Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Одним из наиболее универсальных показателей состояния системы адаптивного иммунитета организма является количественная и функциональная вариабельность клонального состава периферических Т- и В-лимфоцитов – индивидуальный репертуар Т-(В-)клеточных рецепторов (ТкР и ВкР). Настоящий проект направлен на определение динамики репертуара ТкР в ходе иммунного ответа организма млекопитающих на некоторые патогенны рода Flavivirus, а именно – в ходе вакцинации людей против вируса желтой лихорадки живой аттенуированной вакциной YF-17D. Методологической основой проекта является глубокий анализ полного репертуара периферических лимфоцитов, реконструируемый по результатам массированного секвенирования кДНК генов Т-клеточных (ТкР) рецепторов. Выполнение начального этапа проекта было сосредоточено на проведении вакцинации трем парам монозиготных близнецов, сборе серийных образцов крови и конструировании кДНК библиотек, секвенировании части библиотек и реконструкции индивидуальных репертуаров Т-клеток обследуемых в стационарном состоянии их систем адаптивного иммунитета. Результатами выполнения этой программы стали: 1. Подтверждение генетической идентичности близнецов внутри каждой пары по результатам комплексного генотипирования. Для генотипирования близнецовых пар были применены две независимые системы: оригинальная система генетической паспортизации, использующая 32 молекулярно-генетических маркера полиморфных инсерций AluYa5/b8 ретроэлементов генома человека, и вновь разработанная система HLA-типирования, основанная на массированном секвенировании фрагментов кДНК пяти основных генов HLA локуса. 2. Создание и успешное применение усовершенствованной системы пробоподготовки кДНК генов альфа- и бета-цепей Т-клеточного рецептора и реконструкции репертуаров Т-лимфоцитов по данным массированного секвенирования. Система объединяет три последовательных процедуры: - выделение тотальной РНК из анализируемой фракции клеток и конструирование специализированных библиотек кДНК зрелых генов альфа и бета цепей Т-клеточного рецептора; - крупномасштабное секвенирование полученных библиотек и реконструкция полного спектра антиген-распознающих участков Т-клеточных рецепторов; -углубленный биоинформатический анализ результатов секвенирования с использованием набора уникальных пакетов программного обеспечения MiXCR и tcR (http://imminfo.github.io/tcr/ ) 3. Реконструкция и подробная характеристика индивидуальных репертуаров периферических Т-лимфоцитов у трех пар монозиготных близнецов. А также, проведение предварительного сравнительного анализа Т-клеточных репертуаров близнецов и неродственных индивидов. Полученные за отчетный период результаты представляют уникальный набор новых данных об особенностях репертуаров Т-лимфоцитов у монозиготных близнецов и/или людей с различными HLA-гаплотипами.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Одним из наиболее универсальных показателей состояния системы адаптивного иммунитета организма является количественная и функциональная вариабельность клонального состава периферических Т- и В-лимфоцитов – индивидуальный репертуар Т-(В-)клеточных рецепторов (ТкР и ВкР). Настоящий проект направлен на определение динамики репертуара ТкР в ходе иммунного ответа организма человека на некоторые патогенны рода Flavivirus, а именно – при вакцинации живой аттенуированной вакциной YF-17D против вируса желтой лихорадки и культуральной очищенной инактивированной "Вакциной клещевого энцефалита". Методологической основой проекта является глубокий анализ полного репертуара периферических лимфоцитов, реконструируемый по результатам массированного секвенирования кДНК генов Т-клеточных (ТкР) рецепторов. Выполнение очередного этапа проекта было сосредоточено на завершении массированного секвенирования серийных библиотек кДНК ТкР с последующей реконструкцией серийных репертуаров Т-лимфоцитов и проведении сравнительного анализа получаемых репертуаров для предварительной оценки динамики клонального состава и изменений численности отдельных субпопуляций Т-клеток, происходящих в организме трех пар монозиготных близнецов при вакцинации против вируса желтой лихорадки. Результатами выполнения этой части программы стали: 1. Уточненная генетическая характеристика когорты вакцинируемых лиц, полученная по результатам высокоразрешающего HLA-типирования с использованием оригинальной системы типирования. 