Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Целью настоящего научного проекта является исследование структурных особенностей белков экстремофильных микроорганизмов, обеспечивающих их адаптацию к условиям внешней среды. Адаптационные механизмы экстремофилов включают целый ряд процессов, в том числе изменение липидного состава мембран, синтез органических осморегуляторов в ответ на осмотический шок, а также изменение состава и свойств белков - ключевых компонентов метаболических путей, обеспечивающих более эффективное превращение субстратов – источников биомассы и энергии. Последний тип адаптации представляет особый интерес, поскольку делает экстремофилы перспективным источником белков и ферментов с уникальными свойствами, структурно-функциональное исследование которых позволит создать теоретическую базу для конструирования генно-инженерных белков, обладающих высокой активностью и стабильностью в экстремальных условиях (рН, соленость, температура и т.д.). В качестве источников белковых объектов для структурно-функциональных исследований в проекте использованы следующие экстремофильные микроорганизмы и/или их геномы: • галоалкалофильные бактерии рода Thioalkalivibrio • археи и термофильные бактерии • экстремофилы, для которых показана способность к металлоредукции • психрофильные микроорганизмы. Для исследования адаптации на уровне метаболических процессов в качестве модельного объекта выбрана галоалкалофильная, облигатно литотрофная сероокисляющаябактерия Thioalkalivibrio nitratireducens, особенности энергетического метаболизма которой позволяют ей успешно конкурировать с другими бактериями в условиях содовых озер. Основную роль в обеспечении данного микроорганизма энергией играет метаболизм соединений серы. На основе анализа генома построены карты диссимиляторного метаболизма соединений серы. Ферменты и ферментные комплексы, представленные в геноме бактерии, способны осуществлять диссимиляторное окисление/восстановление соединений серы несколькими путями. Для уточнения метаболических путей соединений серы были получены транскриптомы и протеомы Tv. nitratireducens при культивировании с разными донорами (тиосульфатом, тиоцианатом) и акцепторами электронов (нитрат, кислород воздуха), проведена количественная оценка дифференциального уровня экспрессии генов белков серного метаболима в условиях анаэробного и аэробного культивирования. Показано, что в анаэробных условиях при культивировании с тиосульфатом снижается уровень транскриптов белков, участвующих в так называемом APS-пути окисления сульфита до сульфата (аденилилсульфатредуктазы (AprAB) и сульфатаденилилтрансферазы (Sat)), а также диссимиляторной сульфитредуктазы (DsrAB), осуществляющей окисление сульфида до сульфита. Анализ протеомных карт также показал исчезновение на них белковых компонентов, соответствующих бета-субъединицам Dsr и Apr.Таким образом, можно исключить участие этого пути в окислении тиосульфата до сульфата в анаэробных условиях и предположить, что основную роль играет метаболический путь, связанный с участием сероокисляющего комплекса Sox. Отобраны два ключевых компонента этого комплекса SoxAX и SoxYZ для последующей функциональной и структурной характеристики. Показано, что при культивировании бактерии Tv. nitratireducens, а также близкородственной ей бактерии Tv. paradoxus, с тиоцианатом в качестве единственного источника энергии, азота и серы, реализуется неописанный ранее метаболический путь, предполагающий окисление тиоцианата на первой стадии с образованием цианата и молекулярной серы. Показано, что ключевым фактором, влияющим на потребление тиоцианата клетками и синтез тиоцианат-превращающего фермента, является содержание ионов меди в ростовой среде. Выделен и охарактеризован фермент - тиоцианатдегидрогеназа, отвечающий за окисление тиоцианата. Показано, что активный центр фермента содержит ионы меди, участвующие в катализе. Одним из направлений