КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 15-14-10008

НазваниеПрименение субмикронных инкапсулированных сенсоров в прижизненной (in vivo) диагностике стрессовых состояний эндемичных гидробионтов оз. Байкал

РуководительМеглинский Игорь Владиславович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Иркутский государственный университет", Иркутская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2015 г. - 2017 г.

Конкурс№7 - Конкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований с привлечением молодых исследователей».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словаинкапсулированные оптические сенсоры, экспресс диагностика, in vivo, стресс, стресс- адаптация, экологический мониторинг

Код ГРНТИ62.00.00

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Разработки новейших биомедицинских и биосенсорных технологий, так же как и технологий мониторинга и прогнозирования состояния окружающей среды, включены в перечень «критических технологий» - приоритетных направлений развития науки РФ. Применение оптических сенсоров для количественной экспресс-оценки и качественного анализа внутренних сред живых организмов in vivo является одним из наиболее перспективных направлений биомедицинского и экологического скрининга. Применение оптических подходов рассматривается как особенно перспективное направление, поскольку такие методы позволяют осуществлять прямой неинвазивный скрининг образца. На сегодняшний день создано большое количество коммерчески доступных флуоресцентных сенсоров, позволяющих проводить комплексную оценку физико-химических характеристик жидких сред. Однако при использовании данных сенсоров в живых организмах in vivo, возникают проблемы токсичности флуоресцентных сенсоров, их биодеградируемости, срока работы и трудностей с получением сигнала от вещества, растворённого во всём объёме исследуемой среды. Одним из перспективных способов решения этих проблем является технология инкапсулирования оптических сенсоров в полупроницаемые оболочки. Это позволяет с одной стороны сохранить чувствительность сенсора к параметрам среды, а с другой — локализовать сенсор внутри оболочки и, таким образом, снять проблему токсичности, увеличить срок работы сенсора и сконцентрировать его в замкнутой области, что упрощает получение сигнала. Экологический мониторинг и экспресс-диагностика физиологических состояний живых организмов являются одними из возможных направлений использования оптических сенсоров. Наибольшие перспективы их применения открываются для мониторинговой оценки уникальных эндемичных сообществ древних экосистем. Связано это с тем, что при мониторинговых исследованиях древних экосистем необходимо принимать во внимание специфику эндемичных организмов, накладывающую существенные ограничения на возможность применения стандартных методов и подходов Основной задачей предлагаемого проекта является апробация различных возможностей использования инкапсулированных оптических сенсоров для диагностики стрессовых состояний гидробионтов (in vivo) и отработка технологии их применения в области экологии и экофизиологии гидробионтов , а также при мониторинговых исследованиях уникальных древних экосистем. Работа будет выполняться с использованием модельной системы из групп родственных и близкородственных видов доминантных эндемиков озера Байкал, представителей различных таксонов: насекомых (личинок ручейников (Trichoptera) и хирономид (Chironomidae)), сиговых и хариусовых рыб (Coregonidae, Thymallinae), а также реснитчатых червей турбеллярий (Turbellaria). Инкапсулирование оптических сенсоров будет произведено по технологии полиэлектролитных многослойных капсул (ПМ-капсул). Благодаря проницаемости стенок ПМ-капсул только для низкомолекулярных веществ будет исключено возможное токсичное влияние сенсора на ткани организма, но при этом сохранена работоспособность инкапсулированных мультипараметрических оптических сенсоров. ПМ-капсулы будут введены во внутренние среды тестируемых организмов путем инъекций и перорально с пищей, что позволит сформировать оптимальную методику для введения инкапсулированных сенсоров в дальнейшей работе, а также позволит определить основные ткани и органы, в которых происходит аккумуляция введённых капсул, и оценить их токсичность для исследуемых организмов с помощью комплекса высокоэффективных биомаркеров. Для мониторинга распространения ПМ-капсул в органах будет использована флуоресцентная и конфокальная сканирующая лазерная микроскопия с использованием совмещённого спектрометра. Параметры физиологического состояния организма до и после введения ПМ-капсул будут оценены с использованием высокочувствительных методов молекулярно-биологического и биохимического анализа. В результате проведённого исследования будет отработана новейшая технология применения инкапсулированных оптических сенсоров для детекции стрессовых состояний живых организмов и оценены молекулярно-биологические и биохимические реакции гидробионтов на введение сенсоров in vivo. Будет сделано заключение о потенциальных перспективах и возможных рисках применения данных сенсоров для экспресс-оценки стрессовых состояний организмов. Впервые с использованием разработанных методов будет проведена сопоставительная оценка и определены пороги чувствительности к влиянию разнообразных факторов среды на доминантных видах байкальских эндемичных организмов. Будет сделан прогноз и описаны экосистемные риски при сохранении (или росте) текущих