Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Проведены подготовительные работы, необходимые для успешного осуществления локализационной микроскопии в клетках микроорганизмов: была разработана система стабилизации положения объекта, позволяющая исключить влияние дрейфа на процесс получения субдифракционных изображений, а также протокол подготовки образцов, позволяющий получать совмещенные субдифракционные изображения структур, формируемых FtsZ в клетках бактерий, и дифракционно-ограниченные изображения ДНК. Это позволило получить дифракционно-ограниченные и субдифракционные изображения структур, формируемых белком FtsZ в клетках E. coli в норме и в состоянии SOS-ответа, которые показывают, что при SOS-ответе происходит инверсия внутриклеточных распределений FtsZ и ДНК: ДНК локализуется в центральной части клетки, в то время, как FtsZ преимущественно локализуется у полюсов. Полученные данные позволяют заключить, что механизм «нуклеоидной окклюзии» продолжает действовать при SOS-ответе. Кроме того, FtsZ продолжает формировать спиральные структуры над нуклеоидом, однако не образует Z-колец. Также были получены субдифракционные изображения FtsZ в клетках M. hominis, которые показали, что FtsZ имеет выраженную мембранную локализацию, причем значительная часть белка достаточно равномерно распределена по поверхности мембраны, что свидетельствует в пользу гипотезы об участии FtsZ в поддержании формы клеток M. hominis. Показано, что завершение процесса гомологической рекомбинации требует участия белкового ингибитора – белка RecX. Активность RecX проявляется уже на стадии образования пресинаптического рекомбинационного комплекса, но в полной мере она реализуется на стадии завершения обмена гомологичными нитями ДНК. При этом необходимая концентрация RecX, достаточная для подавления рекомбинационного процесса, снижается более чем на порядок величин. Найдены как природные так и мутантные варианты белков RecA и RecX, чьи уникальные функциональные характеристики помогут выявить молекулярный механизм завершающей фазы гомологической рекомбинации На основе результатов полученных как биохимическими так и одномолекулярными методами показано, что также как и RecAEc белок RecADr не может диссоциировать от ДНК в отсутствие гидролиза АТФ, т.е. природа взаимодействия RecADr с АТФ и его гидролиза подобна таковой для белка RecAEc. При этом данные по исследованию одномолекулярной динамики изменения длины молекулы днДНК при формировании и разборки филамента RecADr в присутствии ATP и ATPγS и в зависимости от предварительного натяжения получены впервые. Исследованы механизмы ДНК-зависимой АТФазной активности белков семейства TIP49с помощью методов молекулярного моделирования и молекулярной динамики(МД). На основе имеющихся кристаллографических данных построены пространственные структуры гетерогексамерных комплексов TIP49a/b с АТФ. Проанализировано влияние присутствия днДНК в центральном канале кольца, сформированного гексамерным комплексом TIP49a/b, на поведение литической воды в активном сайте белка в непосредственной близости от γ-фосфата АТФ. Показано, что присутствие ДНК приводит к значительному увеличению вероятности гидролиза АТФ путем увеличения вероятности образования водородных связей между литической водой и отрицательно заряженными остатками, расположенными в каталитическом сайте белка. В течение 50 нсек МД дн-ДНК претерпевает значительные конформационные изменения, в том числе увеличение шага спирали, раскручивание и разрыв некоторых комплементарных взаимодействий между основаниями в AT-богатых участках. Впервые на одномолекулярном уровне получены данные о динамике формирования комплексов белок TIP49а-днДНК. Одномолекулярный метод на основе оптической ловушки был использован для измерения силы взаимодействия мРНК-рибосома и были получены предварительные данные о величинах этих сил в присутствии различных лигандов (виомицин, паромицин и деац тРНК) и специфических компонентов буферной системы. Биохимическими методами было изучено, как отдельные антибиотики – ингибиторы биосинтеза белка – модифицируют термодинамический профиль реакции транслокации на рибосоме и смещают равновесие в сторону претранслокационного состояния при отсутствии элонгационного фактора EF-G и гидролиза GTP. Виомицин изменяет константу равновесия в 10 раз, т.