Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В проекте впервые проводятся всесторонние исследования процесса выхода калия из клеток растений в связи его с такими ключевыми «маркерами» стресса, как синтез активных форм кислорода (АФК), индукция автофагии и запрограммированной клеточной гибели (ЗКГ). Выход калия – одна из наиболее ранних и известных реакцией клетки растения на стресс, однако с физиологической точки зрения она практически на изучена. В 2015 г. были развиты методические подходы для исследования механизмов выхода К+ из клеток корня модельного растения Arabidopsis thaliana L. Heynh (арабидопсис) при стрессе, а также зависимости протекания ключевых стресс-индуцируемых реакций растительной клетки, таких как ЗКГ, автофагия и др., от уровня калия. В ходе выполнения проекта успешно освоена методика измерения стресс-индуцируемого выхода катионов с использованием радиотрейсеров 86Rb+ и 137Cs+ на корнях арабидопсиса. С ее помощью проведена серия опытов по регистрации выхода катионов из корня арабидопсиса под действием засоления. Получены первичные данные о выходе катионов из корня растений арабидопсиса дикого типа, нокаутного мутанта gork1-1 и линий gork1-1, экспрессирующих генетическую конструкцию, в котором в последовательности К+-канала GORK произведена замена цистеина в положении 151 на серин. Выполнены генотипирование и анализ уровня экспрессии трансгенов в нокаутной линии арабидопсиса gork1-1 и созданных на ее основе трансгенных линий, экспрессирующих нативный К+-канал GORK-WT либо GORK-C151S с заменой цистеина в 151 положении на серин. Охарактеризованные линии представляют собой один из главных инструментов решения поставленных задач и будут использоваться на последующих этапах выполнения проекта. Проведены подготовительные эксперименты и адаптирована методика измерений с использованием флуоресцентных зондов CaspACE FITC-VAD-fmk (Promega) и DeadEnd Fluorimetric TUNEL (Promega). Эти методы критически важны для успешного проведения работ по проекту, так как в дальнейшем позволит проанализировать отличия в трансгенных линиях по GORK и установить роль цистеина в положении С151 в индукции ЗКГ и предшествующей ей автофагии. Проведена успешная адаптация комплекса методов биохимии, клеточной биологии и фармакологического анализа, используемых для изучения процесса автофагии и генерации активных форм кислорода (АФК) при развитии окислительного стресса, к объектам исследований в рамках проекта. Начата разработка методики мониторинга активности TOR-киназного комплекса - основного негативного регулятора автофагии и индуктора анаболизма у растений и животных. Запланированные на отчетный 2015 год исследования успешно выполнены. Получены экспериментальные данные и адаптирован комплекс методов, необходимых для решения задач проекта, запланированных на последующие этапы его выполнения.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Данный проект направлен на детальное исследование нового в физиологии растений механизма регуляции функций растительной клетки при стрессе - оттока К+ через калиевые каналы, активирующиеся активными формами кислорода (АФК). В проекте развивается гипотеза, согласно которой потеря клетками К+ является индуктором автофагии и запрограммированной клеточной гибели (ЗКГ) при засолении, окислительном стрессе и других видах неблагоприятных воздействий. За 2016 г. достигнуты все важнейшие цели, запланированные на данный этап. Также получен ряд дополнительных данных, значительно расширяющих научную сферу проекта. К наиболее важным результатам работы за отчетный период следует отнести экспериментальное подтверждение роли К+ в качестве регулятора автофагии при абиотическом стрессе, а также раскрытие молекулярной природы активации К+-канала, лежащего в основе данного явления. Эти результаты позволяют развить новую концепцию - К+-зависимой регуляции стрессовых ответов в корне высших растений. Ниже перечислены основные выполненные за 2016 г. экспериментальные работы с указанием основных достигнутых результатов. (1) Разработаны и успешно использованы экспериментальные системы, основанные на использовании ряда флуоресцентных зондов и генетически-кодируемых маркеров, для изучения автофагии, вызываемой в клетках корня арабидопсиса солевым, окислительным и другими видами стрессов. (2) С использованием данных методик проанализирован уровень формирования автофагосом в корнях растений арабидопсиса дикого типа (Ws0) и нокаутных линиях gork1-1, лишенных основного наружу-выпрямляющего К+-канала корня (GORK). В результате показано, что индукция автофагии при воздействии солевого стресса ослабевает при дисфункции К+-каналов. Также установлено, что обработка специфическим