уровней негативных воздействий на экосистему озера Байкал, включая как факторы антропогенного влияния, так и фактор глобальных климатических изменений. Сама по себе разрабатываемая в рамках проекта технология экспрессной и высокоточной оценки стрессовых состояний живых организмов in vivo с использованием инкапсулированных оптических сенсоров даст новый мощный инструмент в руки специалистов и исследователей в области биологии развития и экофизиологии. Учитывая тот факт, что базовые клеточные и физиологические процессы, лежащие в основе стресс-адаптации, у всех живых организмов близки (будь то насекомые, черви, рыбы или человек), мы предполагаем, что многие из полученных в ходе проекта материалов и наработок, в дальнейшем могут найти применение и в других областях фундаментальной науки, а также при разработке прикладных биотехнологий, ориентированных на применение в аквакультуре, различных областях сельского хозяйства и в биомедицине.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения данного проекта будет разработана и апробирована технология использования инкапсулированных оптических сенсоров для оценки стрессового статуса позвоночных и беспозвоночных животных на примере ряда доминантных видов эндемичных гидробионтов озера Байкал. Будут оценены преимущества и недостатки разрабатываемой технологии по сравнению с современными биохимическими и молекулярными методами идентификации стрессовых состояний. В качестве объектов исследования будут выбраны одни из ключевых таксономических групп байкальской фауны: личинки ручейников (Trichoptera) и хирономид (Chironomidae), сиговые и хариусовые рыбы (Coregonidae, Thymallinae), а также турбеллярии (Turbellaria). Предложенная технология может быть использована при разработке эффективных экспрессных методик мониторинга не только озера Байкал, но и других уникальных водоёмов планеты. Полученные результаты позволят оценить чувствительность изучаемых групп байкальских гидробионтов к изменению ряда параметров среды и сравнить данных эндемиков с палеарктическими аналогами, на основе чего будет сделан прогноз негативных воздействий на экосистему Байкала за счёт текущих уровней антропогенного воздействия и изменения климата. Результаты исследования будут иметь не только фундаментальную научную значимость, но и большой потенциал практического применения. В настоящее время развитие специализированных сенсоров для быстрой, многопараметрической и количественной диагностики сложных образцов — это одна из важнейших задач, решаемых специалистами. Подобные «умные сенсоры» особенно необходимы для исследований в фармакологической и пищевой индустрий, в области биоинженерии и контроля биологических процессов, а также в области биомедицины. Несмотря на большое количество работ в этом направлении, на сегодняшний день ни один из нескольких апробированных in vivo инкапсулированных сенсоров не показал достаточного соответствия всем необходимым требованиям, в частности нуждами медицинской диагностики. Формулируемая нами в рамках проекта постановка задачи смещает акцент с использования инкапсулированных сенсоров из области медицинского применения, в область экспериментальной экофизиологии животных и экологического мониторинга. Благодаря такому изменению приоритетов снимаются многие требования и ограничения, связанные с медицинским применением, и появляются новые, ранее не учитываемые, возможности отработки методик на множестве разнообразных организмов, с различными характеристиками, что открывает особые перспективы для развития данной технологии. Сама по себе технология экспрессной и высокоточной оценки стрессовых состояний живых организмов in vivo с использованием инкапсулированных оптических сенсоров даст новый мощный инструмент в руки специалистов и исследователей в области биологии и экофизиологии. Учитывая тот факт, что многие базовые клеточные и физиологические процессы, лежащие в основе стресс-адаптации, у всех живых организмов близки (будь то насекомые, черви, рыбы или человек), мы предполагаем, что многие из полученных в ходе проекта материалов и наработок, в дальнейшем могут найти применение и в других областях фундаментальной науки, а также при разработке прикладных биотехнологий, ориентированных на применение в аквакультуре, различных областях сельского хозяйства и в биомедицине.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
По результатам первого года выполнения проекта были выбраны оптимальные модельные виды среди исследуемых групп байкальских гидробионтов для проведения дальнейших работ. Установлено, что автофлуоресцентные характеристики некоторых органов данных видов не препятствуют применению инкапсулированных сенсоров как в ювенильной фазе развития, так и во взрослом организме. Для выбранных модельных видов определены оптимальные органы и места инъекций для использования инкапсулированных сенсоров, а также получены комплексные данные, свидетельствующие о низкой токсичности инкапсулированных сенсоров для данных животных. Сформирован базовый набор флуоресцентных сенсоров, подходящих для совместного инкапсулирования и одновременного мониторинга ряда физиологических показателей. Существенно усовершенствована методика инкапсулирования оптических сенсоров, решён ряд методологических проблем при применении инкапсулированных сенсоров in vivo. Показана взаимосвязь между температурным стрессовым воздействием и регистрируемыми с помощью инкапсулированных сенсоров характеристиками организма.

