Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Основной результат проекта заключается в создании новых высокоэффективных систем на основе биологически активных полисахаридов морских гидробионтов - хитозанов и сульфатированных полисахаридов – каррагинанов, характеризующихся большим структурным разнообразием, для адресной доставки и пролонгированного действия лекарственных форм отечественного препарата гистохром. Полисахариды. Из красных водорослей дальневосточных морей, представителей семейств Gigartinaceae, Thicocarpaceae и Phylloforaceae выделены каррагинаны различной степени сульфатирования. Методами ЯМР и ИК –спектроскопии, а также масс-спектрометрии подтверждены их структуры, в соответствии с ранее полученными данными. Для выполнения первого этапа проекта использовали каппа- и лямбда-каррагинаны, выделенные из водоросли Chondrus armatus (Gigartinaceae), а также каппа/бета- и икс-каррагинаны из T. crinitus (Thicocarpaceae) с молекулярными массами в пределах 200-600 кДа. Каррагинаны различаются между собой количеством и местоположением сульфатных групп в дисахаридном повторяющемся звене полимера, наличием 3,6-ангидрогалактозы, а также регулярной или гибридной структурой полисахаридной цепи. Методами электронной и атомно-силовой микроскопии установлено, что каппа- и каппа/бета- каррагинаны формируют волокнисто-сетчатые структуры, состоящие из макромолекулярных ассоциатов (при концентрации 50 мкг/мл), а лямбда- каррагинан, который характеризуется более высокой степенью сульфатирования и отсутствием 3,6-ангидрогалактозы, в разбавленных растворах имеет конформацию неупорядоченного клубка и при высоких концентрациях образует сотоподобные структуры. Методом щелочного дезацетилирования хитина получены высокомолекулярные образцы хитозанов (ВМХ) с разной степенью ацетилировани (СА) - (ВМХ-300кДа, СА 6%; и ВМХ-110 кДа, СА 6%; ВМХ-115 кДА, СА 1,5%) ), а методом свободно-радикальной деполимеризации ВМХ-115 кДа с помощью пероксида водорода получены олигосахариды хитозана – НМХ-5,2 кДа, СД 1,5 %. Изучена иммуномодулирующая активность полученных полисахаридов по их влиянию на активацию медиаторов иммунной системы организма - синтеза клетками крови человека провоспалительного цитокина – ФНО-альфа и противовоспалительного – ИЛ-10. Установлено, что ВМХ-115 кДа не обладает способностью активировать синтез ФНО-альфа и ИЛ-10 в клетках крови, в то время как НМХ усиливает синтез ФНО-альфа в 3 раза по сравнению с контролем. Среди каррагинанов наименее сульфатированный каппа/бета–каррагинан обладает избирательным действием, усиливая синтез ИЛ-10 независимо от концентрации и не проявляя активности в отношении индукции синтеза ФНО. Пероральное введение НМХ - 5,2 кДа и каппа/бета-каррагинана экспериментальным животным приводит к увеличению содержания ИЛ-10 в сыворотках крови животных в 4 раза и 3 раза, соответственно, по сравнению с контролем. В экспериментах ex vivo на нейтрофилах показано, что каррагинаны являются умеренными активаторами фагоцитоза, стимулируя поглощение латексных частиц в сравнении с контролем, а также синтеза АФК. С увеличением концентрации полисахаридов их действие на синтез АФК возрастает в пределах 130-175%. Лямбда-каррагинан, по сравнению с другими типами, проявляет более активное действие в отношении синтеза миелопероксидазы (МПО). Показано, что каррагинаны индуцируют распластывание нейтрофилов и статистически достоверно увеличивают общую сложность/изрезанность клеточных границ. Таким образом, исследование влияния каррагинанов на активность нейтрофилов, подтвердило их иммуномодулирующую активность, которая определяется степенью сульфатирования. В биотестах, с использованием эмбрионов морского ежа, клеток постоянной трансформированной клеточной линии CHO-K1 и применением нормальных фибробластов, сохраняющих на