блокатором К+-каналов - тетраэтиламмонием (ТЭА+) ингибирует формирование автофагосом при окислительном, гипоосмотическом и солевом стрессе. Это напрямую демонстрирует правомерность гипотезы, согласно которой автофагия активируется пониженными уровнями К+ в клетке и контролируется работой калиевых каналов. (3) Получены данные, указывающие на участие белка ATG8a в эндоцитозе, индуцируемом гипоосмотическим шоком. Это позволяет значительно улучшить дизайн опытов для изучения автофагии и избежать возможным артефактов, связанных с индукцией эндоцитоза. (4) Установлено, что трансгены gork полноценно экспрессируются в линиях, комплементированных как полной кДНК нативного GORK под контролем эндогенного промотора гена GORK арабидопсиса (линии W57.6.2.4 и W57.4.5.7), так и кДНК GORK с замещением остатка цистеина 151 на серин C151S, также под контролем собственного промотора гена GORK (линии W56.3.6.4 и W56.7.4.8). (5) Разработан и испытан протокол для высокоточного измерения стресс-индуцированного выхода радиоактивно-меченного рубидия 86Rb+, являющегося физиологическим аналогом К+, из корней арабидопсиса. Продемонстрировано, что NaCl, гидроксильные радикалы и Н2О2 стимулируют отток 86Rb+ из клеток корня преимущественно через К+-каналы GORK. Обнаружено, что аминокислота Цистеин в положении 151 в белке GORK ответственна за его активацию под действием АФК и NaCl, а также за значительную часть потери K+ клетками корня при стрессе. (6) Обнаружен «ростовой» фенотип растений арабидопсиса, лишенных К+-канала GORK (gork1-1) и растений, в которых Цистеина-151 в данном канале заменен на Серин. Он проявляется в пониженной чувствительности к Н2О2. Такие растения на средах с Н2О2 росли значительно лучше по сравнению с диким типом или растениями gork1-1 с возмещенным GORK. Эти данные представляют прямое доказательство участия GORK в Н2О2-зависимой регуляции фундаментальных физиологических функций в корне арабидопсиса. (7) Исследовано воздействие тяжелых металлов на жизнеспособность клеток и симптомы ЗКГ в корнях растений арабидопсиса с измененной работой K+-каналов. Полученные данные указывают на участие К+-каналов GORK в Ni2+-индуцируемом повреждении клеток корня и развитие ЗКГ при высоких уровнях Ni2+ в среде. (8) Отработана техника регистрации синтеза гидроксильных и аскорбильных радикалов in vitro и in vivo (в интактных корнях арабидопсиса) при помощи спектроскопии электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР). В результате продемонстрирован ранее неизвестный в физиологии растений механизм действия полиаминов – снижение уровня гидроксил-радикалов. Данное свойство полиаминов, которые являются важнейшими стресс-протектантами растений, может иметь большую роль в регуляции гидроксил-зависимых процессов, таких как активация К+-каналов. Также показано, что уровень генерации гидроксил-радикалов значительно снижается при введении в среду восстановленного глутатион, но не изменяется в присутствие манниола, глюкозы и аланина. (9) Показано, что токсическое действие наночастиц серебра на растения арабидопсиса связано с окислением L-аскорбиновой кислоты в клетках корня, а не с предложенным в литературе механизмом индукции фентоновских реакций синтеза гидроксильных радикалов. (10) Адаптирована и оптимизирована для нужд проекта методика мониторинга активности TOR киназного комплекса, представляющего собой систему, подавляющую и контролирующую автофагию в растительных клетках. Проведено сравнение активности TOR у растений, выращенных на средах с адекватным и низким уровнем обеспеченности K+. В результате показано, что уровень клеточного К+ контролирует активность TOR-киназы. (11) Протестировано воздействие смесей, генерирующих гидроксил-радикалы, а также высоких уровней NaCl на протеазную и эндонуклеазную активность в корне, коррелирующую с ЗКГ. Показано, что цистеиновый остаток 151 К+-канала GORK ответственен за индукцию протеазной и эндонуклеазной активности при данных стрессовых воздействиях. (12) Начато тестирование К+-зависимости автофагии и ЗКГ в корнях группы ATG-нокаутов (atg5, atg7, atg9 и др.) с нарушениями процесса запуска автофагии. (13) Протестирован синтез АФК в клетках гетеротрофной суспензионной культуры табака BY-2 с увеличением клеточного пероксисомного пула. С использованием данной системы обнаружено, что уровень ЗКГ зависит от уровня конститутивной автофагии и активности каталазы в пероксисомах. (14) Выполнены эксперименты по индукции автофагии у растений с различным уровнем стабильности антенны при темновом стрессе. Продемонстрирована более высокая активация уровней экспрессии основных ATG-генов в листьях ячменя дикого типа по сравнению с мутантами chlorina с заблокированным