КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-13-10358

НазваниеНаправленное конструирование селективных индукторов апоптоза для лечения онкологических заболеваний.

РуководительГарабаджиу Александр Васильевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)", г Санкт-Петербург

Года выполнения при поддержке РНФ2016 - 2018

КонкурсКонкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-103 - Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности

Ключевые словаp53, MDM2, MDM4, ингибиторы Е3-лигаз, индукторы апоптоза, мультитаргетные препараты, оптимизация активных соединений, структурно-ориентированный дизайн лекарственных препаратов, компьютерное моделирование для создания лекарственных препаратов, высокоэффективный скрининг

Код ГРНТИ31.21.27


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на решение актуальной проблемы – направленный дизайн, синтез и исследование целевой активности вновь созданных соединений для таргетной терапии онкологических заболеваний. В последние десятилетия химиотерапия онкологических заболеваний вышла на новый уровень благодаря интенсивному развитию как низкомолекулярных, так и биопрепаратов, демонстрирующих высокую клиническую эффективность на фоне низкой неспецифической активности, характерной для обычной цитотоксической химиотерапии. Одним из наиболее важных перспективных объектов в таргетной терапии опухолевых заболеваний является белок-онкосупрессор р53, который за счет активации различных сигнальных путей делает невозможной жизнедеятельность раковых клеток. Нормальное функционирование белка р53 летально для новообразований; и хотя около половины всех раковых опухолей экспрессируют р53, его воздействие компенсируется благодаря повышенной экспрессии негативных регуляторов, ингибирующих активность р53 и способствующих его протеолизу. Трансляция основных результатов биомедицинских исследований на эффективные препараты часто растягивается на долгие годы. Белок p53 был предметом интенсивных исследований начиная с 1979 года и к середине 90-х были выяснены детали его функции, структуры и регулирования. Фармацевтические мишени, выявленные в результате этих исследований, требовали решения непростой задачи - блокирования белок-белковых взаимодействий, препятствующих функции р53. В настоящий момент на различных стадиях исследования находится ряд соединений, ингибирующих взаимодействие p53 и его основного негативного регулятора - белка MDM2. Побудительным мотивом для решения этой задачи является уверенность, что такие препараты могут быть полезны в лечении почти всех злокачественных опухолей человека. Исследования находятся на переломном этапе, когда определяется терапевтическая эффективность созданных молекул, их вероятные побочные действия и определяется тип новообразований, наиболее чувствительных к новым агентам. Многолетнее изучение p53 позволило сформировать некоторое представление о его функции в поддержании стабильности генома и модуляции апоптоза, при этом исследования последних лет показывают, что высока вероятность новых открытий. На данный момент неоспоримо одно: белок р53 терапевтически значим. Предлагаемый проект посвящен разработке нового класса низкомолекулярных соединений, способных селективно индуцировать р53 опосредованный апоптоз. На первом этапе исследований нами был выявлен ряд соединений – хитов, вызывавших интенсивную гибель раковых клеток за счет реактивации функции белка р53. Основным содержанием перспективных работ является оптимизация структуры и функции активных соединений нового класса, разработанных в нашей лаборатории. Поставленная цель будет достигаться с помощью двух основных подходов: 1. Оптимизация структуры активных соединений. Разработанные нами соединения сконструированы на основе индолинонового скаффолда, замещенного в первом и третьем положениях фрагментами, пригодными для оптимизации связывания с активной полостью белка MDM2, которое ингибирует способность этого белка дезактивировать р53. С помощью методов фрагментно ориентированного дизайна мы планируем повысить афинность наших лигандов к целевому белку MDM2. Представляется целесообразным введение дополнительного центра связывания в молекулу ингибитора, т.е. переход от трехцентрового взаимодействия в рамках разработанной фармакофорной гипотезы, к четырехцентровому, что позволит повысить не только силу взаимодействия, но и его селективность. Компьютерное молекулярное моделирование и молекулярный дизайн будут проводиться на основе новой, разработанной нами фармакофорной гипотезы и с использованием нового метода мультиконформационного докинга. Оптимизация структуры будет проводиться также и с целью повышения стабильности соединений, в частности, исключения достаточно лабильной N-C-N связи. Согласно расчетным данным, замена одного из азотов на углерод в этом фрагменте, также как и замена метиленовой группы на карбонильную, не снижает целевой активности оптимизируемой молекулы. 2. Оптимизация функции активных соединений. Компьютерное молекулярное моделирование показало возможность оптимизации функции разрабатываемого класса соединений за счет повышения их аффинности к гомологичному MDM2 белку – MDM4, который также играет важную роль в дезактивации р53. Также планируется повышение аффинности активных соединений к еще одному классу онкогенов – семейству белков Bcl, которое способно блокировать проапоптотическую функцию р53. Предложенный подход позволит решить важную задачу создания мультитаргетного соединения, способного вызывать синергический эффект одновременной активации проапоптотических белков и ингибирования антиапоптотических. Целевая активность всех вновь созданных соединений будет определяться с помощью метода высокоэффективного скрининга с использованием клеточной модели, способной количественно отражать интенсивность p53 индуцированного апоптоза. Наиболее активные соединения в рамках перспективного исследования будут модифицированы для повышения растворимости и мембранотропности. Путем анализа данных скрининга будет построена зависимость структура-токсичность и проведена оптимизация соединений с целью снижения цитотоксичности. Методологические подходы, которые планируется отработать в рамках проекта, также как и решения поставленных задач, помогут сделать еще один шаг в направлении создания эффективных и безопасных противораковых препаратов.