протяжении всего срока культивирования постоянный диплоидный набор хромосом, показано, что исследуемые полисахариды не проявляют цитотоксичности. Получены гелевые формы и наночастицы на основе хитозана (ВМХ-110 кДа, СА 6%) и каррагинанов разных структурных типов. Показано, что растворимые комплексы (наночастицы от 160 до 650-700 нм) формируются при смешивании каппа-, а также каппа/бета – каррагинанов с хитозаном ) в широком диапазоне соотношений при концентрации каррагинана = 0,1 мг/мл. Увеличение концентрации каррагинанов в смеси до 1 мг/мл приводит преимущественно к образованию нерастворимых комплексов. Гелевые формы комплексов получены при добавлении раствора каррагинана в раствор хитозана, при соотношении компонентов каррагинан: хитозан 10:1 и 5:1(в/в), а гели каппа-каррагинана - при добавлении к растворам полисахарида хлорида калия. На основании анализа данных реологических исследований показано, что исследуемые гелевые системы представляют собой неньютоновские псевдопластичные жидкости с тиксотропными свойствами, что позволяет рассматривать тестируемые гели в качестве перспективных мазевых основ. Для выяснения специфичности и параметров связывания поликатиона с полианионом использовали четыре структурных типа каррагинана: каппа-, каппа/бета-, лямбда- и икс-каррагинаны (К) и хитозан ВМХ-110 кДа (Х). Для определения констант связывания каррагинана с хитозаном использовали метод конкурентного связывания полианиона с комплексом хитозан/анионный краситель (тропеолин 000-II) с последующей регистрацией высвободившегося красителя. Установлено, что структура каррагинана играет важную роль в его взаимодействии с хитозаном. Наибольшую аффинность к хитозану проявляют каррагинаны с высокой степенью сульфатирования и гибкой конформацией макромолекул в растворе (Kсв = 23.39, ×107 моль-1 для комплекса лямбда-каррагинан-хитозан). Методом динамического светорассеяния (ДРС) и электрокинетических измерений показано, что механизм образования широкого набора комплексов каррагинан/хитозан в виде наночастиц, определяется концентрацией исходных компонентов и их соотношением. Согласно данным ДРС при избытке хитозана в растворе в интервале соотношений К:Х от 0,1:1 до 0,7:1 в/в, образуются положительно заряженные частицы с размером от 69 до 103 нм. В случае избытка каппа-каррагинана в диапазоне соотношений Х:К от 0,1:1 до 0,5:1 в/в формируются более крупные полидисперсные отрицательно заряженные частицы (от -88,2 до -55,6 мВ) с размером основной популяции частиц от 222,4 до 131,4 нм. Согласно результатам атомно-силовой микроскопии (АСМ), при избытке хитозана комплексы представляют плотно упакованные образования, состоящие из сегментов, характерных для исходного хитозана, но собранные в конгломераты (RMS = 5,45 нм,) основой которым, вероятно, служат фибриллы каррагинана. При избытке каррагинана поликатион встраивается в сетчатую структуру полианиона. Данные ДРС, электрокинетических измерений и АСМ показывают, что механизм образования наночастиц комплекса определяется полимером, находящимся в избытке. При избытке в комплексе поликатиона он располагается на поверхности каррагинана, а в случае избытка каррагинана хитозан встраивается в его сетчатую структуру. Иммуномодулирующую активность полученных наночастиц оценивали по их способности индуцировать продукцию– цитокинов. Согласно полученным данным, комплекс на основе каррагинанов и ВМХ проявляют цитокин-индуцирующую активность, стимулируя синтез ФНО-альфа мононуклеарными клетками крови человека, как и исходный полианион. Производные эхинохрома. Одна из важных задач проекта заключалась в получении различных форм лекарственной субстанции эхинохром, на основе которой разработан отечественный лекарственный препарат с торговым названием Гистохром. Методами химической модификации эхинохрома получены