно-очищенными белками: 6His-E1 убиквитинилирующий фермент, 6His-E2 убиквитинилирующий фермент, а так же рекомбинантный GST-Mdm2 в качестве Е3 убиквитинилирующего фермента. Нативный 26S протеасомный комплекс выделялся из клеток HEK293T, стабильно трансфецированных экспрессионным вектором, кодирующим субъединицу 19S комплекса, PSMD14, слитую с 6His-эпитопом. Мы проанализировали эффект добавления очищенного белка Mdm2 на процесс убиквитинилирования и деградации одного из важнейших регуляторов ЭМТ, р53 . Судя по данным иммуноблоттинга с антителами Ab-1, узнающими карбоксильный конец р53, протеасомы деградировали полипептид GST-р53 не целиком, а разрезали его на несколько специфических фрагментов. Эти данные свидетельствуют о том, что возможно в клетках протеасомы деградируют р53 на несколько фрагментов, которые могут иметь определенные биологические функции. Однако данный вопрос требует дальнейшего изучения. Мы оценили влияние полноразмерного белка Mdm2 и его изоформ A, B, C на непосредственную деградацию важнейшего регулятора ЭМТ белка Е-кадгерина за счёт MDM2-зависимого убиквитинирования в системе in vivo. Окраска антителами на Е-кадгерин показала, что при оверэкспрессии MDM2 происходит увеличение моно-убиквитинирования Е-кадгерина. Более того, мы обнаружили, что изоформы В и, в особенности, С вовлечены в процесс убиквитинирования Е-кадгерина. Мы проанализировали уровень экспрессии важнейших регуляторов ЭМТ Е-кадгерина и виментина на уровне РНК в клеточных линиях рака молочной железы MCF7 и MDA231 без и c оверэкспрессией MDM2. Оказалось, что оверэкспрессия MDM2 приводит к значительному снижению уровня E-кадгерина, как в MCF7, так и в MDA231, что согласуется с литературными данными. Также мы заметили незначительное снижение виментина на уровне мРНК. Полученные данные подтверждают важную роль MDM2 и его изоформ в ЭМТ. Мы также создали модель для изучения эпителиально-мезенхимального перехода (ЕМТ). Для решения этой задачи мы использовали линии опухолевых клеток эпителиального происхождения рака молочной железы (РМЖ) MCF7, не обладающих высоким метастатическим потенциалом. Для того чтобы индуцировать ЕМТ в клетках линии MCF7, в содружестве с лабораторией д-ра Е. Тульчинского (Университет Лестера, Великобритания) на основе клеток MCF-7, мы создали клеточную линию с регулируемой (Tet-ON) экспрессией Zeb1. Zeb1- мастер-регулятор транскрипции, к которому, по крайней мере, в РМЖ сведены практически все сигнальные каскады запуска ЕМТ. Особенностью линии, на которой осуществлялась работа, является наличие встроенной индуцибельной Tet-ON системы, благодаря которой путем использования доксициклина может быть достигнута индукция экспрессии белка Zinc finger E-box-binding homeobox 1 (Zeb1). Этот транскрипционный фактор является известным репрессором промотера Е-кадгерина и активирует экспрессию гена виментина, что вызывает потерю межклеточных контактов и обуславливает миграцию клеток. Мы определили степень миграции клеток рака MCF7 до и после индукции Zeb1 с помощью технологии xCELLigence, позволяющей оценить процессы, происходящие в клеточных популяциях, в режиме реального времени. Мы обнаружили, что после индукции Zeb1 доксициклином возрастает подвижность клеток MCF7 по сравнению с контрольными, не обработанными доксициклином, клетками. С помощью метода иммуноблоттинга мы подтвердили, что индукция Zeb1 существенно снижает уровень экспрессии Е-кадгерина и увеличивает уровень виментина. Кроме того, мы обнаружили, что индукция Zeb1 увеличивает уровень экспрессии белка p53. Данные глубоко секвенирования позволили обнаружить, что после индукции Zeb1 происходит активация генов, связанных с репарацией ДНК. Мы предположили, что повреждения ДНК являются причиной стабилизации p53 после активации Zeb1 в клетках рака молочной железы MCF7. Мы провели иммуноцитохимическое окрашивание клеток MCF7 до и после индукции Zeb1 на γH2AX, маркер фокусов репарации. Известно, что на ранних этапах репарации ДНК происходит фосфорилирование белка H2AX. Мы обнаружили значительное увеличение фокусов репарации в клетках MCF7 после индукции Zeb1. По всей видимости, описанные эффекты лежат в основе остановки в клеточном цикле и ухудшения пролиферации клеток MCF7 после активации Zeb1. Для того, чтобы охарактеризовать нашу модельную систему, мы провели оценку уровня экспрессии регуляторов клеточного цикла p27, СyclinE и Сdk2. Мы обнаружили, что в клетках MCF7 с индуцированным Zeb1 значительно повышается уровень белка p27. Этот белок является важным регулятором клеточного