биосинтезом хлорофилла b и низкой стабильностью фотосинтетической антенны. По итогам выполнения проекта подготовлены, сданы в печать и опубликованы статьи в рецензируемых международных изданиях, обозреваемых ISI Web of Science. Всего за 2016 г. 4 таких публикации. Полученные в проекте результаты были представлены в пленарных и стендовых докладах на международной конференции 4th international Symposium on Plant Signaling and Behavior (Saint-Petersburg, 19-24 June 2016; 270 участников), проведенной в отчетном году в рамках проекта (вэбсайт конференции: psb2016.com). По результатам данной конференции организован специальный выпуск журнала Functional Plant Biology, который выйдет под редакцией руководителя и исполнителей проекта (В.В. Демидчик, О.В. Войцеховская), а также ведущего ученого Великобритании в области физиологии стресса у растений профессора Франса Матуиса (Prof. Frans Maathuis, University of York). Выпуск будет включать более 30 статей.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В проекте раскрыты и детально охарактеризованы ранее неизвестные в биологии растений механизмы потери ионов калия (К+) клетками корня в связи с генерацией активных форм кислорода, индукции автофагии и запрограммированной клеточной гибели при стрессе. За период 2017 года были завершены исследования, направленные на установление и детальный анализ взаимосвязи между процессами стресс-индуцированного выхода К+, автофагии, ЗКГ, генерации АФК и другими реакциями, связанными с ранними стадиями ответа на важнейшие стресс-факторы среды. Основные результаты были получены по следующим направлениям: (1) Получено экспериментальное подтверждение ключевой роль калиевого канала GORK и регулируемого им уровня цитоплазматического калия в индукции автофагии и ЗКГ в клетках корня в условиях солевого и окислительного стресса. С использованием техники замены гелевых блоков выявлены значительные отличия в ростовых реакциях растений дикого типа и мутантных растений, лишенных функционального канала калиевого GORK, при концентрациях 100 мМ NaCl, и выше: рост мутантных растений практически не отличался от контроля, в то время как рост растений дикого типа сильно угнетался. Эти данные в совокупности с результатами 2016 г. подтвердили центральную роль канала GORK в реакции роста растений на солевой и окислительный стресс. Установлено, что К+-канал GORK, а именно его цистеиновый остаток 151, вероятно играющий роль сенсора АФК, участвует в индукции автофагии при окислительном и солевом стрессе. Показано, что степень активации автофагии зависит от уровня активности и состояния редокс-сенсора Cys151 канала GORK, которые определяют способность клеток в условиях стресса поддерживать необходимые концентрации цитоплазматического калия. Получены данные, впервые показывающие, что автофагия, индуцируемая умеренным (нелетальным) солевым и окислительным стрессом в клетках корня, выполняет цитопротекторную функцию. Полученные данные указывают на то, что Cys151 является важным, но не единственный редокс-сенсором в составе канала GORK, что было также отмечено ранее работах руководителя проекта (Demidchik et al., 2010). Результаты 2017 г. свидетельствуют о том, что множественное неспецифическое окислительное повреждение каналов способствует стабильному, приводя к чрезмерной потери калия в течение нескольких десятком минут. По результатам данной части проекта значительная часть данных, касающихся механизма работы АФК-сенсора в калиевом канале GORK в связи с запрограммированной клеточной гибелью и автофагией подготавливается к подаче в ведущий специализированный журнал в области экспериментальной биологии растений - Nature Plants. (2) Получены трансгенные растения Arabidopsis thaliana, экспрессирующие в мутантном бэкграунде gork1-1 либо без комплементации, либо с комплементацией полной кДНК нативного (линии W57.6.2.4 и W57.4.5.7) либо C151S-замещенного (линии W56.3.6.4 и W56.7.4.8) GORK генетическую конструкцию NeonGreen-ATG8a под контролем промотора убиквитина. Ранее растения gork1-1 были комплементированы либо полной кДНК нативного GORK под контролем эндогенного промотора гена GORK арабидопсиса (линии W57.6.2.4 и W57.4.5.7), либо кДНК GORK с замещением C151S, также под контролем собственного промотора гена GORK (линии W56.3.6.4, W56.5.3.9 и W56.7.4.8). В 2017 году все вышеперечисленные линии были трансформированы генетической конструкцией NeonGreen-ATG8a под контролем промотора убиквитина. Проростки семян Р0, полученных после агробактерильной трансформации соцветий линий Ws-0, gork1-1, W57.6.2.4, W56.3.6.4, W56.5.3.9 и W56.7.4.8 методом floral dip, были обработаны антибиотиком фосфинотрицин (BASTA). С выживших трансгенных