Ожидаемые результаты
При выполнении проекта будут достигнуты следующие результаты: 1. С помощью компьютерного моделирования, проводимого на белковых структурах MDM2, MDM4, Bcl-2, Bcl-xL, будет создана виртуальная библиотека низкомолекулярных соединений, оптимизированных по параметру связывания по сравнению с набором исходных активных соединений. 2. Будут разработаны пути и методы синтеза соединений, отобранных из виртуальной библиотеки по параметрам активности ингибирования MDM2, мультитаргетной активности по отношению к белкам MDM2 и MDM4, мультитаргетной активности по отношению к белкам семейств MDM и Bcl. 3. Будут разработаны пути и методы синтеза соединений с устойчивостью, повышенной по сравнению с набором исходных активных соединений. 4. После отбора по установленным критериям будет синтезирована сфокусированная библиотека, состоящая из приблизительно 300 оригинальных соединений. 5. При использовании специально сконструированной клеточной модели будут получены количественные данные для всех соединений библиотеки по целевой биологической активности – способности реактивировать белок-онкосупрессор р53 и вызывать селективный апоптоз раковых клеток. На основании этих данных будет построен ряд эмпирических зависимостей структура-активность. Наиболее активные соединения будут оптимизированы по критериям водорастворимости и мембранотропности. Для отобранных образцов будут получены данные по способности индуцировать митохондриальный апоптоз путем инактивации белков семейства Bcl. Основным научным результатом будут новые знания об интегральной и специфической противоопухолевой активности нового класса низкомолекулярных соединений, которые могут стать кандидатами для создания таргетных противораковых препаратов. Результаты работы планируется опубликовать в следующих рецензируемых российских и зарубежных научных изданиях: Biochemistry (Moscow). Импакт фактор: 1.303 Tetrahedron: Asymmetry. Импакт фактор: 2.155 ACS Medicinal Chemistry Letters. Импакт фактор: 3.120 Journal of Chemical Information and Modeling. Импакт фактор: 3.738 Organic Letters. Импакт фактор: 6.364 Oncogene. Импакт фактор: 8.459 Cell Death & Disease. Импакт фактор: 5.014 Общее число публикаций за 3 года выполнения проекта составит не менее 10 статей (2015 год – 3 статьи, 2016 год – 3 статьи, 2017 год – 4 статьи, 1 монография). Результаты работ по теме исследований будут представлены на конференциях в 2016 году: 1. 10th Drug Design & Medicinal Chemistry Conference (11-12 мая 2016, Берлин, Германия) 2. Academic Drug Discovery 2016 (22-23 марта 2016, Кембридж, Англия) 3. Конференция «Медицинская и биоорганическая химия», кластер конференций «Оргхим-2016» (27 июня - 1 июля 2016, Репино, Санкт-Петербург). в 2017 году: 1. Российская конференция по медицинской химии MedChem-2017 2. Discovery Chemistry Congress в 2018 году: 1. XXV Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" 2. 19th Annual Drug Discovery Summit