цикла и отвечает за его остановку в G1-фазе, что согласуется с нашими данными о том, что Zeb1 негативно влияет на пролиферацию клеток. Интересно, что мы также обнаружили сильную экспрессию СyclinЕ в ответ на индукцию Zeb1. Из литературных данных известно, что p27 подавляет активность комплекса Сyclin Е/Сdk2, который необходим для продвижения по клеточному циклу через G1 в S фазу. В то же время уровень экспрессии Сdk2 оказался снижен в клетках MCF7 после индукции Zeb1 по сравнению с контролем. По всей видимости, несмотря на увеличение экспрессии CyclinE, не образуется активного комплекса Сyclin Е/Сdk2, необходимого для продвижения из G1 в S фазу. Как было отмечено выше, нам удалось установить, что активация Zeb1 приводит к стабилизации p53 в клетках MCF7. Известным регулятором онкосупрессора p53 является убиквитин-лигаза MDM2. MDM2 физически взаимодействует и убиквитинирует p53, отправляя этот белок на протеасомную деградацию. Мы обнаружили, что индукция Zeb1 ассоциирована с увеличением экспрессии убиквитинлигазы MDM2. По всей видимости, стабилизация p53 влечет за собой увеличение экспрессии MDM2. Это подтверждает тот факт, что нокдаун p53 в клетках MCF7 приводит к снижению уровня экспрессии убиквитинлигазы MDM2. Важно отметить, что подавление экспрессии р53 (MCF7 p53-) в клетках приводит к заметной стабилизации Zeb1 на белковом уровне. В совокупности с результатами по снижению уровня MDM2 в этих же клетках, можно предположить, что MDM2 взаимодействует с Zeb1 и, возможно, регулирует его стабильность. Полученные данные делают интересным дальнейшей изучение роли MDM2 в пролиферации, метастазировании и клеточном цикле на полученной модельной линии клеток рака молочной железы MCF7 p53+ и MCF7 p53- с Tet-ON индуцируемым Zeb1. Ещё одной задачей было создание панели антител, специфичных к основным сплайс-изоформам MDM2. Создание антител, специфичных к сплайс-изоформам, является не тривиальной задачей, так как в этом случае имеется только один специфичный короткий эпитоп, приходящийся на границу экзон-экзонного сочленения. Таким образом, из последовательности белка только один небольшой эпитоп окажется целевым для нужных антител, при этом нет никакой гарантии, что этот эпитоп окажется иммунногеным. Помимо этого, если эпитоп окажется слишком большим, это может привести к узнаванию соответствующими антителами, наряду с целевой изоформой, полноразмерного белка. Поэтому для выполнения данной задачи мы приняли решение наладить методику фагового дисплея. Данный метод использован для поиска специфических антител против изоформ Mdm2. Для освоения данной методики и попытки разработки нужных нам антител была осуществлена командировка длительностью 12 суток в г. Эдинбург, Великобритания. Мы использовали библиотеку бактериофагов на основе нитевидного фага М13, несущих различные варианты одноцепочечных антител (scFv) собаки (Canis Familiaris). Последовательность scFv антител слита с последовательностью малого покровного белка pIII. Таким образом, на своей поверхности фаги экспонировали библиотеку scFv антител. Однако данные фаги были не лизогенны и для сборки требовали дополнительное заражение хелперным фагом. Мы пробовали таким способом получить антитела, специфичные к пяти различным изоформам MDM2: MDM2-A, -B –C, –D и изоформе 11. В качестве эпитопов мы использовали короткие синтетические пептиды, конъюгированные с биотином, на амино-конце. Эти пептиды соответствовали специфическим пептидам, присущим конкретным изоформам. Процедуру селекции аффинных антител производили в несколько циклов отжига. По завершении трёх циклов для тестирования специфичности и аффинности антител мы провели ИФА-анализ. Согласно результатам этого скрининга, после третьего этапа появлялась специфичность по отношению к изоформам В и изоформе 11 Однако, для того, чтобы ещё повысить специфичность и аффинность полученных фагов, мы решили провести ещё два раунда селекции. Таким образом, с использованием фагового дисплея нами были получены фаги, которые несут на своей поверхности антитела, специфичные к трём изоформ-специфичным пептидам, соответствующим изоформе 11, изоформе В и изоформе D. Дальнейшие исследования покажут возможность использования полученных антител для специфической детекции данных изоформ (как рекомбинантных, так и эндогенных) методами ИФА и иммунноблоттинга. Полученные в результате скрининга моноклональные антитела на специфические изоформы Mdm2 могут быть запатентованы и позволят создать тест-систему для характеризации соответствующих типов раковых клеток.