Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проект направлен на разработку и моделирование гибридных биодеградируемых скаффолдов, наполненных лекарственными средствами, поверхность которых модифицирована в плазме высокочастотного магнетронного разряда и с использованием химических методов для увеличения биосовместимости и биозамещаемости. По результатам первого года реализации проекта был проведен литературный обзор методов создания гибридных биодеградируемых скаффолдов. Показано, что для создания гибридных скаффолдов на основе биодеградируемых полимеров наиболее подходящим является метод электроспиннинга. В обзоре проведен критический анализ более 70 современных статей, посвященных созданию гибридных биодеградируемых скаффолдов, опубликованных в ведущих международных журналах. Полнота проведенного исследования гарантируется использованием современных баз данных и инструментов поиска: Scopus, Web of Science, Science Direct, Google Scholar, PubMed и др. Подобран оптимальный режим получения трехмерных биодеградируемых скаффолдов на основе полимолочной кислоты (ПМК), поликапролактона (ПКЛ) и их смесей методом электроспиннинга. Найденный в процессе исследования оптимальный режим формования трехмерных биодеградируемых скаффолдов был использован для создания скаффолдов, наполненных модельными лекарственными средствами (ЛС) хлорамфениколом и парацетамолом. Были изготовлены опытные образцы скаффолдов ПМК-хлорамфеникол и ПКЛ-парацетамол различного состава. Для скаффолдов ПКЛ-парацетамол были изготовлены образцы, представляющие собой многослойные композитные материалы. В результате исследования физико-химических свойств опытных скаффолдов ПМК-хлорамфеникол и ПКЛ-парацетамол методами сканируюшей электронной микроскопии и оптической гониометрии было показано, что введение хлорамфеникода в прядильный раствор ПМК приводит к уменьшению диаметра волокон скаффолда и не влияет на смачиваемость поверхности скаффолдов. Увеличение концентрации парацетамола в прядильном растворе ПКЛ приводит к появлению дефектов в структуре скаффолда, таких как слипание волокон, и повышенной адгезии к коллектору. Адгезию к коллектору удалось устранить путем подбора режима формования многослойного композитного скаффолда ПКЛ-парацетамол с «запирающим» слоем (трехслойный материал: слой без ЛС, слой с ЛС, слой без ЛС, слои равной толщины). Получены кинетические зависимости выхода ЛС (хлорамфеникола и парацетамола) из объема трехмерных биодеградируемых скаффолдов. Выход ЛС оценивался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и УФ-спектрометрии. Показано, что скорость выхода ЛС из биодеградируемого скаффолда в большей степени зависит от типа и свойств используемого полимера и ЛС, чем от концентрации ЛС в прядильном растворе. Продемонстрированно, что создание «запирающих» слоев у полимерных скаффолдов является эффективным способом достижения равномерного пролонгированного выхода ЛС из систем скаффолд-ЛС, для которых свойственен быстрый выход ЛС. Разработана новая математическая модель процесса выхода ЛС из объема трехмерных биодеградируемых скаффолдов, основанная на уравнении диффузии в цилиндрических координатах, при этом учитывающая реальное распределение волокон в зависимости от их диаметра в структуре полимерного скаффолда, полученного методом электроспиннинга. С помощью модели показано, что распределение волокон по радиусу тем или иным образом может значительно влиять на кинетику высвобождения ЛС из биодеградируемых скаффолдов. Разработанная модель наглядно демонстрирует, что вариация распределения волокон по радиусу может быть использована как дополнительное средство для достижения требуемого темпа высвобождения ЛС. Также, используя модель, является возможным наиболее близко к физической реальной системе рассчитать коэффициент диффузии ЛС в полимере, из которого изготовлен биодеградируемый скаффолд. Возможность расчёта коэффициента диффузии также является важной характеристикой разработанной математической модели, поскольку позволяет прогнозировать скорость высвобождения ЛС из изготовленных трехмерных биодеградируемых скаффолдов. Проведен литературный обзор методов оценки биосовместимости нетканых материалов. По результатам проведенного обзора показано, что в зависимости от вида исследуемого биоматериала, его физических, химических, механических характеристик, возможного приложения в биологии или медицине возможен подбор различных методов тестирования биосовместимости, который будет начинаться с выбора типа клеток (степень дифференцировки, линейность и т.