Публикации

1. A. Gurkov, Y. Lubyaga, D. Bedulina, E. Borvinskaya, B. Baduev, E. Shchapova, M. Timofeyev Application in vivo of encapsulated optical sensors to ions, pH and charged metabolites in light of Donnan's effect PLOS ONE, - (год публикации - 2016)

2. A.N. Gurkov, I.A. Belousova, E.P. Shchapova, B.K. Baduev, K.P. Vereshchagina, M.A. Timofeyev Injections of Encapsulated pH Sensor SNARF-1 do not Induce Apparent Stress Reaction in Larvae of Endemic Baikal Caddisflies Baicalina thamastoides Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 12, No. 1, 2016, pp. 52-59, ISSN 1997-0838 (год публикации - 2016)

3. Bibikova O., Popov A., Bykov A., Fale sA., Yuan H.-K., Skovorodkin I., Kinnunen M., Vainio S., Vo-Dinh T. and Meglinski I. Plasmon-resonant gold nano-stars with variable size as contrast agents for imaging applications IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, - (год публикации - 2016)

4. Lee K., Danilina A.V., Kinnunen M., Priezzhev A.V. and Meglinski I. Probing the Red Blood Cells Aggregating Force with Optical Tweezers. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, - (год публикации - 2016)

5. Axenov–Gribanov D., Vereshchagina K., Lubyaga Y., Gurkov A., Bedulina D., Timofeyev M. Determination of Lake Baikal endemic and palearctic amphipods thermal optima limits by changes in its stress markers. SEFS 9 - Symposium for European Freshwater Sciences (July 5-10, 2015, Geneva, Switzerland), Abstract book - Р.439 (год публикации - 2015)

6. Axenov–Gribanov D., Vereshchagina K., Lubyaga Y., Gurkov A., Bedulina D., Timofeyev M. Determination of Lake Baikal endemic and palearctic amphipods thermal optima limits by changes in its stress markers The 16th Colloquium amphipoda (Sept, 7-11, 2015, Aveiro, Portugal), Book of Abstracts, Р. 49 (год публикации - 2015)

7. Axenov–Gribanov D., Vereshchagina K., Lubyaga Y., Gurkov A., Bedulina D., Timofeyev M. Determination of Lake Baikal endemic and Palearctic amphipods thermal optima limits by changes in its stress markers ISEPEP6 - sixth International Symposium on the Environmental Physiology of Ectotherms and Plants (August 3 - 7 Aarhus, Denmark), P. 40 (год публикации - 2015)

8. Bedulina D.S., Evgen’ev M.B., Gurkov A.N., Timofeyev M. A., Zatsepina O.G. Proteomic thermal stress-responses of two species of Baikal amphipods (Eulimnogammarus cyaneus and E. verrucosus) with different thermotolerance. The 16th Colloquium amphipoda (Sept, 7-11, 2015, Aveiro, Portugal)., Book of Abstracts, p. 49-50 (год публикации - 2015)

9. Shchapova E., Sadovoy A. Application of polyelectrolyte microcapsules for monitoring stress conditions of aquatic organisms. IMRE's Scientific Research Forum. Singapore., 2 FusionopolisWay, #08-03 Innovis, Singapore 138634 (год публикации - 2015)

10. Кондратьева Е.С., Верещашина К.П., Щапова Е.П., Гурков А.Н., Бедулина Д.С., Тимофеев М.А. Влияние длительной акклимации в условиях повышенной солености среды на неспецифические механизмы стресс-резистентности амфипод Gammarus Lacustris Sars НГУ, Симбиоз – Россия 2015 : материалы VIII Всеросс. с междунар. участием конгресса молодых учёных-биологов / Новосиб. гос. ун-т. –Новосибирск, 2015. – 160 с. (год публикации - 2015)