два изомерных аминопроизводных (эхинамины А и В), разработаны методы их препаративного разделения. Из морского ежа Mesocentrotus nudus выделены гексагидроксинафтохинон спинохром Е и его аминопроизводное спинамин Е. Структуры соединений доказаны спектральными методами. Иммуномодулирующую активность полученных веществ оценивали по их способности индуцировать синтез про- (ФНО) и противо-(ИЛ-10) воспалительных цитокинов. В области концентраций от 1 mkM до 10 mM эхинохром А, эхинамин В и спинохром Е не влияли на синтез ФНО, но индуцировали синтез ИЛ-10. Для полностью гидроксилированных нафтохинонов (эхинохром А, спинохром Е) и их аминопроизводных (эхинамины А и В, спинамин Е) изучены антирадикальная активность по отношению к свободному радикалу ДФПГ и антиоксидантная активность на модели автоокисления линетола. Все исследованные соединения проявили высокую способность гасить свободный радикал ДФПГ, которая была выше, чем у стандарта альфа-токоферола. Эхинамин В и спинамин Е были наиболее активными, гасили радикал на 89±5 % и 85±6 % соответственно. Наименьшая активность обнаружена у спинохрома Е - 62±3 %. На модели автоокисления липидного субстрата линетола наибольшую антиоксидантную активность АОА = 20.4 показал эхинамин В, тогда как активность других соединений в этом тесте уменьшалась в ряду спинамин Е, эхинохром А, эхинамин А, спинохром Е (16.3, 8.6, 7.6 и 1.3 соответственно). Высокая антиоксидантная активность эхинамина В делает его наиболее перспективным кандидатом для дальнейшего исследования наряду с эхинохромом. Исследована стабильность эхинохрома А в пяти буферных системах с различными значениями рН. Эхинохром был стабилен в цитратном, HEPES и трис буферных растворах, что позволило использовать эти буферные растворы для проведения дальнейших исследований. Спектроскопическими методами установлено, что растворы эхинохрома с каррагинаном оставались стабильными в течение 8 часов. Отработаны методы включения эхинохрома ) в полисахаридные матрицы и проанализирована кинетика его высвобождения. Получены полисахаридные матрицы на основе гелевой формы каппа-каррагинана, содержащие эхинохром, по отработанной методике и исследована кинетики выхода из них эхинохрома. Установлено, что использование гелевого раствора каппа-каррагинана в три раза замедляет высвобождение из матрицы активного вещества эхинохрома по сравнению с контролем, что позволяет говорить о возможности использования такого геля в качестве основы для создания лекарственных форм пролонгированного действия.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Показана возможность использования сульфатированных полисахаридов красных водорослей каррагинанов (Карр)различных структурных типов в качестве матриц эхинохрома ( ЭХ) – лекарственной субстанции отечественного препарата Гистохром – для защиты его от окислительной деградации, улучшения растворения лекарственного средства и модификации его фармакологических свойств. Известно, что ЭХ нерастворим в воде, а растворим в фосфатном буфере. Согласно полученным нами данным ЭХ при низкой концентрации (0,1 мг / мл) растворяется в водных растворах всех типов Карр. Каррагинаны защищают ЭХ от окислительной деградации. Так в растворе фосфатного буфера после 72 часов ЭХ полностью окисляется, тогда как в растворах Карр. сохраняется около 90% ЭХ. Каррагинаны с высокой степенью сульфатирования проявляют больший защитный эффект. Сравнительный спектральный анализ Эх в растворах Карр. и буферном растворе свидетельствует о том, что ЭХ взаимодействует с Карр., согласно ионному механизму, в результате чего, вероятно, формируется комплекс Карр./ЭХ и растворимая мононатривая соль ЭХ образуется. Каррагинан может также формировать комплекс с ЭХ и за счёт водородных связей, благодаря присутствию большого количества гидроксильных групп