е. спонтанная обратная транслокация происходит до конца. Паромомицин в аналогичной системе изменяет константу равновесия в 2.5 раза, при этом в присутствии паромомицина в буфере без полиаминов с 6 мМ Mg2+ аффинность пепт-тРНК к А сайту повышается в 5500 раз. Разработана методика получения молекул тРНК с двумя флюоресцентными метками, для изучения престационарной кинетики реакций цикла элонгации (декодирования в А сайте, аккомодации, формирования гибридных состояний, транслокации, диссоциации из Е сайта). Разработаны методики получения отдельных компонентов трансляционной системы из термофильных бактерий Thermus thermophilus для применения в очищенной белоксинтезирующей системе in vitro.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Разработка новых антибактериальных агентов, воздействующих на различные макромолекулярные комплексы и процессы в бактериальной клетке, а также поиск путей повышения эффективности их использования и предотвращения выработки устойчивости к ним, являются целевой функцией настоящего проекта. Именно с этой точки зрения исследования механизмов и динамики взаимодействия нуклеотид-связывающих белков (RecA, RecX, DinI, FtsZ, TIP49, EF-Tu, EF-G, DusC) с нуклеотидами (АТФ, ГТФ и др.) и другими лигандами (ДНК, РНК, рибосомы и др.), заявленных в настоящем проекте, представляют несомненный интерес. За этот год был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов работы изучаемых белков, а часть из этих результатов смогут конвертироваться в потенциально перспективные терапевтические агенты. Один из таких результатов получен на основе полноатомных моделей комплекса филамента RecA-онДНК-RecX, выявивших участок белка RecX, наиболее предпочтительный для создания на его основе пептидов, ингибирующих активность RecA. Исследования АТФазной активности RecA показали, что один из пептидов действительно обладает ингибирующими свойствами. На следующем этапе будет проанализировано действие этого пептида на клетки E. coli. Результаты настоящих исследований будут активно использованы на следующем этапе проекта, результатом которого будет получение новых фундаментальных данных с возможным практическим выходом. Результаты Рекомбиназы RecAEc и RecADr, а так же их взаимодействие с регуляторными белками исследованы спектрофотометрическими методами по изменению ДНК зависимой АТФазы и на одномолекулярном уровне методом оптического захвата. Исследование динамики построения филаментов RecAEc и RecADr на двунитевой ДНК, а также сравнение механических свойств филаментов RecAEc и RecADr показало, RecADr формирует филаменты на двунитевой ДНК существенно быстрее по сравнению с RecAEc. При этом филаменты RecADr обладают большей гибкостью и меньшей длинной, нежели в случае RecAEc. Присутствие в реакции RecX приводит к разборке филамента RecA, которая регистрировалась по падению гидролитической активности RecA и одновременно резкому укорочению ДНК. При этом показана возможность каждого из белков RecX из E.coli и D.radiodurans ингибировать не только собственный, но и чужеродный RecA. Вместе с тем RecADr подвержен ингибированию сильнее, чем RecAE.c. Это различие, по всей видимости, отражает выявленную разницу в динамике построения филаментов на ДНК между обоими RecA. На основе полноатомных моделей комплекса филамента RecA-онДНК-RecX, с использованием программного пакета Molsoft ICM Pro, был выявлен участок белка RecX, наиболее предпочтительный для создания на его основе пептидов, ингибирующих активность RecA. На основе данного фрагмента белка RecX были созданы пептиды, с усовершенствованной последовательностью для обеспечения конформационной стабильности и хорошей растворимости. Результаты исследования АТФазной активности RecA показали, что из четырех теоретически полученных вариантов один пептид обладал выраженными ингибирующими свойствами. Таким образом, была