исследований, проводимых в рамках данного проекта является изучение процесса диссимиляторной металлоредукции у термофильных бактерий и архей. Особый интерес вызывают процессы, связанные с переносом электронов на нерастворимые внешние акцепторы электронов, такие как оксиды металлов и минералы. Ключевую роль в процессе экстраклеточного переноса электронов выполняют мультигемовые цитохромы. Для структурно-функциональной характеристики в геноме термофильной бактерии – металлоредуктора Carboxydothermus ferrireducens отобраны два 10-гемовых цитохрома с, гомологичные ранее охарактеризованным цитохромам с MtrA и OmcA, которые входят в состав респираторной системы, окисляющей оксид железа, у хорошо изученного металлоредуктора Swevanella oneidensis. За отчетный период проведен поиск новых ферментов в геномах экстремофильных организмов. Объектами поиска являлись ферменты, стереоселективные в реакциях превращения органических соединений: омега-трансаминазы, R-селективные трансаминазы IVкласса, стереоселективные липазы, D-карбоксипептидазы и дегидрогеназы. Выбор трансаминаз был сделан в результате поиска по профилю, построенному по множественному выравниванию белковых последовательностей. Для составления базовой выборки белковых последовательностей использовались Кластеры Ортологичных Групп (COGи): COG0161, COG0160, СOG4992 и COG0001 для ω-трансаминаз (III класс трансаминаз) и COG0115 для трансаминаз IV класса. Поиск и множественное выравнивание последовательностей, кодирующих потенциальные липазы, D-карбоксипептидазы и дегидрогеназы, проводились программой BLAST и CLUSTAL W. Из геномов психрофильных бактерий для дальнейших структурно-функциональных исследований отобраны последовательности потенциальных ω-аминотрансфераз. Из геномов архей и термофильных бактерий отобраны R-селективные трансаминазы III и IV классов. Начаты работы по структурно-функциональной характеристике новых ферментов: выделена и очищена до гомогенного состояния новая трансаминаза IV класса из археи Vulcanisaeta moutnovskya. Проведена предварительная биохимическая характеристика фермента, подтверждающая принадлежность фермента к IV классу трансаминаз. Проведен широкий скрининг условий кристаллизации данной трансаминазы. По результатам скрининга для оптимизации качества кристаллов отобраны три условия роста кристаллов.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект направлен на исследование ферментов из экстремофильных организмов и включает поиск новых не изученных ранее ферментов с необычными свойствами, структурно-функциональную характеристику новых ферментов, исследование механизмов адаптации белков и организма в целом к экстремальным условиям, анализ молекулярных основ стабильности белков и активности ферментов в условиях обитания организма-хозяина. Кроме постановки и решения фундаментальных задач, изучение ферментов из экстремофильных организмов позволяет предложить ферменты для биотехнологии, которые будут отличаться устойчивостью и высокой операционной стабильностью в экстремальных условиях. Объектами исследования являются ферменты из архей, термофильных и галоалкалифильных бактерий: трансаминазы – стереоселективные ферменты переноса аминогруппы; и ферменты, участвующие в метаболизме азота и серы, в том числе оксидоредуктаза, окисляющая тиоционат и цитохромы – участники цепи переноса электронов в клетке. Трансаминазы присутствуют во всех организмах и отвечают за синтез аминокислот, антибиотиков у грибов и в целом транспорт азота в клетке. Кроме обязательного участия в метаболизме аминокислот, то есть присоединения-удаления альфа-аминогруппы у природных протеиногенных L-аминокислот, трансаминазы могут иметь ряд дополнительных функций: перенос удаленной аминогруппы (синтез бета- и гамма-аминокислот), трансаминирование первичных аминов, трансаминирование R-хиральных соединений. Не все трансаминазы проявляют дополнительные функции, что определяется строением активного центра и