как в полисахариде, так и ЭХ. Данные, полученные методом сканирующей микроскопии, электрокинетических измерений и динамического светорассеяния подтверждают взаимодействие ЭХ с полисахаридом. Так согласно данным СЭМ существенно изменяется морфология ЭХ при растворении его в каррагинане, изменяется его поверхностный заряд. Мономодальное распределение по заряду наблюдается для смеси ЭХ с Карр. при разном соотношении исходных компонентов. При этом величина заряда частиц ЭХ/Карр. не равна сумме зарядов исходных компонентов- она меньше чем ЭХ, но значительно выше, чем Карр. Это является результатом взаимодействия ЭХ с Карр. и проникновения ЭХ в трехмерную сетку Карр., что сопровождается трансформацией макромолекулярной структуры последнего и согласуется с данными сканирующей микроскопии. Изучена кинетика выхода ЭХ из растворов Карр. в условиях, моделирующих среду ЖКТ. Скорость высвобождения ЭХ зависит как от типа используемого Карр., так и присутствия специфических для полисахарида солей. Так в течение первого часа из растворов Карр., имеющих низкую степень сульфатированы и формирующих в растворах трёх-мерные упорядоченные структуры, высвобождается менее 50% ЭХ, против 70% ЭХ из буферного раствора. Использование калиевой соли Карр. замедляет выход ЭХ более чем в 3 раза. Увеличение количества Карр. в растворах практически не меняет кинетику высвобождения ЭХ из раствора в течение двух часов.Концентрация полисахарида не оказывает заметного эффекта на скорость выхода ЭХ. Мукоадгезивные свойства Мукоадгезивные свойства веществ в основном определяются их способностью адсорбироваться на поверхностях муцина. Для изучения мукоадгезивных свойства ЭХ и его комплекса с Карр. использовали муцин тонкой кишки свиньи, наиболее близкий по своему составу к муцину эпителий желудочно-кишечного тракта человека. Способность Карр. и ЭХ взаимодействовать с муцином была оценена путём измерения их поверхностного потенциала. Согласно полученным данным поверхностный заряд муцина и Эх с муцином имеют близкие значения, что свидетельствует об отсутствии у ЭХ мукоадгезивных свойств, тогда как Карр. и их комплексы с ЭХ проявляют мукоадгезивные свойства. Значения зарядов частиц, образованных муцином с Карр. при разных соотношениях компонентов, намного меньше, чем у Карр. что вызвано частичной компенсацией заряда. Уменьшение ζ-потенциалов смесей всех типов Карр. с муцином, наблюдаемое при определенных соотношениях, вероятно, вызвано адсорбцией каррагинана на поверхности муцина и диффузией полисахаридных цепей в зазоры и петли гликопротеиновой сетки. Подобраны условия получения трёхслойных и бислойных плёнок на основе каррагинанов и хитозана. Процесс формирования пленок, их выход и характеристики зависят от концентрации полисахаридов и последовательности их нанесения. Трехслойные плёнки (толщиной 35-45 мкм) получали путём послойного нанесения раствора одного полииона на плёнку другого, с последующим высушиванием при комнатной температуре. Получаемые таким образом плёнки представляют собой трёхслойный композит и содержат ХЗ, Карр. и нерастворимый ПЭК-слой, образующийся на границе раздела двух полиионов. Двухслойные пленки ПЭК:ХЗ были получены путём перевода ХЗ в основную форм, обработкой 2% спиртовым раствором аммиака, с последующим отмыванием свободного каррагинана водой. Высокий выход интерполимерного комплекса был получен из ХЗ и Карр., имеющего низкую степень сульфатирования, тогда как наибольшая степень набухания отмечена для пленок с использованием Карр. высокой степени сульфатирования. Дифрактограммы трехслойных и двухслойных плёнок ПЭК:ХЗ указывают на образование в них упорядоченных структур. Для оценки мукоадгезивных свойств полученных плёнок. в качестве модельной слизистой ткани использовали свежезамороженную внутреннюю поверхность тонкого кишечника