растений были получены семена T2. Эти растения впервые позволяют напрямую изучать индукцию автофагии в зависимости от активности каналов GORK и уровня цитоплазматического калия. (3) Установлено, что хелатирование ионов никеля гистидином, позволяет растению через систему АФК-Са2+-сигнализации воспринимать присутствие в среде чрезмерных уровней никеля («никелевый стресс»). В рамках проекта было выявлено воздействие широкого диапазона концентраций Ni2+, а также хелатов Ni2+ с гистидином. При помощи спектроскопии электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) показано, что воздействие комплексов Ni(II)-(гистидин)2, но не никеля и не гистидина в отдельности, вызывает генерацию гидроксильных радикалов. Показано, что воздействие комплексов Ni(II)-(гистидин)2, но не экзогенного Ni2+ и не гистидина по отдельности, изменяет активность цитоплазматического Ca2+ ([Ca2+]cyt.) в корнях Arabidopsis thaliana, экспрессирующих экворин, и индуцирует [Ca2+]cyt. потоки. Установлено, что редокс-активные комплексами Ni(II)-(гистидин)2 вызывают развитие симптомов ЗКГ в корнях растений Arabidopsis thaliana дикого типа (Ws-0) и в меньшей степени gork1-1. Впервые установлено, что воздействие комплексов Ni(II)-(гистидин)2, но не экзогенного Ni2+ и не гистидина по отдельности, индуцирует К+-зависимую автофагию в клетках корня арабидопсиса. Детально исследована временная динамика автофагии, вызванной никелевым стрессом. Эти данные представляют собой первое для высших растений описание индукции автофагии никелевым стрессом, и первые данные для автотрофных организмов о механизме воздействия никеля на автофагию (индукция автофагии никелем была ранее показана для водоросли Chlamydomonas, однако ее механизм оставался неизвестным; Perez-Martin et al. 2015 Eukaryot. Cell). Сделан вывод, что хелатирование никеля гистидином представляет собой один из механизмов запуска цитопротекторной автофагии, защищающей клетку от токсического действия ионов Ni2+. Результаты данного раздела подготовлены для публикации в журнале Journal of Experimental Botany (будут поданы в январе 2017 г.). (4) Проведен глубокий анализ выходящих потоков калия через плазматическую мембрану на уровне работы канальных комплексов отдельных клеток при помощи техники пэтч-кламп. В частности, измерены токи калия у растений дикого типа (WS-0) и линий мутантов-нокаутов gork1-1 либо без комплементации, либо с комплементацией полной кДНК нативного GORK (линии W57.6.2.4 и W57.4.5.7) либо C151S-замещенного GORK (линии W56.3.6.4 и W56.7.4.8). Для наружу-направленной калиевой проводимости обнаружено наличие быстро- и медленно-активирующихся компонент. Показано, что гидроксильные радикалы в сильной степени увеличивают медленно-активирующиеся компоненту выходящего тока, слабо изменяя амплитуду быстрой компоненты. Продемонстрировано, что медленная компонента тока отсутствовует у растений, лишенных калиевого канала GORK, и воздействие гидроксильных радикалов не вызывает ее появления, тогда как у растений gork1-1 с возмещенным нативным GORK наблюдается нормальная активация медленных наружу-направленных токов, даже несколько превышающая дикий тип. Полученные данные указывают на то, что Cys-151 в комплексе К+-канала GORK участвует в прямом взаимодействии с АФК и опосредует активацию данного канала в ответ на продукцию в среде АФК при стрессе. Данные результаты также войдут в публикацию, планируемую для журнала Nature Plants. (5) Впервые установлено, что внеклеточный аскорбат в минимальной концентрации 50 мкМ может вызывать увеличение концентрации Ca2+ в цитозоле клеток корня и вызывает кальциевые токи, при этом блокаторы катионных каналов, гасители гидроксильного радикала, а также хелаторы переходных металлов ингибируют этот процесс. Показано с помощью техники пэтч-кламп, что аскорбат-зависимые кальциевые токи появляются только в клетках корня, обладающих нативной клеточной стенкой, но не в протопластах клеток корня. Эти данные позволяют предположить, что аскорбат влияет на Ca2+-проницаемые катионные каналы плазматической мембраны посредством генерации гидроксил-радикала в реакции с переходными металлами клеточной стенки (Cu2+, Fe3+), которые после восстановления аскорбатом до Cu+ и Fe2+ взаимодействуют с H2O2. С помощью ЭПР-спектроскопии показана генерация аскорбильного радикала под действием солевого стресса, которая полностью снималась восстановленным глутатионом. Совокупность этих данных подтверждает предположение о сигнальной роли внеклеточного аскорбата (предположительно в форме аскорбил-радикала). Аскорбатный сигналинг возможно участвует в запуске ЗКГ, но не автофагии. Статья находится на рецензии в журнале Journal of Experimental Botany.