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение второго года выполнения проекта получены списки из ряда флуоресцентных сенсоров, подходящих для совместного инкапсулирования и использования in vivo. Разработан программный алгоритм для вычленения сигнала от каждого из сенсоров и удаления автофлуоресцентного шума. Решён ряд технических задач, в том числе предложены новые методы для введения и визуализации микрочастиц в кровотоке рыб, проанализирована применимость апконверсионных частиц в качестве компонентов инкапсулированных сенсоров для нивелирования автофлуоресценции и другие. Проведены первые серии экспериментов по длительному мониторингу физиологического pH у взрослых рыб и личинок ручейников in vivo с помощью инкапсулированных сенсоров. Продемонстрирована функциональность инкапсулированных сенсоров для анализа физиологических показателей взрослых рыб в реальном времени одновременно в нескольких органах.

Публикации

1. Борвинская Е.В., Гурков А.Н., Щапова Е.П., Бадуев Б.К., Белоусова И.А., Меглинский И.В., Тимофеев М.А. Repetitive measurements of physiological pH by implantable optical sensors in muscles of adult Danio rerio: preliminary results Journal of Stress Physiology & Biochemistry, 12(4), pp. 91-95 (год публикации - 2016)

2. Борвинская Е.В., Гурков А.Н., Щапова Е.П., Бадуев Б.К., Садовой А., Меглинский И.В., Тимофеев М.А. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers Journal of Experimental Biology, Under review (год публикации - 2017)

3. Волкова Е.К., Янина И.Ю., Попов А.П., Быков А.В., Гурков А.Н., Борвинская Е.В., Тимофеев М.A., Меглинский И.В. Экофотоника: измерение температуры водных организмов с использованием антистоксовых люминофоров Квантовая электроника, На повтоном рецензировании (год публикации - 2017)

4. Гурков А.Н., Садовой А., Щапова Е.П., Те К., Тимофеев М.А., Меглинский И.В. Application of microencapsulated biomarkers in vivo for the next generation of bioassays Scientific Reports, Under review (год публикации - 2017)

5. Гурков А.Н., Щапова Е.П., Бедулина Д.С., Бадуев Б.К., Борвинская Е.В., Меглинский И.В., Тимофеев М.А. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring Scientific Reports, 6, 36427 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1038/srep36427

6. Борвинская Е.В., Щапова Е.П., Белоусова И.А., Бадуев Б.К., Тимофеев М.А. Подвижность флуоресцентных микрокапсул в тканях рыбы Danio rerio Материалы Всероссийской молодежной гидробиологической конференции "Перспективы и проблемы современной гидробиологии", стр. 154-155 (год публикации - 2016)

7. Гурков А.Н, Борвинская Е.В., Белоусова И.А., Щапова Е.П., Бедулина Д.С., Тимофеев М.А. Physiological measurements with microencapsulated fluorescent sensors and Donnan's effect International Conference on the Mathematical Modeling and High-Performance Computing in Bioinformatics, Biomedicine and Biotechnology, Novosibirsk, Russia, - (год публикации - 2016)

8. Гурков А.Н., Щапова Е.П., Белоусова И.А., Шатилина Ж.М., Меглинский И.В., Тимофеев М.А. Стресс-диагностика гидробионтов in vivo с использованием инкапсулированных оптических микросенсоров Всероссийская молодежная гидробиологическая конференция «Перспективы и проблемы современной гидробиологии», стр. 164-165 (год публикации - 2016)

9. Щапова Е.П., Гурков А.Н., Белоусова И.А., Бадуев Б.К.,Верещагина К.П., Тимофеев М.А. Личинки эндемичных байкальских ручейников Baicalina thamastoides не проявляют выраженную стресс-реакцию на введение инкапсулированного pH-сенсора SNARF-1 0-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология – наука 21 века”, стр. 413 (год публикации - 2016)

10. Щапова Е.П., Гурков А.Н., Белоусова И.А., Борвинская Е.В., Бадуев Б.К., Тимофеев М.А. Оценка стресс-реакции личинок эндемичного вида ручейников Baicalina thamastoides на инъекции инкапсулированного фруоресцентного сенсора SNARF-1 Материалы Всероссийской молодежной гидробиологической конференции "Перспективы и проблемы современной гидробиологии", стр. 251-252 (год публикации - 2016)