свиньи. Наилучшие мукоадгезивные свойства проявляют трехслойные пленки, приготовленные с Карр. высокой степени сульфатирования. Получена серия пленок, содержащих ЭХ. Бездефектные, гладкие тонкие плёнки (толщиной 25-30 мкм) получаются при послойном нанесении на 1% раствор Карр., содержащего ЭХ, раствора ХЗ, с последующим высушиванием образовавшегося слоя при комнатной температуре. Получены нейтральные липосомы, содержащие во внутреннем объеме каррагинан и предложен метод покрытия их поверхности хитозаном и муцином, как векторными молекулами для взаимодействия с клетками организма. Изучено влияние каррагинанов на жизнеспособность эпителиальных клеток в монослое. В качестве модели эпителия кишечника использовали HT-29 клетки, которые сохраняют многие биохимические и физиологические характеристики нижнего отдела тонкого кишечника и обладают способностью продуцировать более высокие уровни муцинов по сравнению с другими клеточными линиями. Все исследуемые каррагинаны были инертны по отношению к НТ-29 эпителиальным клеткам кишечника в нормальных условиях, но обладали превентивным эффектом, восстанавливая жизнеспособность эпителиальных клеток, которая была нарушена обработкой этанолом. При этом, низкая степень сульфатирования в исследуемых образцах полисахаридов являются необходимым условием для восстанавливающей способности Карр. по отношению к клеткам эпителия кишечника человека НТ-29. Цитотоксичность ЭХ, Карр. и их комплекса оценивали с использованием стандартного биотеста, используемому для анализа фармакологических препаратов - эмбрионов морского ежа, определяя спермиотоксическое и эмбриотоксическое действие образцов. Карр. не оказывают токсического воздействия на оплодотворение (при С=100 - 200 мкг/мл), тогда как ЭХ (при С от 1 до 10 мкг/мл) проявляет спермиотоксичность, (значения IC50 составило 3 мкг/мл). В растворе Карр. спермиотоксичность ЭХ значительно снижается, и чем выше концентрация ЭХ тем больше защитный эффект проявляет Карр. В тоже время, ЭХ, Кар. и Карр./ЭХ комплексы, не оказывают токсического действия на неоплодотворённые яйцеклетки и дальнейшее развитие эмбрионов. Антиоксидантная активность комплексов ЭХ/Карр была определена по их анти-радикальной и железо-восстанавливающей способности в сравнении с исходными компонентами. Результаты показали, что ЭХ в комплексе с Карр. не только сохраняет антиоксидантную активность, но и превосходит активность исходного ЭХ. Это указывает на то, что взаимодействие, происходящее между ЭХ и Карр, облегчает способность ЭХ отдавать электроны. Исследована Индукция АФК клетками крови человека под действием комплексов ЭХ/Карр. Согласно данным, полученным с помощью проточного цитометра, высокие концентрации ЭХ уменьшают АФК формирование на 20% по сравнению с контролем, тогда как Карр. с высокой степенью сульфатирования индуцируют это процесс. Комплексы ЭХ/Карр. вызывают умеренную индукцию клетками АФК, более слабую по сравнению с Карр. Изучена цитокин-индуцирующая активность ЭХ/Карр. комплексов в отношение синтеза клетками крови человека провоспалительных ИЛ-6 и ФНО-α и противовоспалительных ИЛ-10 цитокинов. ЭХ ингибирует синтез ИЛ-10, в то время как Карр. индуцируют его синтез в доз зависимой манере. Комплексы ЭХ/Карр. усиливают синтез ИЛ-10 и этот эффект превосходит в 3 раза действие свободного ЭХ при высокой концентрации Карр в комплексе. В тоже время ЭХ проявляет высокую индуцирующую активность в отношение синтеза провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ФНО-α), значительно превышая эффект Карр. в этом тесте. В комплексах Карр. ингибируют активность ЭХ, снижая его способность индуцировать ФНО-α более чем в 2 раза. Таким образом, Карр. модифицируют биологическую активность ЭХ, ингибируя его провоспалительный эффект. IN vivo Сравнение кардиотропных эффектов ЭХ и его комплекса ЭХ Карр. показало, что включение ЭХ в полисахаридную матрицу не влияет на его кардиотонический (т.