д.). В обзоре проведен критический анализ 96 современных публикаций, посвященных вопросам исследования биосовместимости, в ведущих международных журналах. Полнота проведенного исследования гарантируется использованием современных баз данных и инструментов поиска: PubMed, Scopus, Science Direct, Google Scholar, и др. Согласно проведенному литературному обзору для исследования биосовместимости гибридных биодеградируемых скаффолдов были выбраны мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) человека, выделенные из жировой ткани здорового донора, а также эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Были отработаны и апробированы методы выделения, фенотипирования (с помощью проточной цитометрии), и культивирования ММСК и HUVEC. В результате отработки методов и режимов исследования цитотоксичности скаффолдов в тестах in vitro были разработаны и апробированы следующие протоколы: оценка уровня некроза и апоптоза клеток с окраской ядерным красителем Propidium Iodid и мембранным красителем – Annexin V FITC, оценка уровня некроза и апоптоза клеток с окраской ядерными красителями Propidium Iodid и Yo-Pro-1, МТТ-тест, оценка токсичности жидкостей, контактировавших с материалом. Для исследования адгезионных свойств материалов при сокультивировании с ММСК были разработаны и апробированы следующие методы: окраска ядерным красителем DAPI с последующей визуализацией посредством флуоресцентной микроскопии, окраска клеток мембранным красителем PKH 26, окраска внутриклеточных белков с использованием первичных и вторичных антител на примере гладкомышечного актина, индукция клеточной остеодифференцировки. Показано, что окраску клеток Propidium iodid - Yo-Pro 1 можно считать идеально подходящей для скриннинговых исследований, когда необходимо провести оценку большого количества образцов, а Propidium iodid – Annexin V FITC, можно использовать как подтверждающий тест, повышающий достоверность полученных результатов. МТТ-тест можно признать информативным методом оценки жизнеспособности и функциональной активности при изучении цитотоксичности материалов и частиц, находящихся в жидком состоянии. Визуализация клеток на поверхности материала посредством окрашивания ядра DAPI является базовым тестом оценки адгезионных свойств. Использование мембранного красителя PKH26 применимо при необходимости визуализации волокон материалов (полимеры), либо в случае предварительного окрашивания клеток и последующего их заселения на материал. Флуоресцентная микроскопия с окрашиванием внутриклеточных белков является одним из самых информативных методов оценки адгезии клеток на материале, их функциональной активности и дифференцировки. Кроме того, возможно проведение количественного анализа площади поверхности, занимаемой одной клеткой, либо площади покрытия всем клеточным слоем на единицу площади. Был разработан протокол длительной культивации человеческих макрофагов в условиях воспаления и заживления ткани на биодеградируемых скаффолдах на основе ПМК. Отработаны параметры выделения и культивации первичных моноцитов человека, стимуляции про- и противовоспалительными цитокинами, методология оценки жизнеспособности, метаболической активности и уровня дифференцировки в направлении М1 и М2 фенотипов. Данная модельная система может использоваться для анализа взаимодействия скаффолдов различной природы с макрофагами, находящимися в микроокружении имплантатов, и позволит анализировать иммунологическую биосовместимость биодеградируемых материалов. Было установлено, что культивация макрофагов на биодеградируемых скаффолдах приводит только к краткосрочному повышению секреции TNFα, в то время как длительная культивация макрофагов на скаффолдах не вызывает хронической воспалительной реакции. Анализ метаболической активности показал, что после 24-х суток культивации, как М0, так и М2 макрофаги сохраняют полностью свою жизнеспособность в течение длительной культивации на скаффолдах по сравнению с контрольным образцом без скаффолда. Для исследования влияния дифференциально активированных макрофагов на процесс деградации биодеградируемых скаффолдов был разработан комплексный подход, который включает в себя следующие этапы: 1) культивация первичных макрофагов человека на поверхности биодеградируемых скаффолдов в подобранных условиях по направлениям М0, М1, М2 в течение 24-х суток, 2) определение молекулярной массы ПМК в составе образцов после длительной культивации методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ). В качестве основной характеристики процесса деградации была выбрана молекулярная масса ПМК, изменение которой указывает на процесс разрушения биодеградируемых скаффолдов. Было установлено, что наличие и направление активации макрофагов незначительно влияет на процесс деградации ПМК в составе биодеградируемых скаффолдов. При культивации М0 макрофагов на поверхности биодеградируемых скаффолдов в течение 24-х дней уменьшение молекулярной массы полилактида составило 25-30%, при культивации М1, М2 макрофагов – 20-25% от исходной массы полимера. Все исследуемые биодеградируемые скаффолды подвержены постепенному процессу биодеградации, но не происходит полного разрушения скаффолдов. Оценка жизнеспособности макрофагов после культивации показала, что процесс деградации ПМК не является токсичным для макрофагов.