адаптацией фермента под нужды организма-хозяина. Поиск и характеристика новых трансаминаз в археях и экстремофильных организмах нацелен на обнаружение и исследование именно интересных дополнительных функций этих ферментов, сочетающихся с высокой термостабильностью и галотолерантностью. В рамках проекта проведен биоинформатический анализ представленности трансаминаз III и IV классов, специализирующихся на трансаминировании аминокислот с удаленной по цепи аминогруппе (омега-аминотрансфераз) и трансаминировании разветвленных аминокислот. Омега –аминотрансферазы потенциально способны к переносу аминогрупп в реакциях с S-хиральными аминами, трансаминазы IV класса могут проявлять активность в реакциях переноса аминогрупп с R-хиральными аминами (R-специфичность трансаминаз). Учитывая трудности культивирования экстремофильных микроорганизмов, исследования проводятся с рекомбинантными формами ферментов. Структурно-функциональной характеристике новых объектов предшествовало создание эффективных систем экспрессии в штаммах E.coli и разработка методик выделения активных гомогенных препаратов ферментов. В отчетный период проведена первичная биохимическая характеристика новых трансаминаз из архей Мethanococcus vannielii SB, Thermomicrobium roseum, термофильной бактерии Thermobaculum terrenum ATCC и галотолерантной бактерии Haliangium ochraceum. Показано, что новые ферменты являются PLP-зависимыми трансаминазами IV класса, специфичными к разветвленным природным L-аминокиcлотам и их кетоаналогам. Все ферменты проявляют R-специфичность в реакции переноса аминогруппы с R-альфа-метилбензиламина на аминоакцептор. Наибольшую активность в реакции с R-альфа-метилбензиламином проявляют трансаминазы из H. оchraceum и T. terrenum. Ферменты из T. roseum и T. terrenum стабильны и активны при температурах выше 60 °С. Трансаминаза из М. vannielii активна при температурах до 50 °С. Термостабильность трансаминазы из H. оchraceum не исследована. Ведется кристаллизация новых трансаминаз, собраны наборы дифракционных данных с кристаллов холо-формы трансаминазы из археи M. vanillii и комплексов холо-формы с L-валином, R-альфа-метилбензиламином и L-цистеином. Структура фермента решена, ведется уточнение. Для омега-аминотрансферазы из психрофильной бактерии Psychrobacter cryohalolentis, которая относится к малоизученному семейству аdenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate aminotransferase (Clade 5 COG0161), показано, что фермент специфичен преимущественно к S-ароматическим аминам и обладает нетипичным для ω-аминотрансфераз профилем специфичности в отношении кето соединений: незначительной активностью с кетонами, кето-кислотами и сложными эфирами, высокой активностью с ароматическими альдегидами (бензальдегид, фенилглиоксаль) и алифатическими альдегидами (изобутиральдегид, пропаналь, гексаналь, глицеральдегид). Температурный оптимум реакции переноса аминогруппы с S-альфа метилбензиламина на изобутиральдегид составляет 45 °С, при 0 °С фермент сохраняет 10 % от максимальной активности. Ведется кристаллизация нового фермента с целью получения кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа и последующего анализ структуры. Исследование энергетического метаболизма у галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio, проводимое в рамках настоящего проекта, позволило выявить несколько ключевых ферментов и ферментных комплексов для последующего более подробного изучения. Наибольший интерес представляет новый, неописанный ранее фермент – тиоцианатдегидрогеназа (TCDH) - первый фермент дыхательной цепи при росте бактерий Tv. nitratireducens и Tv.paradoxus на тиоцианате в качестве единственного источника энергии, азота и серы. TCDH является гомодимером, локализован в периплазме и содержит два атома меди на субъединицу. Окисление тиоцината TCDH сопровождается образованием цианата и молекулярной серы с переносом двух электронов на цитохром с. Из периплазматической