е. снижение амплитуды сокращений) и брадикардический (уменьшение частоты сердечного ритма) эффекты ЭХ, о чем свидетельствуют близкие значения измеренных показателей свободного ЭХ и в комплексе. Исследован противоязвенный эффект Эх и его комплекса с Карр.на модели индометациновой язвы желудка у крыс с однократным внутрижелудочным введением исследуемых препаратов. ЭХ проявляет умеренный противоязвенный эффект, соответствующий по величине действию референсного препарата фосфолюгеля. Включение ЭХ в полисахаридную матрицу каппа-Карр. резко усиливает его анти-ульцерогенное действие, превосходящее эффект фосфолюгеля более чем в 2раза. ЭХ/Карр. комплекс полностью купирует раздражение слизистой желудка, тогда как ЭХ оказывает слабый протекторный эффект. Значительное усиление противоязвеннго эффекта ЭХ в его комплексе с каррагинаном и купирование раздражение слизистой желудка, имеют особо важное значение при пероральном применении этой формы лекарственного средства Полученные данные позволяют надеяться на потенциальное применение исследованных полисахаридных матриц для доставки лекарственной субстанции Эхинохром при его наиболее удобном пероральном использовании.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Одной из удобных форм доставки лекарственных препаратов являются липосомы, которые представляют собой липидные везикулы, содержащие во внутреннем объёме водный раствор активного вещества. Для создания устойчивой не инвазивной лекарственной формы на основе субстанции Эхинохром (ЭХ) получены и фракционированы липосомы с размерами от 100 до 400 нм. Для включения ЭХ в липосомы использован каппа-Каррагин, в растворе которого ЭХ (при соотношении Эх/Карр.1:5 (в/в) загружали в липосомы тонкопленочным методом с последующей ультразвуковой обработкой. Свойства полученных липосом исследовали методами спектроскопии, динамического светорассеяния (ДСН), потенциометрического титрования и сканирующей микроскопии (СЭМ). Для оценки загрузки липосом эхинохромом, проводили его экстракцию бутанолом, с последующим определением концентрации вещества спектрофотометрически при 468 нм. Эффективность включения ЭХ в липосомы составила 48%, т.е. полученные липосомы проявляют высокую эффективностью инкапсулирования препарата, что может быть связано с гидрофобной природой ЭХ. Проверка стабильности ЭХ показала, что он не окисляется и сохраняет нативность после инкапсуляции в липосомы и их лиофилизации. ( (Приложение1, 2) Загрузка липосом отрицательно заряженным полисахаридом- каррагинаном приводит к увеличению дзета-потенциала до более отрицательных значений, что вместе с увеличением размеров липосом позволяет предположить образование на их поверхности полисахаридной оболочки. Используемый в работе каппа- Карр. имеет высокую молекулярную массу (Mw = 5,1 × 105) и поэтому может образовывать протяжённые покрытия на липосомах. На это указывает и более высокое значение отрицательного заряда для липосом-100 по сравнению с липосомами-400, что обусловлено большим количеством каррагинана, способного полностью покрыть более мелкие липосомы. Данные ДНС согласуются с анализом поверхности липосом, полученными СЕМ. Покрывая липосомы мукоадгезивным полимером, можно улучшить их мукоадгезивные свойства и, тем самым, время пребывания на поверхности слизистой оболочки. ( Приложение 3, 4) Для характеристики мукоодгезивных свойств липосом исследовали их взаимодействие с муцином желудка свиньи, который аналогичен муцину эпителия желудочно-кишечного тракта человека, проводя сравнительный анализ липосом в воде и растворе муцина. Заряд нагруженных Карр./ЭХ липосом изменяется в растворе муцина: уменьшается для Карр./ЭХ липосом -400, но увеличивается для Карр./ ЭХ липосом -100, при этом размер последних липосом практически не меняется. Можно предположить, что липосомы-100, благодаря небольшому размеру включаются в поры матрицы муцина, не разрушая его, в отличие от крупных липосом - 400 нм. Муцин может адсорбироваться на липосомах -400. Данные, полученные СЭМ, согласуются с этим предположением. Таким образом, липосомы нагруженные Карр/ЭХ обладают мукоадгезивными свойствами, необходимых для взаимодействия с ком¬по¬нен¬та¬ми сли¬зис¬той оболочки и пролонгированного действия включённого лекарственного препарата.