найдена последовательность пептида, ингибирующего активность RecA. На основе полученных нами полноатомных пространственных структур гетерогексамерных комплексов белков семейства TIP49 с АТФ и ДНК с помощью методов молекулярной динамики в периодическом водном боксе исследована геликазная активность этих белков. Было показано что: 1) взаимодействие с положительно заряженными белковыми петлями в центральном канале кольцевого гексамерного комплекса исследуемых белков приводит к раскручиванию спирали ДНК; 2) это раскручивание происходит только внутри гексамерного кольца, в то время как концы, находящиеся снаружи, в течение 50 нс МД сохраняют начальную конформацию классической B-формы; 3) присутствие АТФ в гетерогексамерных комплексах белков TIP49 влияет на динамику и конечную структуру днДНК, приводя к разрыву части комплементарных связей в AT-богатых последовательностях ДНК. Анализ экспериментальных данных полученных биохимическими и одномолекулярными методами позволяет сделать вывод о способности белкаTIP49 связывать как онДНК, так и днДНК. Разработан AquaBridge, новый метод расчета водных мостиков в активных центрах белков в отсутствие или в присутствии малых молекул лигандов. Эффективность метода была протестирована на репрезентативном наборе АТФ-связывающих белков человека. Показано, что точность докинга лигандов может быть значительно улучшена в случае учета возможного присутствия водных мостиков в АЦ белков, a AquaBridge является полезным инструментом для конструирования новых лекарств. Разработана обновленная и ускоренная версия алгоритма SEQOPT (и соответствующего WEB-сервера http://mml.spbstu.ru/services/seqopt/) для глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей альфа-спиралей белков, способная работать параллельно на нескольких процессорах в режиме OpenMP. Кроме этого в обновленной версии введена новая функциональная возможность позволяющая устанавливать минимально допустимый уровень растворимости α-спиральных пептидов с оптимизированными последовательностями. Поставлены и оптимизированы методики, позволяющие собирать как гомогенные, так и гетерогенные системы для изучения отдельных реакций цикла элонгации in vitro, состоящие из термофильных (T. thermophilus) и мезофильных (E. coli) компонентов трансляционной машины (70S рибосом, элонгационных факторов EF-Tu, EF-G, инициаторных факторы IF1, IF2, IF3, гетерополимерных модельных мРНК, нативных и синтезированных тРНК). Разработаны методы изучения престационарной кинетики парциальных реакций элонгации на 70S термофильных рибосомах с помощью сайт-специфического введения флуоресцентных меток в молекулы тРНК и мРНК. Изменена и оптимизирована схема эксперимента по изучению силы взаимодействия мРНК с рибосомами одномолекулярными методами. Впервые в мире получены данные о престационарной кинетике отдельных реакций на термофильных рибосомах: А-сайтовое взаимодействие аминоацил-тРНК с рибосомами, транслокация, катализируемая элонгационным фактором EF-G, взаимодействие деацилированной тРНК с выходным (Е) сайтом 70S рибосом. Показано, что 70S рибосомы из T. thermophilus образуют инициаторные комплексы с fMet-tRNAfMet и гетерополимерной мРНК. Полученные комплексы полностью компетентны в дальнейших реакциях цикла элонгации. Престационарная кинетика А-сайтового связывания изучена с применением тРНКPhe с флуоресцентной меткой. Взаимодействие тройного комплекса с А сайтом приводит к характеристическому изменению интенсивности флуоресценции, аналогичный сигнал ранее был охарактеризован для рибосом из E. coli. Ранние этапы декодирования, вплоть до гидролиза GTP, сопровождаются увеличением интенсивности флуоресценции, а поздние этапы (диссоциация аа-тРНК из комплекса с EF-Tu-GDP, аккомодация аа-тРНК в пептидилтрансферазный центр, синтез пептидной связи) характеризуются уменьшением интенсивности флуоресценции. Методом остановленного потока (stopped flow) охарактеризовано взаимодействие деацилированной тРНК с Е сайтом рибосом из T. thermophilus. Функциональная активность термофильного элонгационного фактора EF-G впервые охарактеризована методами