КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-14-00052

НазваниеРасшифровка молекулярного механизма биолюминесценции высших грибов и разработка методических основ ее использования с целью создания новой патентно чистой линии аналитических методов для биотехнологии и медицины

РуководительГительзон Иосиф Исаевич, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регионИнститут биофизики Сибирского отделения Российской академии наук – обособленное подразделение ФИЦ КНЦ СО РАН, Красноярский край

Года выполнения2016 - 2018

КонкурсКонкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словабиолюминесценция, грибы, биотехнология, тест-системы, люцифераза, светящиеся грибы, Neonothopanus nambi, люциферин, люцифераза, люминесцентная система

Код ГРНТИ62.00.00


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Общей научной проблемой, в рамках которой планируется данный проект, является расшифровка физико-химических и молекулярных механизмов функционирования биолюминесцентных систем, в частности грибов. В настоящее время известно о существовании примерно тридцати различных в химическом отношении систем биолюминесценции, однако структуры субстратов установлены только для девяти систем, и лишь для пяти изучены механизмы реакции. Одной из самых загадочных до недавнего времени оставалась биолюминесцентная система грибов. Ранее предполагалось, что система грибной биолюминесценции в общих чертах аналогична системе биолюминесценции бактерий, а реакция проходит по классической люциферин-люциферазной схеме. Установление химической структуры ключевого участника реакции грибной биолюминесценции – люциферина 3-гидроксигиспидина, который был впервые выделен, расшифрован и химически синтезирован авторами данного проекта [K.V.Purtov, V.N. Petushkov, M.S.Baranov, K.S.Mineev, N.S.Rodionova, Z.M.Kaskova, A.S.Tsarkova, A.I.Petunin, V.S.Bondar, E.K.Rodicheva, S.E.Medvedeva, Y.Oba, Y.Oba, A.S.Arseniev, S.Lukyanov, J.I. Gitelson, I.V.Yampolsky. The chemical basis of fungal bioluminescence. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Volume 54, Issue 28 (July 6, 2015) p. 8124–8128.], открыло путь к детальному исследованию механизма биолюминесцентной реакции грибов. Наличие синтетического субстрата в любых требуемых количествах позволяет нашей команде начать изучение ферментов, ответственных за генерацию света и, в итоге, прийти к пониманию молекулярного механизма свечения грибов. Исходя из сказанного, задачей проекта является расшифровка последовательности генов, кодирующих ферменты - люциферазы светящихся высших грибов, на примере тропического гриба Neonothopanus nambi. Дальнейшее получение биотехнологического штамма - суперпродуцента люциферазы снимет ограничение в доступности фермента и позволит перейти к разработке методов аналитического применения биолюминесцентной системы грибов в сферах промышленных биотехнологий и медицины. Поставленная задача обладает абсолютной новизной, так как расшифровка структуры субстрата реакции является химическим базисом исследования любой биолюминесцентной системы, и приоритет в этом открытии дает нам уникальную возможность развивать научное направление биолюминесценции грибов, как научное, так и практическое, в нашей стране и в мире. Настоящий проект представляется особенно актуальным в свете большого потенциала практического применения исследуемой нами новой биолюминесцентной системы. Открытие и исследование новых люминесцентных систем, выяснение химической природы их структурных и регуляторных компонентов имеют