( Приложение 3,4) В эксперименте ex vivo на модели слизистой оболочки ткани кишечника показано, что ЭХ высвобождается из липосом и удерживается на слизистой. Липосомная форма с Карр. перспективна при трансбуккальном и пероральном способах введения лекарственной субстанции ЭХ, учитывая кардиопротекторное действие ЭХ и гастропротекторный эффект ( 2017) Карр/ЭХ/. Показано, что липосомы, содержащие Карр/ЭХ не оказывают цитотоксического действия на клетки кишечного эпителия человека Сасо-2. На основе полиионных полимеров-Карр. и хитозана (ХН) получены наночастицы, которые использованы для включения в них ЭХ. Однородные и устойчивые наночастиц получали при растворении ЭХ в растворе Карр. и дальнейшем получении как положительно, так и отрицательно заряженных комплексов ХН/Карр, содержащих ЭХ. Оценку их мукоадгезивных свойств проводили по характеристике поверхностного заряда наночастиц в растворе муцина. ( Приложение 5) Значение поверхностных -потенциалов комплексов ХН/Карр., содержащих ЭХ, снижается при их инкубации с муцином, что наблюдалось и для исходных комплексов без ЭХ. Следовательно, наночастицы ХН/Карр. при включении в них ЭХ сохраняют мукоадгезивные свойства. Полученные данные открывают перспективу использования ХН/Карр. нанокомпозитов в качестве матрицы лекарственной субстанции ЭХ для не инвазивного применения. Исследованы мукоадгезивные свойства мультислойных Карр/ХН плёнок, полученных в ходе выполнения проекта в 2017г, по оценке степени набухания и степени эрозии пленок с использованием свежезамороженной внутренней поверхности тонкого кишечника свиньи в качестве модельной слизистой. Наименьшее набухание наблюдается для трехслойной плёнки, при ее контакте со слизистой со стороны ХН, а максимальное со стороны Карр. Полученные данные свидетельствуют, что мукоадгезивные свойства плёнок зависят от полисахаридного состава. Для включения ЭХ из ряда исследованных плёнок, выбраны плёнки с наилучшими мукоадгезивными свойствами. Изучено влияние ЭХ, включённого в полисахаридную матрицу, на функциональное состояние и жизнеспособность HT-29 эпителиальных клеток кишечника в монослое в нормальных и стрессовых условиях. Карр., ЭХ и их комплекс Карр/ЭХ проявляют инертность по отношению к НТ-29 эпителиальным клеткам кишечника в нормальных условиях, но восстанавливают их жизнеспособность и проницаемость в стрессовых условиях, вызванных действием этанола. ( Приложение 7) Установлен концентрационный диапазон ЭХ, включенного в полисахаридную матрицу в экспериментах ex vivo и in vivo. На модели индометациновой язвы желудка показано, что ЭХ,. в комплексе в Карр. в диапазоне концентраций 0.5 - 1 мг/кг, обладает высокой гастропротекторной активностью, которая при наивысшей (1 мг/кг) концентрации ЭХ превосходит активность эталонного препарата фосфалюгель, взятого в эквивалентной дозе. В эксперименте ex vivo ЭХ в комплексе с Каррагином при концентрации 1х10-4 М, оказывает такой же кардиопротекторный эффект, как и чистый ЭХ при данной концентрации. В экспериментах in vivo оценён протективный эффект ЭХ, Карр. и их комплекса при эндотоксемии, индуцированной внутрибрюшинным введением бактериального эндотоксина (липополисахарида-ЛПС) E. coli животным. Бактериальная эндотоксемия вызывает полиорганную