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За 2016 год в соответствии с планом работ направленных на конструирование новых ингибиторов белок-белкового взаимодействия р53-MDM2 были получены данные по исследованию связывания низкомолекулярных структур на основе индолинонового и изоиндолинонового ядер. Проведенное моделирование взаимодействия с тремя конформациями белка MDM2 обосновало необходимость учёта влияния подвижного участка N-концевого домена MDM2, способного формировать открытую и закрытую формы и принимать участие в процессе связывания с р53 и его низкомолекулярными миметиками. На основании расчетных данных для in vitro проверки влияния структуры на целевую активность соединений был осуществлен синтез сложных эфиров 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов. В качестве ацильной компоненты применялись различные альфа-аминокислоты. Наиболее интересные результаты были получены для производных валина и фенилглицина - (2S)-3-{[2-(4-хлорбензил)-1-(4-хлорфенил)-3-оксиизоиндолин-1-ил]окси}-2,2-диметилпропил-2-амино-3-метилбутаноата и (2S)-3-{[2-(4-хлорбензил)-1-(4-хлорфенил)-3-оксиизоиндолин-1-ил]окси}-2,2-диметилпропил-2-амино-2-фенилацетата. В частности за счет аминокислотной модификации концевой гидроксильной группы удалось повысить активность модифицированного соединения по сравнению с исходным соединением на порядок. Такое повышение активности поставило вновь созданные соединения в один ряд с наиболее удачными разработками исследователей, работающих в этом направлении. Для исследования возможных путей метаболизма соединений на основе индолинона были исследованы кинетические параметры разложения активных веществ, что позволяет выявить структурные элементы, повышающие устойчивость исследуемых соединений к гидролизу, поскольку скорость гидролиза N-оснований Манниха при 37°С может варьироваться от нескольких секунд до нескольких суток. В качестве объектов исследования были выбраны модельные соединения с различными заместителями в бензольном кольце – электронодонорными, электроноакцепторными, а также электронейтральными. Было установлено, что соединения, сконструированные на основе бензилпиперазинов, имеющих электронодонорные заместители в бензильном фрагменте, деградируют существенно медленнее, чем соединения с электроноакцепторными заместителями. Для дизайна оптимизированных соединений на основе индолинона была применена методика FBDD (фрагментно ориентированный дизайн лекарственных препаратов). В результате проведённых расчётов был получен ряд модельных структур с повышенной мишень-специфичностью. Для поиска принципиально новых структур, выступающих в качестве перспективных мультитаргетных ингибиторов белков Mdm2 и Mdm4, была произведена генерация молекул de novo. Оценка мультитаргетности сконструированных низкомолекулярных структур была проведена с помощью метода молекулярного докинга с белками Mdm2 и Mdm4 с использованием привязки к референтным лигандам. По соотношению мишень-специфичности было отобрано двести структур, которые будут синтезированы для исследования предполагаемой биологической активности. Для наиболее бесспорной валидации мишени, а также изучения спектра белков, связываемых активными веществами-ингибиторами используется аффинная хроматография в сочетании с MALDI-TOF спектрометрией. За отчетный период на основе компьютерного моделирования было сконструировано соединение, содержащее функциональную группу, не взаимодействующую с белком. В данном случае важную роль играет оптическая изомерия, поскольку только у одного оптического изомера функциональная группа не участвует во взаимодействии с белком. Соединение было синтезировано и описано, были опробованы и оптимизированы методики сшивки активного соединения со спейсером, модифицированным биотином. В результате было синтезировано три структуры, которые в дальнейшем будут использованы для разработки методики аффинной хроматографии. Вновь синтезированные соединения были проверены с использованием конструкция на основе вектора pLV1, который обеспечивает в клетках повышенную экспрессию зелёного флуоресцентного белка в ответ на увеличение активности р53. Такая система позволяет определять интенсивность р53-опосредованного апоптоза по изменению флуоресценции. Скрининг активности, проведенный на имиджинговой системе Operetta, выявил наиболее активных представителей ряда индолинонов и изоиндолинонов, разработанных в рамках плана 2016 года. Работа лаборатории молекулярной фармакологии отражена на сайте http://mol-pharm.com/ru

 

Публикации

1. Григорьева Т.А., Новикова Д.С., Гарабаджиу А.В., Трибулович В.Г. Development of optically active isoindolinone based p53 reactivators. Chirality, - (год публикации - 2017).