11. Щапова Е.П., Гурков А.Н., Белоусова И.В., Борвинская И.В., Бадуев И.В., Меглинский И.В. Прижизненное измерение pH гемолимфы байкальских эндемичных амфипод Eulimnogammarus verrucosus с помощью флуоресцентных микросенсоров Международная экологическая студенческая конференция «Экология России и сопредельных территорий», стр. 32 (год публикации - 2016)

12. Щапова Е.П., Гурков А.Н., Белоусова И.В., Борвинская И.В., Бадуев И.В., Меглинский И.В., Тимофеев М.А Метод микроинкапсулированных флуоресцентных сенсоров как перспективная технология для мониторинга состояния макрозообентоса озера Байкал Всероссийская конференция по крупным внутренним водоемам (V Ладожский симпозиум); Издательство "Лема", стр. 462-467 (год публикации - 2016)

13. Щапова Е.П., Гурков А.Н.,Бедулина Д.С., Белоусова И.В., Борвинская Е.В., Бадуев Б.К., Меглинский И.В., Тимофеев М.А. Применение инкапсулированных флуоресцентных сенсоров для прижизненного мониторинга pH гемолимфы байкальских эндемичных амфипод «Современное состояние биоресурсов внутренних водоемов и пути их рационального использования» Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 85-летию Татарского отделения, стр. 1150-1154 (год публикации - 2016)

14. Щапова Е.П., Гурков А.Н., Садовой А.В., Те К., Меглинский И.В., Тимофеев М.А. Применение метода инкапсулированных pH-сенсоров для прижизненного анализа внутренних сред Danio rerio в условиях стресса Зимняя научная школа для молодых ученых «Современная биология и биотехнологии будущего 2016», - (год публикации - 2016)

15. - В ИГУ научились сканировать физиологическое состояние живого организма in vivo Индикатор, - (год публикации - )

16. - Ученые ИГУ предложили метод прижизненного сканирования физиологического состояния живого организма в стрессовых условиях Телеинформ i38, - (год публикации - )

17. - СВЕТЯЩИЕСЯ КАПСУЛЫ ПОКАЗАЛИ УРОВЕНЬ PH ВНУТРИ ЖИВЫХ РАЧКОВ ТАСС - Чердак, - (год публикации - )

18. - Максим Тимофеев: Это знаковое событие Новости Иркутска, - (год публикации - )

19. - Метаболизм рачков-амфипод как маркер экологии Байкала НАУКА И ТЕХНОЛОГИИ РОССИИ – STRF.ru, - (год публикации - )

20. - Грустные байкальские рачки помогли разгадать механизмы стресса Lenta.ru, - (год публикации - )

21. - УЧЕНЫЕ ИГУ ПРЕДЛОЖИЛИ МЕТОД ПРИЖИЗНЕННОГО СКАНИРОВАНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ЖИВОГО ОРГАНИЗМА В СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЯХ Байкал24, - (год публикации - )

22. - Иркутские биологи научились исследованиям без убийства подопытных животных Сиб.фм, - (год публикации - )

23. - Ученые исследовали байкальских рачков-амфипод Новости сибирской науки, - (год публикации - )