фракции бактерии Tv.paradoxus выделены два цитохрома с, являющихся потенциальными акцепторами электронов для TCDH, а также медь-связывающий белок СорС, который активируетTCDH в реакции окисления тиоцианата. Методом рентгеноструктурного анализа установлена пространственная структура TCDH. Активный центр TCDH содержит два иона меди с расстоянием между ними около 7 А, что позволяет молекуле субстрата встраиваться между ионами меди для последующего окисления. Ионы меди координированы консервативными остатками гистидина, лизина и аспартата. Еще два консервативных остатка гистидина, роль которых пока не установлена, расположены в непосредственной близости от активного центра. Предварительно можно сказать, что структура активного центра TCDH не имеет аналогов среди медь-содержащих ферментов. Рост бактерий Tv. nitratireducens и Tv.paradoxus на тиосульфате как источнике энергии приводит к значительному росту уровней транскрипции генов soxYZ, входящих в ферментативную систему Sox, отвечающую за окисление тиосульфата в условиях аэробного культивирования. SoxYZ был выделен из периплазматической фракции бактерии Tv. paradoxus, проводится функциональная характеристика выделенного белка. Создана система экспрессии мультигемовых цитохромов с в клетках E. coli. Гены целевых цитохромов с клонированы в плазмидный вектор pET-22b(+) с pelB сигнальным пептидом, обеспечивающий потенциальный транспорт целевого белка в периплазму. Полученными экспрессионными векторами трансформировали клетки E. coli штамма BL21(DE3), несущие плазмиду pEC86, содержащую кластер генов ccmABCDEFGH, обеспечивающих синтез и встраивание гемов с в рекомбинантные цитохромы, получаемые в клетках E. сoli в аэробных условиях. Два целевых мультигемовых цитохрома с из термофильной бактерии-металлоредуктора C. ferrireducens обнаружены в нерастворимой фракции клеточных белков. Проводятся эксперименты по оптимизации экспрессии целевых белков и условий перевода их в растворимое состояние.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В рамках исследования основных ферментов энергетического метаболизма галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio продолжено изучение структуры и функции нового, открытого в ходе выполнения проекта, медь-зависимого фермента тиоцинатдегидрогеназы (TCDH). TCDH является первым ферментом, отвечающим за потребление тиоцианата клетками бактерий рода Thioalkalivibrio при росте на тиоцианате как единственном источнике энергии и азота. TCDH выделяется из клетки в каталитически неактивной форме (TCDH «as isolated»), которая содержит, согласно данным ICP-MS, 0.5 – 0.8 ионов меди на субъединицу. Активация TCDH происходит при насыщении ионами Cu(II) или ионами Cu(I). TCDH, насыщенная ионами меди Cu(II), содержит 2.5 – 3.5 ионов меди на субъединицу и имеет активность 2.5 мкмоль/мин на мг белка. TCDH, насыщенная Cu(I), содержит 4-5 ионов меди на субъединицу и имеет активность 4.5 мкмоль/мин на мг белка. Согласно данным ЭПР, независимо от способа встраивания ионов меди, все ионы меди в белке находятся в окисленном состоянии и принадлежат к типу 2. Методом рентгеноструктурного анализа с разрешением до 1. 45 Å получены пространственные структуры TCDH с различным содержанием ионов меди в активном центре. Структура TCDH «as isolated» (неактивная форма) содержит один ион меди в активном центре (Cu1). Cтруктура TCDH, насыщенной ионами Cu(II), содержит два иона меди в активном центре (Cu1 и Cu2), причем один ион меди (Cu1) - расположен также, как ион меди в структуре TCDH «as isolated». В структуре TCDH, насыщенной ионами меди Cu(I), обнаружено еще два иона меди (Cu3 и Cu4). Ионы меди (Cu1, Cu2 и Cu3) имеют тетраэдрическую координацию. Ион меди Cu4 имеет плоскую квадратную координацию и расположен на расстоянии около 2 Å от иона меди Cu2. Подобное строение медь-содержащего активного центра ранее описано не было. Получена структура комплекса TCDH, насыщенной ионами