2. Григорьева Т.А., Петухов А.В., Гуреев М.А., Гарабаджиу А.В., Мелино Дж., Барлев Н.А., Трибулович В.Г. Design, docking, synthesis and biological evaluation of novel isoindolinone-based prapoptotic agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, - (год публикации - 2017).

3. Т.А. Григорьева, А.В. Гарабаджиу, В.Г. Трибулович Diastereotopic Derivatives of Chiral Alkoxyisoindolinones Russian Journal of General Chemistry, Vol. 86, No. 11, pp. 2454–2461 (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017 году было продолжено выполнение комплекса работ по направленному конструирование селективных индукторов апоптоза для лечения онкологических заболеваний. В соответствии с планом было завершено создание сфокусированной библиотеки активных соединений на основе индолинонового, изоиндолинонового и 3-бензилиден индолинонового скаффолдов. При выполнении синтетических работ был получен ряд интересных результатов. Так, для определения абсолютной конфигурации сложных эфиров замещенных изоиндолинонов, в частности (2S)-3-{[2-(4-хлорбензил)-1-(4-фенил)-3-оксиизоиндолин-1-ил]окси}-2,2- диметилпропил-2-амино-3-метилбутаноата, без применения специальных дериватизирующих агентов нами был использован метод, основанный исключительно на данных ЯМР спектроскопии, использующий особенности структуры исследуемого соединения, в частности наличие N-бензильного фрагмента. При разработке схемы синтеза серии 3-бензилиден индолинонов была зафиксирована возможность использования в реакции Кневенагеля изопропилата аллюминия вместо общеизвестного изопропилата титана. На основе модифицированной реакции была разработана конвергентная схема синтеза, позволяющая создавать обширные библиотеки соединений данного класса. Для конструирования новых соединений в соответствии с методами FBDD была проведена генерация структур de novo, что позволило разработать новые структуры ингибиторов белка MDM2 и мультитаргетных соединений способных ингибировать как MDM2, так и MDM4. Синтезированные соединения показали хорошую способность индуцировать апоптоз, которая была зафиксирована как с помощью неселективных методов, например, с использованием коньюгатов Annexin V, так и с помощью селективных методов, указывающих на р53-опосредованный характер индукции апоптоза. Использованные методы исследования позволили выявить соединения-лидеры, например транс-1-(3-хлор-4-фторфенил)-2-(4-хлорфенил)-5-оксо-N-(2-((2-оксопирролидин-1-ил)метил)бензил)пирролидин-3-карбоксамид, обладающий целевой активностью, превосходящей такие известные и хорошо зарекомендовавшие себя соединения, как MI-773. Для исследования возможности конструирования мультитаргетных препаратов, способных одновременно ингибировать белки MDM2 и Bcl-2, была исследована возможность создания единой фармакофорной гипотезы для этих мишеней. Было установлено, что из исследуемых классов соединений только производные индолинона, такие как Z-R изомер 4-((1-((4-бензилпиперазин-1-ил)метил)-2-оксоиндолин-3-илиден)амино)-N-(1-фенилэтил)бензамида способны воспроизводить связывание с полостью белка Bcl-2, характерное для наиболее активных ингибиторов – соединений серии ABT. При этом в случае Е-R, E-S, Z-S изомеров расчетная активность была существенно меньше. Для соединений имеющих тетраэдрический характер связывания была установлена склонность к миграции вдоль связывающей полости белка Bcl-2. Несмотря на это небольшая часть таких соединений имеет достаточно высокие расчетные параметры связывания с белком. В 2017 году с помощью MALDI спектрометрии было проведено изучение спектра белков, связываемых активными молекулами, при этом было однозначно установлено связывание соединений ряда индолинонов с белком-мишенью MDM2. По результатам работы за прошедший год с помощью отзывов рецензентов был сформирован пакет биологических испытаний, необходимый для подтверждения способности соединений к ингибированию белок-белкового взаимодействия MDM2-p53: 1. Интенсивность свечения белка EGFP в клетках трансфецированных специальной плазмидой, что позволяет флуресцентному белку реагировать на уровень экспрессии белка р53 2. Ингибирование пролиферации раковых клеток, исследуемое с помощью коммерческого набора Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 HCS Assay. Сравнение данных полученных на p53+/+ и p53-/- клетках позволяет сделать вывод не только о способности исследуемых соединений ингибировать пролиферацию, но и показывает, насколько задействован р53 опосредованный механизм апоптоза, а также свидетельствует об уровне общей токсичности субстратов. Высокоинформативный скрининг, проведенный на имиджинговой системе Operetta с использованием этих методов, позволил выявить наиболее активных представителей ряда индолинонов, изоиндолинонов и 3-бензилиден индолинонов, а также пирролидонов, пиперидонов, морфолинонов и пиперазинонов разработанных в рамках плана 2017 года. 3. Анализ на апоптоз с использованием Annexin V коньюгатов, способный с помощью проточного цитофлуориметра фиксировать различные стадии апоптоза, происходящего под воздействием исследуемых препаратов. 4. Анализ ингибирования белок-белкового взаимодействия. Способность соединений ингибировать белок-белковое взаимодействие MDM2-p53 оценивали с использованием ImmunoSet p53/MDM2 complex ELISA kit. 5. Вестерн-блот анализ на экспрессию белков MDM2 и р53. Совокупность этих методов позволяет с высокой степенью достоверности определять целевую активность малых молекул в рамках используемой гипотезы. Наиболее важным результатом за отчетный период по праву можно считать данные по экспрессии транскрипционных мишеней белка-онкосупрессора р53. Основной транскрипционной мишенью белка p53 является ген p21, который способен вызывать остановку клеточного цикла в фазах G1 и G2. Применение ингибиторов белок-белкового взаимодействия MDM2-p53, таких как Nutlin-3a или его усовершенствованный аналог RG7388 (идазанутлин), находящийя на третьей стадии клинических испытаний, вызывает остановку клеточного цикла и впоследствии апоптоз. Однако выжившая часть клеток после повторной обработки препаратами склонна к образованию мутантов, устойчивых не только к ингибиторам MDM2, но и к таким высокотоксичным соединениям как доксорубицин, гемцитабин или цисплатин. Таким образом, становится актуальной задача быстрого апоптоза клеток подвергшихся воздействию препаратов-ингибиторов MDM2. Такая цель может быть достигнута за счет повышенной экспрессии другой транскрипционной мишени р53 – белка PUMA. После активации PUMA взаимодействует с белками антиапоптотического семейства Bcl-2, что приводит к активации каспазного каскада и быстрому апоптозу. В результате проведенных в 2017 году исследований было установлено, что ряд соединений класса индолинонов, таких как N-бензил-4-((5-хлор-2-оксо-1-(4-фенилпиперазин-1-ил)метил)индолин-3-илиден)амино)бензамид и N-бензил -4-((1-((4-(3-фторобензил) пиперазин-1- ил)метил)-2-оксоиндолин-3-илиден)амино) бензамид, приводят к экспрессии белка PUMA в два-три раза большей, чем Nutlin-3a. Таким образом, для этих соединений зафиксирована возможность быстрого апоптоза раковых клеток в рамках р53 опосредованного механизма. Работа лаборатории молекулярной фармакологии отражена на сайте http://mol-pharm.com/ru