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект направлен на разработку и моделирование гибридных биодеградируемых скаффолдов, наполненных лекарственными средствами, поверхность которых модифицирована в плазме высокочастотного магнетронного разряда и с использованием химических методов для увеличения биосовместимости и биозамещаемости. По результатам второго года реализации проекта подобраны оптимальные режимы модифицирования скаффолдов из биодеградируемых полимеров (поли-(ε-капролактон), поли-L-молочная кислота, их сополимеры и смеси), а также скаффолдов, наполненных парацетамолом, с запирающими слоями из чистого полимера, сформированных методом электроспиннинга, в плазме магнетронного разряда, плазме атмосферного давления и с использованием методов «мокрой» химии (обработка смесью растворитель/нерастворитель). В результате исследования физико-химических и механических свойств модифицированных скаффолдов методами РФЛА, СЭМ, ИК НПВО, РСА, оптической гониометрии было показано, что модифицирование биодеградируемых скаффолдов в плазме магнетронного разряда, возникающей при распылении титановой мишени в атмосфере азота, при оптимальном режиме не влияет на морфологию волокон скаффолда и не изменяет физико-механические свойства материала, при этом позволяет существенно увеличить гидрофильность его поверхности. Кроме того, в процессе модифицирования формируется оксинитридное покрытие, которое способно адсорбировать оксид азота (NO), таким образом, влиять на адгезию тромбоцитов и реакции иммунных клеток. В результате исследования физико-химических и механических свойств модифицированных скаффолдов методами СЭМ, РФЭС, УФ-спектроскопии, оптической гониометрии было показано, что модифицирование плазмой атмосферного давления не приводит к изменению морфологии поверхности скаффолдов и изменению их физико-механических свойств, при этом позволяет придавать скаффолдам гидрофильные свойства, которые сохраняются на протяжении длительного времени. Кроме того, модифицирование плазмой атмосферного давления позволяет иммобилизовывать на поверхности скаффолда различные биомолекулы, что было показано на примере гиалуроновой кислоты, которая является биологически активным соединением. В результате исследования физико-химических свойств модифицированных скаффолдов методами СЭМ, РСА, УФ-спектроскопии, оптической гониометрии было показано, что обработка смесью растворитель/нерастворитель приводит к увеличению диаметра волокон скаффолда, но не приводит к появлению на них каких-либо дефектов, а также не влияет на кристаллическую структуру полимера. Метод позволяет иммобилизовывать белки и различные полимеры на поверхности биодеградируемых скаффолдов, что показано на примере желатина и полиакриловой кислоты. Скаффолды, модифицированные желатином, являются супергидрофильными и хорошо набухают в водных средах. Скаффолды, модифицированные полиакриловой кислотой, несут большое количество активных карбоксильных групп. Таким образом, были получены гибридные скаффолды, наполненные лекарственными средствами, скаффолды с поверхностью, модифицированной биоактивными элементами и биологически активными молекулами. Была разработана новая математическая модель для оценки кинетики высвобождения лекарственных средства из скаффолдов, полученных методом электроспиннинга, в которой учитывается распределение волокон в структуре материала по их радиусу. Было показано, что распределение радиусов волокон существенно влияет на скорость высвобождения лекарства в заданной полимерной системе. Таким образом, модель наглядно демонстрирует, что изменение волокон по размеру может быть использовано в качестве дополнительного инструмента для достижения желаемой кинетики высвобождения лекарственного средства. Кроме того, применение модели распределения волокон к экспериментальным данным высвобождения лекарственного средства позволяет более точно определить коэффициент диффузии исследуемого лекарственного средства внутри полимера, что позволяет лучше прогнозировать кинетику высвобождения лекарственного средства из других подобных полимерных материалов. Было проанализировано влияние модельных полимерных скаффолдов из поли-(ε-капролактона), модифицированных в плазме магнетронного разряда в подобранных технологических режимах, на активацию провоспалительной и необходимой для эффективного заживления