Cu(II), с субстратом (разрешение 1.8 Å). В активном центре локализованы два иона меди (Cu1 и Cu2) и молекула тиоцианата. Тиоцианат координируется атомом серы с ионом меди 2, замещая молекулу воды в координационной сфере, при этом сохраняется тетраэдрическая координация иона меди. Атом азота молекулы тиоцианата фиксируется водородной связью с остатком Glu288 через молекулу воды. На основании взаимного расположения молекулы субстрата, ионов меди, и каталитически активных групп в активном центре можно предположить, что на первой стадии реакции молекула воды, активируемая консервативным остатком His136, осуществляет нуклеофильную атаку на атом углерода SCN-, расположенный на расстоянии 3.7 Å от нее. Для проверки роли остатков активного центра в связывании субстрата и катализе были получены два точечных мутанта TCDH с заменой Glu288 и His136 на остатки Ala. Мутант TCDH His136Ala был неактивен, что подтверждает важную роль остатка His136 в катализе. Проводится работа по дальнейшей кинетической характеристике мутантных форм фермента и получению структуры мутантных белков и их комплексов с субстратом. В рамках исследования энергетического метаболизма термофильной грам-положительной бактерии - металлоредуктора Carboxydothermus ferrireducens выделен и охарактеризован поверхностный 12-гемовый цитохром c WP_028052385. Предполагается, что WP_028052385 участвует в переносе электронов на нерастворимый экстраклеточный акцептор, такой как ферригидрит или магнетит. Редокс титрование нативного WP_028052385 показало, что белок восстанавливается в интервале потенциалов -100 +200 мВ. Восстановленный WP_028052385 окисляется цитратом железа (E0 = 372 mV) и комплексом Fe(edta) (E0 = 96 mV), что коррелирует с величинами редокс потенциалов гемов с. При экспрессии мультигемового цитохрома с WP_028052385 в клетках E. сoli целевой белок был обнаружен в нерастворимой фракции клеточных белков. Подобраны условия перевода рекомбинантного цитохрома в растворимое состояние. Полученный цитохром с характеризуется неполным встраиванием гемов с в молекулу, что приводит к нарушению свертывания полипептидной цепи и последующей агрегации. Биотехнологическая составляющая проекта ориентирована на трансаминазы III и IV классов, проявляющие активность с первичными (R)- и (S)- аминами. Специфичные к (R)-первичным аминам трансаминазы IV класса (R-TA) и к (S)-первичным аминам омега-TA активно исследуются в настоящее время, некоторые успешно применяются на практике. За последние 3 года появились четыре структуры грибных R-TA, для нескольких грибных R-TA охарактеризована субстратная специфичность. Проведенные в рамках проекта биоинформатические исследования выявили группу из четырех бактериальных/архейных ТА IV класса с мотивом а.о. в активном центре, отличающимся от гомологичных трансаминаз разветвленных аминокислот (BCAT) и гомологичных грибных R-TA: трансаминазы из археи Мethanococcus vanielii, из термофильных бактерий Thermomicrobium roseum, Thermobaculum terrenum и из галотолерантной бактерии Haliangium ochraceum. Наши текущие исследования включали подбор оптимальных условий определения активности для новых ТА, анализ субстратной специфичности, кристаллизацию холо-форм ферментов и комплексов с ингибитором габакулином, PCA полученных кристаллов, решение и уточнение структур и анализ полученных структур. Исследование кинетики и субстратной специфичности показали, что в оптимальных условиях проведения реакции наиболее активной из новых ТА является TA из бактерии T.terrenum. Удельная активность в реакции переноса аминогруппы с L-лейцина на α-кетоглутарат в 50 мМ Tris, рН=8.0, 100 мM NaCl при 50 °C составила 300 U/mg, при 85 °С - 690 U/mg. В оптимальных условий реакции (Tris рН 9.0, 60 мкМ PLP, 50 °C, 1mM α-кетоглутарата, 10 мМ R-MBA) удельная активность этой TA с R-альфа-метилбензиламином (R-MBA) достигает 0.6 U/mg. Активность с S-MBA в этих условиях составила 0.02 U/mg. То есть по