большое значение для понимания механизмов преобразования энергии химических связей в кванты света, что является одной из фундаментальных задач биофизики. В биологии такие исследования помогают полнее проследить эволюционные пути, а также приблизиться к разгадке возникновения и значения люминесценции для биохимии и этологии живых организмов. С практической точки зрения, каждое такое открытие расширяет спектр анализируемых веществ, приводит к разработке новых методов мониторинга окружающей среды, технологических и биологических процессов. Сегодня биолюминесцентный анализ на основе систем светляков и бактерий применяются в широком круге практических задач – это визуализация и мониторинг процессов жизнедеятельности клеток и целых организмов; качественный и количественный анализ различных аналитов, а также различных белков и низкомолекулярных соединений; измерение активности ферментов; клинические анализы и тест-системы для скрининга лекарственных кандидатов. Для решения поставленной задачи будет применен комплексный междисциплинарный подход, включающий методы и инструментальные возможности биохимии, биофизики, молекулярной биологии, генной инженерии. В составе рабочей группы представлены специалисты, компетентные по каждому из этих методов. Успешное выполнение проекта позволит впервые установить детальный механизм люминесцентной реакции светящихся грибов и получить новую биолюминесцентную систему, пригодную для решения практических аналитических задач в биотехнологии и медицине. Выполнение проекта также внесет существенный вклад в раздел современной биохимии, посвященный люминесценции живых организмов. У России будет приоритет установления механизма реакции грибной биолюминесценции с перспективой создания на его основе широкого спектра аналитических применений для биотехнологии и медицины, обладающих патентной чистотой.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта впервые будет сделано детальное описание структурно-функциональной организации биолюминесцентной системы грибов. Определение аминокислотной последовательности люциферазы гриба Neonothopanus nambi позволит проследить ее эволюционное происхождение и сделать выводы о механизме связывания субстрата и самой биолюминесцентной реакции грибов. Будет клонирован ген этой новой люциферазы. Варианты производных нового люциферина гриба Neonothopanus nambi с заранее заданными спектральными характеристиками излучения, например, испускающие свет в красной и дальне-красной области (что наиболее востребовано в медицинских исследованиях), будут получены в результате применения приемов молекулярного дизайна. Все вышеперечисленное в итоге приведет к разработке новых вариантов технологий биолюминесцентного имиджинга различных аналитов и белков в клеточных процессах in vivo, созданию новых методов мониторинга окружающей среды, тест-систем для промышленных биотехнологий, медицины и фармакологии. Пионерский характер проекта, его абсолютная новизна, обеспечивают возможности патентной защиты всех практически значимых результатов, связанных с использованием грибной биолюминесцентной системы (новые люциферины и люциферазы и способы их применения). Результаты проекта будут опубликованы в виде серии статей в ведущих зарубежных и отечественных научных изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, PubMed, РИНЦ. (таких как журналы Nature Publishing Group, Journal of the American Chemical Society, Angewandte Chemie International Edition, The Journal of Organic Chemistry, Биоорганическая Химия и других).