престационарной кинетики, с использованием функциональных претранслокационных рибосомных комплексов. Сравнительное изучение кинетики транслокации, катализируемой мезофильным и термофильным факторами EF-G показало, что при насыщающих концентрациях EF-G скорость перемещения пептидил-тРНК из А в Р сайт в межсубъединичном пространстве 70S рибосомы не зависит от природы элонгационного фактора! Таким образом, конформационная динамика рибосомы и тРНК, а не свойства белкового фактора при данной температуре детерминируют кинетические параметры реакции транслокации. Изучение процесса посттранскрипционной модификации транспортных РНК бактериальными ферментами из класса дигидроуридинсинтаз позволило определить специфичность дигидроуридинсинтазы DusC из E. coli. Методы аналитической биохимии (аналитическая гель-фильтрация, ретардация в неденатурирующем геле) показали специфичность DusC по отношению к уридину в 16 положении тРНКPhe, тРНКTrp. тРНК, не содержащие уридина в 16 положении, не образовывали комплекс с DusC или мутантной формой С98А. Эти данные позже были подтверждены методами рентгеновской кристаллографии путем со-кристаллизации немодифицированных тРНКPhe и тРНКTrp с белком DusC (С98А). При этом сравнительный анализ опубликованных ранее структур комплекса Dus-тРНКPhe из Thermus thermophilus выявил необычный механизм обеспечения специфичности к тРНК при необходимости модифицировать уридины, расположенные в разных местах тРНК: при сравнительно высокой гомологии белков и практически идентичной укладке вторичной структуры белков, для модификации 16 или 20 положения тРНК разворачивается на 160 градусов, позиционируя нужный остаток уридина в активном сайте фермента. Получены трехмерные субдифракционные изображения структур FtsZ в клетках E. coli в норме и при SOS-ответе, которые позволили визуализировать трехмерную структуру Z-кольца, а также проанализировать мембранную локализацию FtsZ в различных областях клетки, находящейся в SOS-ответе. Получены штаммы E. coli, несущие ген белка слияния FtsZ с обратимо фотоактивируемым флуоресцентным белком Dreiklang. Эта конструкция является особенно перспективной для динамической локализационной микрсокопии. С использованием флуоресцентного белка слияния FtsZ-Dreiklang получены кинетические серии изображений структур, формируемых белком FtsZ в клетках E. coli в норме в ходе клеточного цикла и при SOS-ответе. Эти данные показывают, что при переходе клеток в состояние SOS-ответа часть уже сформированных Z-колец разбирается, а часть – заканчивает деление. Предварительные данные свидетельствуют в пользу того, что судьба Z-колец определяется степенью завершенности деления, однако для того, чтобы сделать достоверные выводы, необходимы данные с более высоким разрешением. Оптимизированные в ходе работы протоколы локализцационной микроскопии были использованы для получения субдифракционных изображений структур FtsZ в клетках патогенных для человека бактерий M. hominis. Впервые для E. coli было показано увеличение толщины Z-кольца по мере его сокращения, разработаны протоколы многоцветной локализационной микроскопии ДНК, клеточной поверхности и FtsZ, а также оптимизированный протокол локализационной микроскопии FtsZ, позволяющий в три раза увеличить количество регистрируемых молекул и, по всей видимости, визуализировать одиночные филаменты FtsZ в E. coli.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Разработка новых антибиотиков, воздействующих на различные мишени, а также поиск путей повышения эффективности их использования и предотвращения выработки устойчивости к ним, являются целевой функцией настоящего проекта. Именно с этой точки зрения исследования механизмов и динамики взаимодействия нуклеотид-связывающих белков и элонгационных факторов с ДНК и другими нуклеотидами, заявленных в настоящем проекте, представляют несомненный интерес. Одной из таких мишеней, по которой в этом году получены многообещающие результаты, является белок RecA, центральный фермент рекомбинационной репарации, функционально задействованный в общей резистентности патогенных для