24. - Новый метод исследования «вживую» изобрели иркутские учёные Бабр, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
На завершающем этапе проекта были разработаны новые методики подготовки и визуализации инкапсулированных флуоресцентных сенсоров. Отработано получение и применение нового типа инкапсулированного сенсора, чувствительного к кислороду. Введение в состав микросенсоров на кислород таких ферментов, как лактатоксидаза и глюкозооксидаза позволяет получить инкапсулированные сенсоры на молочную кислоту и глюкозу. Была показана возможность эффективного введения флуорофоров, иммобилизованных внутри нанолипосом, в кровеносную систему позвоночных через слизистую кишечника. Отработана методика двухрежимной дифракционной фазовой микроскопии, которая может быть использована для визуализации и определения механических характеристик инкапсулированных сенсоров. Показана возможность применения лазерной допплеровской флоуметрии в комбинации с термометрией для определения нарушений в микроциркуляции крови в периферических капиллярах позвоночных, что предоставляет эффективный неинвазивный инструмент для анализа возможных негативных эффектов, возникающих при введении инкапсулированных флуоресцентных сенсоров в кровеносную систему позвоночных. Было завершено изучение реакции организма насекомых и рыб на инъекции инкапсулированных сенсоров, а также функционала имплантированных микросенсоров для отслеживания физиологических параметров. В результате проведённого анализа установлено, что насекомые проявляют выраженную иммунную реакцию на микросенсоры: основная часть микрокапсул оказывается фагоцитирована гемоцитами уже через три часа после инъекции в жировое тело личинок. Те не менее, показано, что имплантированные микросенсоры могут быть использованы для эффективного отслеживания изменений физиологических параметров личинок этих насекомых в стрессовых условиях в течение, как минимум, часа после инъекции. Гистологический анализ рыб D. rerio после введения микросенсоров в кровеносную систему и мышцы показал, что их иммунные клетки также распознают и атакуют полимерные микрокапсулы, несмотря на биосовместимое покрытие, включающее внешний слой полиэтиленгликоля. Важно отметить, что в случае D. rerio фагоцитоз микросенсоров происходит медленнее, чем у G. mellonella, и приводит к поглощению существенной части микросенсоров лишь к суткам после инъекции. При этом протеолитические ферменты внутри фагоцитов не способны разрушить оболочку микрокапсул из использованных полимеров в течение долгого времени. В составе фагоцитов микрокапсулы, введённые в мышцы, оказались способны мигрировать далеко за пределы инъекционного канала, в частности к основанию плавников рыб, а затем далее, в эпидермис. Эта миграция происходит по лимфатическим протокам вдоль кровеносных капилляров. Микросенсоры, остающиеся в месте инъекции в мышцы, со временем инкапсулируются внутри ткани, что лишает их чувствительности к параметрам межклеточной среды. Показано, что при попадании в кровоток, основная часть микрокапсул распространяется в первые минуты после инъекции, и затем оседает преимущественно в органах с богатой разветвлённой капиллярной сетью (почка, жабры, печень), после чего их мобильность снижается. Анализ гистологических срезов тканей D. rerio после системного введения микрокапсул показывает, что крупные скопления микрокапсул вызывают местное воспаление, в отдельных случаях способное нарушить функционирование окружающего участка ткани. Однако основная часть микрокапсул, попавших в кровь, распределяется равномерно в паренхиме различных органов. В капиллярах жабр, синусах печени и почек микрокапсулы, в основном, представлены единичными объектами, вокруг которых не наблюдаются признаки воспаления или нарушения структуры ткани. При введении микросенсоров в кровоток с помощью инъекции в почку, у исследованных рыб не было обнаружено таких серьёзных нарушений морфологии почек, как тромбоз, фиброз кровеносных сосудов, некроз и фиброз почечных клубочков, гранулемы в паренхиме органа вдали от места инъекции, несмотря на наличие признаков хронического воспаления. Это позволяет охарактеризовать воспалительный процесс при внедрении импланта в почку как умеренный и носящий локальный характер. Установлено, что в краткосрочной перспективе показания имплантированных инкапсулированных сенсоров в кровеносной системе рыб D. rerio остаются стабильными в течение, как минимум, шести часов, и демонстрируют, в частности, медианный pH крови рыб около 7,4. Однако в долгосрочной перспективе (сутки и более) значительная часть показаний отклоняется от контрольных, а разброс данных повышается. Этот результат хорошо согласуется с данными гистологического анализа, продемонстрировавшего поглощение инкапсулированных сенсоров фагоцитами, после чего показания микросенсоров, вероятно, отражают условия внутри лизосом иммунных клеток. Данные результат дополнительно подтверждает необходимость поиска биосовместимого покрытия, обеспечивающего более эффективное скрытие микросенсоров от иммунной системы позвоночных и беспозвоночных, однако разработанные инкапсулированные флуоресцентные сенсоры уже сейчас могут быть использованы для отслеживания физиологических показателей рыб, по крайней мере, в течение нескольких часов после инъекции. Проведённые экспериментальные экспозиции D. rerio в различных стрессовых условиях (гипоксия, различные уровни гиперкапнии) и после окончания воздействия негативного фактора дополнительно подтвердили чувствительность имплантированных инкапсулированных сенсоров к изменениям pH крови рыб. В целом, полученные в ходе выполнения проекта данные демонстрируют применимость инкапсулированных флуоресцентных сенсоров для имплантирования в организм гидробионтов и других животных для отслеживания их физиологических показателей и диагностики стрессовых состояний in vivo и в реальном времени.