активности с R-MBA и селективности исследуемая трансаминаза не уступает грибным R-TA, удельная активность которых находится в диапазоне 0.1-10 U/mg, при этом вторым субстратом – амино акцептором в реакции является альфа-кетоглутарат, а не пируват, как у грибных R-TA. Такой тип R-специфичной активности для трансаминаз IV класса показан впервые. Активность других исследуемых в рамках проекта TA из археи М.vanielii и бактерии H.ochraceum с субстратом R-MBA в подобранных оптимальных для работы ферментов условиях составила 0.1 U/mg. Активность с R-этилбензиламином составила около 1% от активности с R-MBA для исследуемых ТА. ТА из Thermomicrobium roseum, несмотря на отличный от консервативного для BCAT мотив в активном центре, практически не активна с R-MBA. Для всех перечисленных ТА охарактеризована субстратной специфичности, которая определяет новые ТА как BCAT, проявляющие активность с R-MBA. TA из бактерии T.terrenum на сегодня и самая активная из охарактеризованных BCAT. За отчетный период выращены кристаллы, методом РСА получены наборы дифракционных данных и решены структуры холо-форм TA из T.terrenum и TA из H.ochraceum, структуры TA из T.terrenum, TA из М.vanielii с ингибитором габакулином с разрешением 1.5-2.3 Å. Анализ структур показал, что в димерах TA из T.terrenum, TA из М.vannielii имеется два симметрично расположенных активных центра, которые формируются а.о. двух субъединиц. PLP связан с белковой глобулой через ковалентную связь с каталитическим лизином, и фиксирован si-стороной к растворителю, поэтому, как и у всех ТА IV класса, у TA из T.terrenum и TA из М.vanielii перенос протона с Сα атома аминодонора на С4’ атом PLP происходит на re-стороне кофактора. Пространственная структура димеров новых ТА гомологична структурам димеров ВСАТ, DAAT и грибных R-ТА, которые объединены в один IV класс, основные различия наблюдаются в размере субстрат связывающей полости и составе и локализации а.о. в активном центре. Проведенный анализ структурных факторов термостабильности показал, что по сравнению с димерами нетермостабильных гомологов из E.coli (PDB code 1I1K) и бактерии Burkholderia pseudomallei (PDB code 3U0G) димеры TA из T.terrenum и TA из М.vannielii отличаются усилением межсуъединичного контакта, увеличением доли заряженных аминокислот в последовательности, увеличением общего числа водородных связей на 50-90%. Для повышения эффективности в реакциях с первичными R-аминами методом рационального дизайна предложен ряд мутаций в субстрат связывающей полости TA из М.vanielii SB и TA из T.terrenum. В 2016 г проведена детальная биохимическая характеристика омега-TA (Pcryo361) из психрофильной бактерии Psychrobacter cryohalolentis, которая относится к малоизученному семейству узкоспецифичных S-аденозилметионин-8-амино-7-оксононаноат аминотрансферазам (аdenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate aminotransferase). Составлен профиль субстратной специфичности фермента с неприродными субстратами. Показано, что Pcryo361 активна с (S)--метилбензиламином. Наилучшими кетосубстратами являются дикетоны и ароматические и алифатические альдегиды. Активность в реакции аминирования 2,3 гександиона достигает 0.55 U/mg, что в 5-10 раз выше активности гомологичных ферментов с природными субстратами. рН-оптимум в катализируемой Pcryo361 реакции аминирования изобутиральдегида аминодонором (S)-альфа–MBA составляет рН 10.00, установлено, что Pcryo361 активен и стабилен в диапазоне температур 0-35 °С, время полуинактивации при 35 °С при рН 10 составило 1.5 часа. Показана возможность применения Pcryo361 для кинетического разделения аминов в щелочных условиях при низких температурах (до 0 °С) и для аминирования дикетонов и альдегидов. Проведена кристаллизация холо-формы Pcryo361. Методом PCA собраны наборы дифракционных данных с кристаллов холо-формы трансаминазы Pcryo361 c разрешением 1.6 Å, структура фермента решена методом молекулярного замещения.