человека бактерий. Наиболее существенным прикладным результатом работ 2016 года является подготовка и подача заявки на изобретение на семейство пептидов – ингибиторов (около 17 000 соединений) активности белка RecA, блокирующих SOS-ответ у бактерий, со следующей формулой изобретения «Семейство пептидов, общей формулы Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Lys-AAA-Lys-Ile-HAA-Arg-Tyr-AAA-AAA-Tyr-Arg-HAA-HAA-HAA-NH2, где Ac – N-концевая ацетильная группа, AAA- – одна из алифатических аминокислот из набора Leu, Ile, Val, HAA – одна из гидрофобных аминокислот из набора Leu, Ile, Val, Phe и Tyr, NH2 – C-концевая амидная группа, обладающих ингибирующей активностью против бактериальных белков RecA, а также свойством блокирования SOS-ответа у бактерий». Этот результат получен благодаря комплексным исследованиям взаимодействия RecA с другими белками и ДНК и представителем этого семейства пептидов ингибиторов 4Е1 разработанным и синтезированным в 2015 году на основе фрагмента белка RecX. Для этих исследований был использован широкий набор биохимических методов, методы оптической флуоресцентной микроскопии, оптической спектроскопии поглощения и флуоресценции, спектроскопии кругового дихроизма и одномолекулярные методы с использованием оптической ловушки. Результаты исследований подтвердили сделанные предположения относительно механизма ингибирования пептидами заявленного семейства. В соответствии с планами работ по еще одной важной мишени, белку TIP49, совместно с нашими коллегами из Гарвардского университета были получены очень существенные фундаментальные результаты, которые в случае продолжения проекта будут использованы для получения прикладных результатов относительно высокоэффективных ингибиторов АТФазной активности этих белков. Для этого на настоящем этапе с помощью методов молекулярного конструирования и докинга подвижных лигандов в активных центрах белков был получен набор высокоэффективных ингибиторов АТФазной активности белков семейства TIP49 показавших высокую антираковую активность на клеточных линиях. Помимо этого на основе имеющихся кристаллографических данных впервые получены полноатомные модели додекамерных комплексов TIP49 с АТФ и ДНК и исследована их конформационная подвижность с помощью методов молекулярного моделирования и молекулярной динамики в периодическом водном боксе. Также проведено исследование возможного влияния присутствия ДНК в мультимерных комплексах белков семейства TIP49 на активность молекул литической воды в окрестности гамма-фосфатных групп АТФ в их активных центрах. Основываясь на результатах анализа динамики литической воды в комплексах TIP49a/b с ДНК фрагментами с различным составом сделан вывод, что присутствие ДНК в этих системах приводит к значительному увеличению заселенности атакующей позиции литической водой, а также к увеличению вероятности формирования водородных связей с протон-акцепторными остатками белка в окружении γ-фосфатной группы АТФ, что способствует правильной ориентации литической воды в атакующей позиции, необходимой для протекания гидролиза АТФ в белковых комплексах TIP49. Исследование FtsZ, являющегося ключевым компонентом аппарата деления бактериальной клетки и в связи с этим крайне привлекательной мишенью для новых перспективных антибактериальных препаратов, выявило ряд новых фундаментальных свойств этого белка. В соответствие с планом в отчетный период была создана генетическая конструкция на основе вектора pBAD/HisB, содержащая ген белка SulA, ингибирующего полимеризацию FtsZ in vitro, под контролем индуцибельного арабинозного промотора. Это позволило ингибировать процесс деления клеток E. coli и впоследствии получить субдифракционные изображения структур, формируемых в этих условиях белком FtsZ. Сравнение субдифракционных изображений клеток при пониженном уровне синтеза FtsZ и при экспрессии белка SulA позволяет сделать вывод о справедливости гипотезы о понижении эффективной концентрации FtsZ при SOS-ответе, Этот результат впервые напрямую показал, что действие SulA эквивалентно понижению концентрации FtsZ. Кроме того, получены