Публикации

1. Irina Y. Yanina, Alexey P. Popov, Alexander V. Bykov, Igor V. Meglinski, and Valery V. Tuchin Monitoring of temperature-mediated phase transitions of adipose tissue by combined optical coherence tomography and Abbe refractometry Journal of Biomedical Optics, - (год публикации - 2018)

2. Борвинская Е., Гурков А., Щапова Е., Бадуев Б., Меглинский И., Тимофеев М. Distribution of PEG-coated hollow polyelectrolyte microcapsules after introduction into the circulatory system and muscles of zebrafish Biology Open, - (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1242/bio.030015

3. Борвинская Е., Гурков А., Щапова Е., Бадуев Б., Шатилина Ж., Садовой А., Меглинский И., Тимофеев М. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers Biology Open, 6: 673-677 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1242/bio.024380

4. Борвинская Е., Гурков А., Щапова Е., Карнаухов Д., Садовой А., Меглинский И., Тимофеев М. Simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection Journal of Visualized Experiments, under review (год публикации - 2018)

5. Гурков А., Борвинская Е., Щапова Е., Тимофеев М. Restraint of small decapods and amphipods for in vivo laboratory studies Crustaceana, submitted, under review (год публикации - 2018)

6. Гурков А., Садовой А., Щапова Е., Тех Ц., Меглинский И., Тимофеев М. Microencapsulated fluorescent pH probe as implantable sensor for monitoring the physiological state of fish embryos PLoS ONE, № e0186548 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0186548

7. Дас Н.К., Дэй Р., Чакраборти С., Паниграфи П.К., Меглинский И., Гош Н. Submicron scale tissue multifractal anisotropy in polarized laser light scattering Laser Physics Letters, accepted, in press (год публикации - 2017)

8. Жеребцов Е.А., Жеребцова А.И., Доронин А., Дунаев А.В., Подмастерьев К.В., Быков А., Меглинский И.И. Combined use of laser Doppler flowmetry and skin thermometry for functional diagnostics of intradermal finger vessels Journal of Biomedical Optics, 22 (4), статья № 040502 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1117/1.JBO.22.4.040502

9. Мизева И., Маковик И., Дунаев А., Крупаткин А., Меглинский И. Analysis of skin blood microflow oscillations in patients with rheumatic diseases Journal of Biomedical Optics, 22 (7), статья № 070501 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1117/1.JBO.22.7.070501

10. Мюллюля Т., Харджу М., Корхонен В., Быков А., Квиниеми В., Меглинский И. Assessment of the dynamics of human glymphatic system by near-infrared spectroscopy Journal of Biophotonics, - (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1002/jbio.201700123

11. Попов А.П. Волкова Е.К., Гурков А.Н., Борвинская Е.В., Быков А.В., Тимофеев М.А., Меглинский И.В. Temperature-induced stress assessment of small aquatic animals by luminescent particles Journal of Biophotonics, submitted, under review (год публикации - 2018)

12. Попов А.П., Быков А.В., Меглинский И.В. Influence of probe pressure on diffuse reflectance spectra of human skin measured in vivo Journal of Biomedical Optics, 22 (11), статья № 110504 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1117/1.JBO.22.11.110504

13. Стелмащук О., Жеребцов Е., Жеребцова А., Кузнецова Е., Винокуров А., Дунаев А., Мамошин А., Снимщикова И., Борсуков А., Быков А., Меглинский И. Noninvasive control of the transport function of fluorescent coloured liposomal nanoparticles Laser Physics, 14 (6), № 065603 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1088/1612-202X/aa6ef5

14. Талайкова Н.А., Попов А.П., Кальянов А.Л., Рябухо В.П., Меглинский И.В. Dual mode diffraction phase microscopy for quantitative functional assessment of biological cells Laser Physics Letters, 14 (10), статья № 10560 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1088/1612-202X/aa7d38

15. Ушенко В.А., Дуболазов А.В., Подкамин Л.Я., Сакчновский М.Ю., Боднэр А.Б., Ушенко Ю.А., Ушенко А.Г., Быков А., Меглинский И.И. Mapping of polycrystalline films of biological fluids utilizing the Jones-matrix formalism Laser Physics, accepted, in press (год публикации - 2017)

16. Гурков А., Борвинская Е., Щапова Е., Бадуев Б., Меглинский И., Тимофеев М. Tracking physiological status of aquatic organisms in vivo by microencapsulated biomarkers based on fluorescent molecular probes Proceedings of 10th Symposium for European Freshwater Sciences, p. 208. (год публикации - 2017)