недостаточность с нарушением физиологических функций и расстройством метаболизма в организме человека и животных. Органо-соматического индекс (ОСИ) является индикатором негативного воздействия ЛПС и позволяет оценить степень эндотоксемии. Показатели ОСИ указывали на выраженную стресс-реакцию мышей, вызванную ЛПС, которые восстанавливались при пероральном введении как каррагинана, так и эхинохрома, включенного в каррагинан. В патогенезе ЛПС-индуцированной эндотоксемии ведущую роль играют нарушения энергетического обмена. ЛПС E. coli угнетал процесс энергообеспечения в организме, тогда как Карр., ЭХ и в большей степени их комплекс поддерживают биоэнергетические процессы в организме и в значительной степени препятствуют дефициту АТФ, гликогенолизу и ацидозу в печени. Полученные дынные показывают, что Карр/ЭХ минимизирует патофизиологические проявления эндотоксемии, вызванной ЛПС E. coli у мышей.( Приложение 8) Одним из прямых проявлений воспалительного действия ЛПС является индукция избыточного синтеза цитокинов иммунными клетками организма, осуществляемая через взаимодействие с клеточными рецепторами, важнейшими из которых являются Toll-подобный рецептор (TLR4). Нами ранее было показано, что Карр, как и ЛПС обладают способностью активировать клетки и запускать в них синтез как про,- так и противовоспалительных цитокинов. Для оценки участия в этом процессе ЭХ в экспериментах ex vivo была исследована цитокин-индуцирующая активность (ФНО) комплекса Карр./ЭХ и исходных веществ с использованием моноклональных антител, блокирующих рецептор TLR4. В отличие от Карр. , ЭХ ингибировал синтеза ФНО клетками с заблокированными рецепторами , что может указывать на участие рецептора TLR-4 в реализации активирующего эффекта ЭХ, которое сохраняется в комплексах Карр/ЭХ.( Приложение 9) Исследовано нейропротекторное действие ЭХ, включённого в полисахаридную матрицу, на экспериментальной моделей рассеянного склероза, вызванного хроническим введением купризона экспериментальным животным. Косвенным критерием нейропротекторного действия считается нормализация двигательной, исследовательской, координаторной активности и порога температурной чувствительности в опытных группах относительно таких же показателей у интактных животных. Полученные результаты показали, что Карр. ЭХ и их комплекс Карр/ЭХ проявляют защитный эффект на центральную нервную систему (ЦНС) в фазе острой демиелинизации, вызванной 6-недельным введением купризона. На стадии хронической 12-недельной интоксикации эффекты каррагинана и эхинохрома носили разнонаправленный характер на состояние проводников поверхностной чувствительности, двигательную и исследовательскую активность, что, по-видимому, обусловлено их специфическими фармакодинамическими эффектами в ЦНС. Комплекс ЭХ с Карр., как и его исходные компоненты, не оказывают миелин-сберегающего действия, однако не проявляют аксонопатического действия, что выражается в сохранении функциональной активности ЦНС на поздних этапах купризоновой экспозиции. Разработан лабораторный регламент на получение липосом, содержащих каррагинан и эхинохром Регламент разработан для получения в лабораторных экспериментальных условиях серий препарата «Липосомы, содержащие каррагинан и эхинохром», предназначенного для доклинических исследований и испытаний на животных. В нем описаны- лабораторный процесс получения липосом, состоящий из четырех стадий, характеристика готовой продукции, контроль химической стабильности, фармако-технологические испытания. В регламенте подробно изложены пункты основного процесса, представлена технологическая схема, дана характеристика сырья и вспомогательных материалов, приведен перечень оборудования и приборов, материальный баланс. Даны инструкции по безопасности производства и информационные материалы.( Приложение 10)