 

Публикации

1. Григорьева Т.А., Новикова Д.С., Гарабаджиу А.В., Барлев Н.А., Трибулович В.Г. Role of permeability and target activity in MDM2 mediated proapoptotic effect of isoindolinone derivatives CHEMMEDCHEM, - (год публикации - 2018).

2. Григорьева Т.А., Новикова Д.С., Гуреев М.А., Гарабаджиу А.В., Трибулович В.Г. Amino acids as chiral derivatizing agents for antiproliferative substituted N-benzyl isoindolinones СHIRALITY, - (год публикации - 2017).

3. Григорьева Т.А., Новикова Д.С., Петухов А.В., Гуреев М.А., Гарабаджиу А.В., Мелино Дж., Барлев Н.А., Трибулович В.Г. Proapoptotic modification of substituted isoindolinones as MDM2-p53 inhibitors BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, 27(23), pp. 5197-5202 (год публикации - 2017).

4. Гуреев М.А., Трибулович В.Г., Гарабаджиу А.В., Мартин Ш. Библиотека структурных конформаций белковой модели Mdm2-N+ в локальных энергетических минимумах. -, 2017620204 (год публикации - ).

5. Гуреев М.А., Трибулович В.Г., Гарабаджиу А.В., Мартин Ш. Библиотека Mdm2-N+ мишень-ориентированных оптимизирующих молекулярных фрагментов -, 2017620223 (год публикации - ).