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Для решения задачи детального изучения новой уникальной грибной биолюминесцентной системы на первый год выполнения проекта было запланировано получение очищенного препарата люциферазы – фермента, ответственного за генерацию света в грибах. Работу проводили на биомассе тропического гриба Neonothopanus nambi, которую наращивали в культиваторах. В результате предварительных исследований был найден способ многократного увеличения интенсивности биолюминесценции мицелия N.nambi путем его вымачивания и отмывки в дистиллированной воде. Установлено, что люциферазная активность не секретируется в культуральную жидкость, а локализована исключительно в клетках гриба. Разработана методика получения гомогенной люциферазы, включающая четыре основных этапа: приготовление лизата N.nambi, концентрирование целевого белка, его хроматографическую очистку, нативный гель-электрофорез. Процедура разрушения клеток мицелия на первом этапе включала заморозку биомассы, механическое перетирание в ступе, обработку ультразвуком. Экстракцию целевого фермента проводили из микросомальной фракции, содержащей практически всю люминесцентную активность и полученной в результате двухступенчатого центрифугирования безъядерного супернатанта. Максимальная концентрация люциферазы достигалась путем солюбилизации ее в мицеллы детергента додецилмальтозида. Очистку люциферазы проводили в несколько стадий, с применением анионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose и гель-фильтрации на Superdex 200. На следующей стадии была применена методика электрофореза очищенного препарата с целью нахождения полосы, соответствующей люциферазной активности. Электрофорез проводили как в денатурирующих, так и в нативных условиях. Требуемого надежного результата удалось достигнуть только в последнем случае. Для конечного этапа была разработана процедура двумерного электрофореза в натуральных условиях с последующей детекцией биолюминесценции, для чего гель инкубировали в смеси, содержащей синтетический грибной люциферин. В итоге удалось выявить светящееся пятно. Последующая окраска геля серебром позволила достоверно локализовать целевой белок и вырезать его из геля. Была проведена серия таких экспериментов, в результате чего гомогенная люцифераза была выделена в количестве, достаточном для проведения секвенирования по Эдману (N-концевое секвенирование) и масс-спектрометрического секвенирования. Для решения задачи определения структурных фрагментов молекулы люциферина грибов, ответственных за люминесцентную реакцию, и получения аналогов люциферина грибов с измененными спектрами биолюминесценции, было синтезировано шесть производных люциферина, содержащих различные донорные заместители в бензольном ядре: (E)-3,4-дигидрокси-6-(4-гидроксистирил)-2H-пиран-2-он; (E)-3,4-дигидрокси-6-(2-(6-гидроксинафталин-2-ил)винил)-2H-пиран-2-он; (E)-3,4-дигидрокси-6-(2-(тиофен-2-ил)винил)-2H-пиран-2-он; (E)-6-(2-(1H-индол-3-ил)винил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он; (E)-6-(4-(диэтиламино)стирил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он; (E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-гексагидропиридо[3,2,1-ij]хинолин-9-ил)винил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он. Из них все, кроме тиофен-содержащего аналога, проявили биолюминесцентные свойства. Изучены спектральные характеристики этих пяти соединений. Максимум биолюминесценции для нафталин-содержащего производного смещен относительно природного люциферина в красную область, в то время как для четырех других аналогов наблюдается смещение в синюю часть спектра. По полученным данным, активность аминосодержащих аналогов люциферина (E)-6-(4-(диэтиламино)стирил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он и (E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-гексагидропиридо[3,2,1-ij]хинолин-9-ил)винил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он превышает активность природного люциферина в 2 и 4 раза, соответственно. Производные с нафталиновым и индольным ядром малоактивны. Самый близкий к люциферину аналог, содержащий фенольный заместитель вместо катехольного, проявляет активность, равную 75% активности природного люциферина. Таким образом, установлено, что в реакции биолюминесценции ключевую роль играет пираноновый фрагмент люциферина грибов, в то время как катехольный фрагмент выполняет роль ауксохромного заместителя. Возможность широкого варьирования структуры полученных аналогов в области ароматического ядра люциферина без потери люминесцентной активности ясно указывает на то, что реакция биолюминесценции затрагивает только пираноновый фрагмент молекулы грибного люциферина. Для установления структуры продукта реакции биолюминесценции грибного люциферина – оксилюциферина – инкубировали субстрат реакции с белковым экстрактом гриба N. nambi, содержащим люциферазу. При этом отслеживали динамику образования продуктов по ВЭЖХ. Установлено, что первоначально образующийся из люциферина оксилюциферин, деградирует, распадаясь на четыре производных. На основании данных структурного анализа этих четырех молекул, была предложена формула самого оксилюциферина грибов как (2Z,5E)-6-(3,4-дигидроксифенил)-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновой кислоты. Для подтверждения данной структуры был проведен встречный синтез. Полученное соединение совпало с нативным оксилюциферином по хроматографической подвижности, форме пика и спектру поглощения. На основании суммы полученных данных была предложена схема двухстадийной реакции биолюминесценции высших грибов.