тканей скавенджинг-функции макрофагов. В соответствии с разработанной нами модельной системой, были исследованы реакции первичных человеческих макрофагов. В качестве основных параметров, характеризующих провоспалительный ответ макрофагов были выбраны ключевые цитокины М1 макрофагов: TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-8. Для оценки скавенджинг-функции проведен анализ экспрессии скавенждер-рецепторов CD206 и стабилина-1 в макрофагах, культивированных на поверхности скаффолдов. Было показано, что несмотря на стимуляцию скаффолдами продукции отдельных провоспалительных цитокинов, при взаимодействии со скаффолдами макрофаги сохраняют активную скавенджинг-функцию и способность деградировать внеклеточные компоненты, что является необходимым условием для заживления тканей и восстановления гомеостатического тканевого баланса в микроокружении имплантата. Были подобраны оптимальные условия для проведения оценки биосовместимости модельных скаффолдов. Подобранные оптимальные условия были использованы при исследовании биосовместимости биодеградируемых скаффолдов, полученных методом электроспиннинга, из поли-(ε-капролактон), поли-L-молочной кислоты, сополимера поли-L-молочной кислоты/поликапролактон и смеси поли-L-молочной кислоты и поликапролактона. Было установлено, что все исследуемые скаффолды являются биосовместимыми, однако активно взаимодействуют с мезенхимальными стволовыми клетками только скаффолды из поли-(ε-капролактона) и поли-L-молочной кислоты.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проект направлен на разработку и моделирование гибридных биодеградируемых скаффолдов, наполненных лекарственными средствами, поверхность которых модифицирована в плазме высокочастотного магнетронного разряда и с использованием химических методов для увеличения биосовместимости и биозамещаемости. По результатам третьего года реализации проекта исследовано влияние плазменного модифицирования, а также химического модифицирования методом растворитель/нерастворитель на динамику высвобождения лекарственных средств (ЛС) из объема композитных скаффолдов, и на их физико-химические свойства. Было показано, что обработка атмосферной плазмой приводит к достоверному увеличению скорости высвобождения ЛС из объема композитных скаффолдов, в то время как модифицирование плазмой магнетронного разряда не влияет на скорость высвобождения ЛС. Таким образом, применение импульсного воздействия атмосферной плазмой более предпочтительно для целей ускорения высвобождения ЛС. В свою очередь, модифицирование в плазме магнетронного разряда позволяет улучшать смачиваемость композитного полимерного скаффолда, не влияя на кинетику высвобождения ЛС. Обработка композитных скаффолдов смесью растворитель/нерастворитель приводит к достоверному снижению количества ЛС, высвобождающегося из материала. При этом, с увеличением времени обработки количество высвобождающегося ЛС снижается. Последующая иммобилизация полиакриловой кислоты и желатина позволяет улучшить смачиваемость поверхности композитных скаффолдов, а также изменить профиль выхода ЛС. Таким образом, данный метод модифицирования может быть использован для контроля динамики высвобождения ЛС и улучшения смачиваемости поверхности материала. Для описания высвобождения ЛС из композитных скаффолдов, модифицированных плазмой, использована разработанная математическая модель. Рассчитан коэффициент диффузии ЛС в полимере. Показано, что использование разработанной математической модели позволяет сравнивать влияние различных методов плазменного воздействия на высвобождение ЛС из полимерных скаффолдов. Проведен комплекс in vitro исследований, позволяющих оценить адгезионные свойства модельных скаффолдов, их цитотоксичность, а также уровень экспрессии адгезионных белков и их стимулирующее влияние на направление дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток. Среди исследуемых материалов найдены наиболее биосовместимые. Было показано, что разработанные скаффолды принимают активное участие в процессах функционирования, а также созревания и дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток. Проанализировано влияние разработанных полимерных скаффолдов на внутриклеточные механизмы провоспалительного программирования первичных человеческих макрофагов. Показано, что полученные материалы не приводят к активации провоспалительного сигнального пути NF-kB, а также в, большинстве случаев, не вызывают экспрессию провоспалительных цитокинов TNFα, IL-1β и IL-6. Таким образом, скаффолды обладают противовоспалительным и заживляющим действием. Все запланированные работы выполнены в полном объеме, показатели кадрового состава выполнены, публикационные показатели реализации проекта перевыполнены.