6. Красавин М.Ю., Гуреев М.А., Дарьин Д.В., Бакулина О.Ю., Чижова М.Е., Новикова Д.С., Григорьева Т.А., Иванов Г.С., Жумагалиева А.А., Гарабаджиу А.В., Трибулович В.Г. Design, MDM2 docking prioritization and biological profiling of apoptosis-inducing lactams amenable by the Castagnoli-Cushman reaction European Journal of Medicinal Chemistry, - (год публикации - 2018).

7. Новикова Д.С., Григорьева Т.А., Гуреев М.А.,Иванов Г.С., Жумагалиева А.А., Гарабаджиу А.В., Мелино Дж.,Барлев Н.А., Трибулович В.Г. Activating effect of 3-benzylidene oxindoles on AMPK: from computer simulation to high-content screening ARCHIV DER PHARMAZIE, - (год публикации - 2017).

8. Новикова Д.С., Григорьева Т.А., Золотарев А.А., Гарабаджиу А.В., Трибулович В.Г. A Facile Synthesis of 3-(Benzylidene)indolin-2-one AMPK Activators SYNLETT, - (год публикации - 2018).

9. Орлова Д. Д., Новикова Д. С., Гарабаджиу А. В., Трибулович В. Г. Исследование устойчивости к гидролизу N-оснований Манниха на основе изатина ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ, - (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году проводились работы на завершающем этапе проекта по направленному конструированию селективных индукторов апоптоза для лечения онкологических заболеваний. Проведенное объемное компьютерное моделирование показало недостаточность метода мультиконформационного докинга, разработанного в нашей лаборатории для объяснения ряда случаев зависимости структура-активность при наличии высокоподвижных участков в структуре белка, находящихся в непосредственной близости от сайта связывания. Для исследования хиральных молекул был применен метод молекулярной динамики, объяснивший причины образования устойчивых конформаций белка MDM2 в случае высокоактивных молекул. Нa oснoвaнии результaтoв кoмпьютернoгo мoделирoвaния, изучения биoлoгическoй aктивнoсти, устoйчивoсти и биoдoступнoсти, соединений, пoлученных в 2016-2017 гoдaх, былa синтезирoвaнa сфoкусирoвaннaя библиoтекa из 55 сoединений, oтнoсящихся к индoлинoнaм и изoиндoлинoнaм, пo метoдикaм, рaзрaбoтaнным в 2016-2017 гoдaх. Изучение E/Z равновесия, характерного для исследуемых соединений, показало наличие пи-стекинга, который оказывает стабилизирующее воздействие на E-конформацию. Изучением спектрa белкoв, связывaемых aктивными мoлекулaми, с испoльзoвaнием новой активной мoлекулы и двух новых контрольных молекул, было подтверждено связывaние aктивнoгo сoединения с белкoм MDM2. При срaвнении спектра цитoскелетных белкoв, связывaемых aктивным сoединением и кoнтрoльным сoединением R-4-((6-хлoрo-1-((4-метилпиперaзин-1-ил)метил)-2-oксoиндoлин-3-илиден)aминo)-N-(2-гидрoкси-1-фенилэтил)бензaмид, былo устaнoвленo незначительное связывaние с тубулинoм. При прoверке внoвь синтезирoвaнных сoединений нa целевую биoлoгическую aктивнoсть был использован ранее разработанный нами протокол: - Исследoвaние нa системе Operetta клетoчнoй мoдели с фиксaцией интенсивнoсти свечения белкa EGFP, oбуслoвленнoгo нaличием свoбoднoгo р53. - Кoличественнoе oпределение ингибирoвaния прoлиферaции рaкoвых клетoк с испoльзoвaнием метoдoв HCS нa системе Operetta. - Кoличественный aнaлиз нa aпoптoз с испoльзoвaнием Annexin V кoньюгaтoв с испoльзoвaнием прoтoчнoй цитoметрии. - Aнaлиз ингибирoвaния белoк-белкoвoгo взaимoдействия с испoльзoвaнием ELISA нa рекoмбинaнтных белкaх. В общей сложности было проведено более 400 различных испытаний на биологическую активность. Для двух соединений класса индолинонов 4-((5-хлoрo-2-oксo-1-((4-фенилпиперaзин-1-ил)метил)индoлин-3-илиден)aминo)-N-(4-хлoрoбензил)бензaмида