2. Реконструкция и подробная функциональная характеристика серий индивидуальных репертуаров периферических Т-лимфоцитов шестерых лиц, прошедших двух месячное наблюдение при вакцинации против вируса желтой лихорадки. 3. Разработка комплексного подхода к определению динамики индивидуального репертуара Т-лимфоцитов при развитии иммунного ответа. С использованием этого подхода выявлена поликлональная гиперэкспансия Т-клонов в период максимального ответа на вакцинный штамм YF17D вируса желтой лихорадки. 4. Создание системы глубокого мониторинга Т-лимфоцитарных клонов и определение фенотипического разнообразия Т-клонов, специфичных к антигенам YF17D. Вторая часть выполненных в 2016г. работ включала сбор проб венозной крови у троих неродственных индивидов, проходящих вакцинацию против вируса клещевого энцефалита, и формирования представительной коллекции образцов РНК/ДНК из клеток различных фракций периферических Т-лимфоцитов. Реконструкция и анализ соответствующих Т-лимфоцитарных репертуаров запланированы на следующий этап выполнения проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Одним из наиболее универсальных показателей состояния системы адаптивного иммунитета организма является количественная и функциональная вариабельность клонального состава периферических Т- и В-лимфоцитов – индивидуальный репертуар Т-(В-)клеточных рецепторов (ТкР и ВкР). Настоящий проект направлен на определение динамики репертуара ТкР в ходе иммунного ответа организма человека на некоторые патогенны рода Flavivirus, а именно – при вакцинации живой аттенуированной вакциной YF-17D против вируса желтой лихорадки и культуральной очищенной инактивированной "Вакциной клещевого энцефалита". Методологической основой проекта является глубокий анализ полного репертуара периферических лимфоцитов, реконструируемый по результатам массированного секвенирования кДНК генов Т-клеточных (ТкР) рецепторов. Выполнение очередного этапа проекта было сосредоточено на завершении массированного секвенирования серийных библиотек кДНК ТкР с последующей реконструкцией индивидуальных репертуаров Т-лимфоцитов и проведении сравнительного анализа получаемых репертуаров для определения динамики клонального состава и изменений численности отдельных субпопуляций Т-клеток, происходящих в организме трех пар монозиготных близнецов при вакцинации против вируса желтой лихорадки или троих неродственных индивидов при вакцинации против вируса клещевого энцефалита. Результатами выполнения годовой части программы стали: 1) Исчерпывающая реконструкция и глубокое профилирование серий индивидуальных репертуаров периферических Т-лимфоцитов для девяти здоровых доноров, проходивших противовирусную вакцинацию. Результаты крупномасштабного секвенирования кДНК бета-цепей Т-клеточных рецепторов (TRB), использованные для реконструкции репертуаров, внесены в международный депозитарий по адресам https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP078490 и https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/SRP111073 . 2) Создание статистической матмодели и ее применение для идентификации клональной экспансии Т-лимфоцитов в ходе иммунного ответа организма на противовирусную вакцину. Для каждого из вакцинированных доноров выявлена экспансия от 260 до 1000 клонов, формирующихся в ответ на введение вакцины и достигающих максимальной численности на пятнадцатый день после прививки. Показано, что динамика репертуара Т-хелперов и Т-киллеров совпадает, в целом, с общей динамикой Т-клеточного иммунного ответа, хотя на живую YF17D-вакцину сильнее реагирует популяция CD8 клеток, а на инактивированную ВКЭ-вакцину - популяция CD4 лимфоцитов. 3) Определение индивидуальных и групповых особенностей Т-клеточного иммунного ответа на противовирусную вакцинацию. Показано участие «публичных клонотипов» в ответе на вакцину у всех обследованных доноров. Выявлены обширные группы вакцин-ассоциированных клонов, специфичных для каждой пары монозиготных близнецов. Установлено, что наличие идентичных HLA-аллелей не влияет (либо незначительно влияет) на индивидуальное разнообразие клонального состава отвечающих на вакцину Т-лимфоцитов.