новые данные о восстановлении нормального деления клетки после ее блокирования при SOS-ответе. Эти результаты свидетельствуют о том, что после окончания экспрессии sulA клетки E. coli способны быстро восстанавливать нормальное деление, при этом главным механизмом правильного позиционирования септы, по-видимому, является механизм нуклеоидной окклюзии. Было также показано, что белок FtsZ формирует кольца деления в удлиненной клетке не сразу, а через этап образования промежуточных спиралеобразных полимерных форм. Этот важный результат является существенным вкладом в понимание регуляции FtsZ в ходе SOS-ответа. Дополнительно к плану работ нами был адаптирован метод субдифракционной микроскопии для визуализации рекомбинантных белков FtsZ из нескольких видов микоплазм, продуцирующихся в E. coli. Были получены уникальные данные о взаимодействии белков FtsZ трёх видов микоплазм – Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma hominis и Mycoplasma gallisepticum с аппаратом деления E. coli, а также получены субдифракционные изображения структур, формируемых этими белками в клетках E. coli. Полученные данные говорят о вероятном взаимодействии белков FtsZ микоплазм с собственным FtsZ E. coli, а также с системой пространственного позиционирования Z-кольца. Дальнейшие исследования, в том числе с субдифракционной визуализацией FtsZ в клетках микоплазм, должны помочь получить новые важные сведения о делении этих бактерий, а также о роли FtsZ в этом процессе. С целью получения информации о деталях механизма блокирования синтеза белка проведены работы по изучению межмолекулярных взаимодействий в функциональных рибосомных комплексах, включая влияние антибиотиков на реакцию транслокации. С использованием флуоресцентных меток при помощи спектрофлуориметра остановленного потока была охарактеризована кинетика ряда реакций цикла элонгации в трансляционной системе in vitro на основе термофильных и мезофильных компонентов. В качестве флуорофоров использовались профлавин и BODIPY FL. Наблюдение за взаимодействием тройного комплекса EF-Tu-GTP-Phe-tRNAPhe с рибосомой показало, что при температуре, естественной для мезофильных организмов (20 - 37°С), скорость парциальных реакций в А сайте рибосомы при использовании мезофильного элонгационного фактора на порядок превышает скорость аналогичных реакций с термофильным фактором. Добавление антибиотика тетрациклина приводит к кинетическому ингибированию реакции связывания в А сайте, как в случае мезофильного, так и в случае термофильного фактора элонгации EF-Tu. Были получены и проанализированы температурные зависимости скорости реакции транслокации для термофильного и мезофильного элонгационного фактора EF-G. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что ключевую роль в кинетике транслокации играют взаимодействия между рибосомой и тРНК, а специализированный элонгационный фактор не влияет на температурную зависимость скорости данной реакции. Был поставлен ряд экспериментов для определения влияния некоторых антимикробных агентов на реакцию транслокации, катализируемую термофильным и мезофильным фактором EF-G. Дифференциальный анализ флуоресцентных сигналов от меток, расположенных в разных частях претранслокационных комплексов, показал, что ингибирование реакции прямой ГТФ-зависимой транслокации, осуществляемой термофильным фактором, имеет сходный характер ингибирования с таковым для мезофильного фактора. Среди характерных механизмов ингибирования следует отметить рассинхронизацию движения тРНК (физического перемещения акцепторного конца и угла L-образной структуры тРНК). На основании кристаллографических данных были построены полноатомные модели комплексов белка DusC с триптофановой тРНК. Методами молекулярного моделирования были найдены разные конформации, при которых уридины в определенных положениях оказывались в активном центре белка DusC, и при этом имелось достаточное количество контактов для образования комплекса. При помощи моделирования молекулярной динамики были построены траектории для ряда комплексов и произведена оценка их стабильности.