и -4-((1-((4-бензилпиперaзин-1-ил)метил)-5-хлoрo-2-oксoиндoлин-3-илиден)aминo)-N-(4-хлoрoбензил)бензaмида, а также для двух изомерных пар класса изоиндолинонов: - (S)-(1-((((R)-2-(4-хлоробензил)-1-(4-хлорфенил)-3-оксоизоиндолин-1-ил)окси)метил) циклопропил)метил 2-амино-2-фенилацетата и (S)-(1-((((S)-2-(4-хлоробензил)-1-(4-хлорфенил)-3-оксоизоиндолин-1-ил)окси)метил) циклопропил)метил 2-амино-2-фенилацетата - (S)-(1-((((R)-2-(4-хлоробензил)-1-(4-хлорфенил)-3-оксоизоиндолин-1-ил)окси)метил) циклопропил)метил 2-амино-3-метилбутаноата и (S)-(1-((((S)-2-(4-хлоробензил)-1-(4-хлорфенил)-3-оксоизоиндолин-1-ил)окси)метил) циклопропил)метил 2-амино-3-метилбутаноата установлена активность, превышающая активность ранее созданных и изученных представителей данных классов и контрольных соединений. При прoверке нaибoлее aктивных сoединений метoдoм ПЦР в реaльнoм времени основное внимание было уделено относительной экспрессии белков PUMA и Bax, поскольку экспрессия Bax oпределяется кaк экспрессией PUMA, тaк и прямым ингибирoвaнием белкa Bcl-2. Aнaлиз oтнoсительной экспрессии PUMA и Bax, индуцирoвaнной низкoмoлекулярным сoединением, позволил для двух соединений: - (S)-(1-((((R)-2-(4-хлоробензил)-1-(4-хлорфенил)-3-оксоизоиндолин-1-ил)окси)метил) циклопропил)метил 2-амино-2-фенилацетата -- (S)-(1-((((R)-1-(4-хлорфенил)-2-(4-нитробензил)-3-оксоизоиндолин-1-ил)окси)метил) циклопропил)метил 2-амино-2-фенилацетата сделaть вывод o мультитaргетном хaрaктере их aктивнoсти в отношении белков р53/Bcl-2. Для определения спoсoбнoсти исследуемых сoединений связывaться с белкaми семействa Bcl был использован новый метод селективнoго oпределения степени ингибирoвaния Bcl-2 с пoмoщью рекoмбинaнтных мoделей. Былo исследoвaнo 35 сoединений и выявлены нaибoлее перспективных oбрaзцы, активнoсть которых не превышaлa 16% aктивнoсти пoзитивнoгo кoнтрoля AВТ-737. Этoт, нa первый взгляд, скрoмный результaт, является бoльшим дoстижением, пoскoльку: - сoединение AВТ-737 прoявляет aктивнoсть in vitro в пикoмoльных (0.001 нaнoмoль) кoнцентрaциях и является, в принципе, oдним из нaибoлее aктивных низкoмoлекулярных сoединений; - сoединение AВТ-737 не прoявляет aктивнoсти в oтнoшении ингибирoвaния белкa MDM2, тaким oбрaзoм зaдaчa мультитaргетнoсти MDM2/Bcl-2 не имеет прoстoгo oбрaтнoгo решения, т.е. сoединения спoсoбные ингибирoвaть Bcl-2 не являются aвтoмaтически ингибитoрaми MDM2; - зaфиксирoвaннaя aктивнoсть пoдтверждaет прaвильнoсть теoретических предпoсылoк, пoлoженных в oснoву этoй чaсти прoектa. Биологические испытания in vivo на модели danio rerio проведенные в 2018 году обладают рядом преимуществ по отношению к мышиной модели и модели дрозофилы. Рыбы danio rerio обладают большой гомологией по отношению к человеку и при этом они развиваются очень быстро, что позволяет в короткие сроки выявить активное действующее вещество. Существующие метoдики были нами aдaптирoвaны пoд пoстaвленные зaдaчи и имеющиеся вoзмoжнoсти. Тестoвoе исследoвaние: - 4-((5-хлoрo-2-oксo-1-((4-фенилпиперaзин-1-ил)метил)индoлин-3-илиден)aминo)-N-(4-хлoрoбензил)бензaмида, - 4-((1-((4-бензилпиперaзин-1-ил)метил)-5-хлoрo-2-oксoиндoлин-3-илиден)aминo)-N-(4-хлoрoбензил)бензaмида, показало знaчения IC50 сooтветственнo в 1.8 и 2.4 рaзa ниже, чем у пoзитивнoгo кoнтрoля Nutlin-3a, что является наиболее серьезным подтверждением всех ранее высказанных предположений, полученных экспериментальных и расчетных данных. Работа лаборатории молекулярной фармакологии отражена на сайте http://mol-pharm.com/ru