17. Гурков А., Борвинская Е., Щапова Е., Бадуев Б., Меглинский И., Тимофеев М. pH monitoring in circulatory system of aquatic animals in vivo using implantable fluorescent microsensors Proceedings of young biologists science week-2017, pp. 180-184 (год публикации - 2017)

18. Гурков А., Садовой A., Те С., Борвинская Е., Попов А., Тимофеев М., Меглинский И. Functional interior monitoring of pH changes in tiny zebrafish embryo in vivo Proceedings of European Conferences on Biomedical Optics (ECBO), - (год публикации - 2017)

19. Гурков А., Щапова Е., Бедулина Д., Бадуев Б., Меглинский И., Тимофеев М. Implantable pH-sensitive optical microsensors for in vivo stress assessment of amphipods Proceedings of 17th International Colloquium on Amphipoda, 8 (2): 623–624 (год публикации - 2017)

20. Щапова Е. П. , Гурков А. Н., Борвинская Е. В., Белоусова И. А., Меглинский И. В., Тимофеев М. А. Микроинкапсулированные флуоресцентные сенсоры как инструмент для мониторинга физиологического состояния амфипод in vivo материалы Всероссийской, с международным участием, конференции "Симбиоз- Россия 2017", стр. 152-153 (год публикации - 2017)

21. Щапова Е.П., Борвинская Е.В., Гурков А.Н., Бадуев Б.К., Шатилина Ж.М., Меглинский И.В., Тимофеев М.А. Применение инкапсулированного флуоресцентного красителя SNARF-1 для измерения рН крови и межклеточной жидкости мышц рыб Danio rerio Материалы 21-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология – наука 21 века”., стр. 305 (год публикации - 2017)

22. Щапова Е.П., Гурков А.Н., Б.К. Бадуев И.В. Меглинский, М.А. Тимофеев. Имплантируемые оптические микросенсоры для динамического стресс-мониторинга состояния байкальских амфипод Материалы Всероссийской научной конференции “Фундаментальные проблемы экологии России”, стр. 2014 (год публикации - 2017)

23. Щапова Е.П., Гурков А.Н., И.В. Меглинский, М.А. Тимофеев. Применение метода инкапсулированных pH-сенсоров для прижизненного анализа гемолимфы байкальских амфипод Eulimnogammarus verrucosus в условиях стресса Вестник Иркутского государственного университета ФГБОУ ВО «ИГУ», выпуск 20, стр. 24-25 (год публикации - 2017)

24. - Рыба-сенсор Чердак, - (год публикации - )

25. - СЛУЖИЛИ ДВА ЭНДЕМИКА. БАЙКАЛЬСКИЕ БИОЛОГИ НАШЛИ ПРИМЕНЕНИЕ УНИКАЛЬНОЙ ЖИВНОСТИ. Газета Поиск, - (год публикации - )

26. - Виват, физики? Альтаир, - (год публикации - )

27. - СЕКВЕНИРОВАНИЕ ЭКЗОМА, ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИЕ КЛЕТОК И ТРАНСФЕР ТЕХНОЛОГИЙ Наука и технологии России, - (год публикации - )

28. - "РобоСиб-2017" в Иркутске: 195 команд боролись за победу на фестивале робототехники IrkutskMedia.ru/, - (год публикации - )

29. - Состояние здоровья рыбок данио рерио измерили при помощи красителя Индикатор, - (год публикации - )

30. - Микросенсоры оценивают здоровье по кислотности крови Чердак, - (год публикации - )

31. - Иркутские ученые создали сенсор для оценки состояния животных Газета.ru, - (год публикации - )

32. - Рачок в шоке Коммерсант, - (год публикации - )

33. - Байкальские рачки Вести Иркутск, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
В результате выполнения данного проекта разработана и апробирована технологии прижизненной оценки состояния живых организмов с использованием инкапсулированных флуоресцентных сенсоров. Данная технология имеет широкие перспективы внедрения как в существующие программы экологического мониторинга водоёмов, в том числе мониторинга уникальной экосистемы озера Байкал, так и в различные разработки в области экотехнологии и биомедицины. Разработанные методики могут быть использованы для отслеживания состояния гидробионтов в аквакультуре рыб и ракообразных, в коммерческой оценке токсичности новых химических соединений на эмбрионах рыб, а также в широком спектре фундаментальных и прикладных исследовательских работ в области биологии, агротехнологии и биомедицины.