 

Публикации

1. - Биологи из России научились включать "починку ДНК" в раковых клетках. Россия сегодня, РИА Новости, 10.04.2018 (год публикации - ).

2. - В России создали лекарство, заставляющее раковые клетки «чинить» свою ДНК. Regnum, информационное агентство, 10 апреля 2018 года (год публикации - ).

3. - Петербургские учёные разработали новое лекарство от рака. Телеканал 78, 23 апреля 2018 года (год публикации - ).

4. - Прицельный удар: ученые Технологического института научили организм бороться с раковыми клетками Телеканал «Санкт-Петербург», 17 апреля 2018 года (год публикации - ).

5. - Защитник «хранителя генома» стал основой новых противораковых препаратов Газета.ru, 10.04.2018 (год публикации - ).

6. - Активация «хранителя генома» поможет в борьбе с раком. Новости РНФ - СМИ о фонде, 12 апреля 2018 г. (год публикации - ).

7. Григорьева Т.А., Новикова Д.С, Гарабаджиу А.В., Барлев Н.А., Трибулович В.Г. The Role of Passive Membrane Permeability and Target PPI Inhibition in MDM2/p53-mediated Proapoptotic Effect of Isoindolinone Derivatives. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, - (год публикации - 2019).

8. Григорьева Т.А., Новикова Д.С, Гуреев М.А., Гарабаджиу А.В., Трибулович В.Г. Amino acids as chiral derivatizing agents for antiproliferative substituted N-benzyl isoindolinones. Chirality, Volume30, Issue 6, Pages 785-797 (год публикации - 2018).

9. Гуреев М.А., Новикова Д.С., Григорьева Т.А., Орлова Д.Д., Гарабаджиу А.В., Трибулович, В.Г. Simulation of MDM2 N-Terminal Domain Conformational Lability in the Presence of Imidazoline Based Inhibitors of MDM2-p53 Protein-Protein Interaction Journal of Computer-Aided Molecular Design, - (год публикации - 2019).

10. Красавин М., Гуреев М.А., Дарьин Д., Бакулина О., Чижова М. Лепихина А., Новикова Д.С., Григорьева Т.А., Иванов Г.С., Жумагалиева А., Гарабаджиу А.В., Трибулович В.Г. Design, in silico prioritization and biological profiling of apoptosis-inducing lactams amenable by the Castagnoli-Cushman reaction. Bioorganic and Medicinal Chemistry, Volume 26 Issue 9, 2651-2673 (год публикации - 2018).

11. Новикова Д.С., Григорьева Т.А., Гуреев М.А., Иванов Г.С., Гарабаджиу А.В., Мелино Д., Барлев Н.А., Трибулович В.Г Activating effect of 3-benzylidene oxindoles on AMPK: from computer simulation to high-content screening. ChemMedChem, - (год публикации - 2019).

12. Новикова Д.С., Григорьева Т.А., Золотарев А.А., Гарабаджиу А.В., Трибулович В.Г. Advanced palladium free approach to the synthesis of substituted alkene oxindoles via aluminum promoted Knoevenagel reaction. RSC Advances, Volume 8, Issue 60, Pages 34543-34551 (год публикации - 2018).

13. Орлова Д.Д., Гуреев М.А., Новикова Д.С., Григорьева Т.А., Гарабаджиу А. В., Трибулович В. Г. Effect of Aromatic Interactions on E/Z Equilibrium of indolinone Sсhiff bases. Journal of Molecular Structure, - (год публикации - 2019).

14. Орлова, Д. Д.; Новикова, Д. С.; Гарабаджиу, А. В.; Трибулович, В. Г. A Study on Hydrolytic Stability of Isatin N-Mannich Bases. Russian Journal of General Chemistry, Volume 88, Issue 1, 48–56. (год публикации - 2018).