 

Публикации

1. Баранов М.С.; Каськова З.М.;Гритченко Р.; Постикова С.Г.; Ивашкин П.Е.; Кислихин А.А.; Москвин Д.И.; Минеев К.С.;Арсеньев А.С.; Лабас Ю.А.; Ямпольский И.В. Synthesis of Panal Terpenoid Core Synlett, - (год публикации - 2016).

2. Царькова А.С., Каськова З.М., Ямпольский И.В. A Tale Of Two Luciferins: Fungal and Earthworm New Bioluminescent Systems Accounts of Chemical Research, 49 (11), pp 2372–2380 (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Для решения задачи детального изучения новой уникальной грибной биолюминесцентной системы на второй год выполнения проекта было запланировано получение библиотеки кДНК гриба Neonothopanus nambi. Для этого сначала из биомассы биолюминесцентного мицелия этого гриба выделили препарат суммарной РНК, а затем обогатили данный препарат мРНК с помощью магнитных частиц, несущих олигонуклеотиды олиго-dT. На следующем этапе на матрице этого обогащённого препарата РНК синтезировали ДНК-РНК гибрид и амплифицировали кДНК гриба Neonothopanus nambi с получением библиотеки двуцепочечной ДНК. Данную библиотеку подготавливали к высокопроизводительному секвенированию на платформе Illumina с помощью лигирования адаптеров TruSeq (Illumina) и проводили специфическую амплицикацию с праймерами от производителя для обогащения молекулами, успешно прошедшими лигирование. Полученный ПЦР-продукт очищали и благодаря вырезанию из агарозного геля для электрофореза соответствующей полосы обогащали последовательностями длиной 300-500 пар оснований. После этого препарат ДНК денатурировали в NaOH 0,1М и растворяли в HT1 буфере (Illumina), доводя до концентрации 10 pM. Затем генерировали кластеры в cBot (Illumina), используя набор реагентов TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS и проводили секвенирование по протоколу парного прочтения (2x100bp) с помощью китов Hiseq200 и TruSeq SBS chemistry. Демультиплексирование проводили с помощью CASAVA-1.8.2 (Illumina). Парные прочтения, полученные на платформе Illumina, анализировали и удаляли из них фрагменты последовательностей адаптеров, а также последовательности нуклеотидов, имеющие низкие значения Phred. Затем из данных удаляли короткие прочтения длиной менее 75 нуклеотидов. Оба этапа проводились программой Trimmomatic c использованием следующих параметров: ILLUMINACLIP:../TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10 LEADING:10 TRAILING:10 SLIDINGWINDOW:5:15 MINLEN:70 HEADCROP:10. Полученные процессированные последовательности подвергались дальнейшей фильтрации: проводилась очистка от потенциальных контаминантов c помощью программы Bowtie2 и базы данных Genbank RefSeq. Наконец, из оставшихся прочтений проводили сборку транскриптома Neonothopanus nambi de novo с помощью программы Trinity, используя параметры, заданные в программе по умолчанию. Для получения аминокислотной последовательности люциферазы проводили гидролиз белка в полиакриламидном геле. Фрагмент полиакриламидного геля, соответствующий белковой полосе или пятну вырезали и подготавливали для проведения масс-спектроскопии с получением пептидной смеси. Для данной пептидной смеси проводили масс-спектрометрическое исследование с помощью метода LC-MS. Среди полученных масс-спектрометрических данных, обработанных оператором, производили поиск кандидатов на роль люциферазы в транскриптоме N. nambi. В результате были идентифицированы несколько возможных генов-кандидатов, которые были впоследствии клонированы в бактерии E. coli. Однако результаты проверки активности дали неоднозначные результаты, не позволяющие с уверенностью идентифицировать люциферазу, что, как выяснилось впоследствии, было связано с неоптимальными условиями экспрессии белков, а также тем фактом, что люцифераза гриба N. nambi является мембранным белком, что затрудняет его правильное сворачивание в клетках прокариот. В связи с полученными данными, было принято решение создать библиотеку кДНК гриба N. nambi и клонировать ее в дрожжи для последующей идентификации клона, экспрессирующего люциферазу. Для установления нуклеотидной последовательности гена новой люциферазы N. nambi была создана библиотека кДНК. Для этого из свежего мицелия гриба N. nambi была выделена тотальная РНК, обогащена фракцией мРНК и использована в качестве матрицы для синтеза библиотеки кДНК. Данная библиотека была заклонирована в вектор GAP-pPic9K для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris. Линеаризованную библиотеку плазмид кДНК использовали для трансформации штамма Pichia pastoris GS115 электропорацией. Трансформированные клетки рассевали по чашкам Петри с твёрдой питательной средой и выращивали до состояния отдельных различимых колоний. Конечная библиотека кДНК N. nambi содержала около 1 миллиона колоний дрожжей. Каждую чашку Петри с трансформантами опрыскивали раствором люциферина гриба и анализировали с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer). Из светящихся клонов выделяли геномную ДНК и проводили амплификацию со специфических праймеров на встраиваемую последовательность. Все секвенированные клоны содержали одну и ту же последовательность, соответствующую последовательности гена nnLuz. Наконец, в наши планы входило клонирование гена новой люциферазы N. nambi, получение бактериального и/или эукариотического штамма-продуцента рекомбинантной люциферазы. Нами были выбраны бактериальный вектор pET23b, дрожжевой вектор pGAP-Kan, и вектор для экспрессии в культурах клеток млекопитающих C1. На основе данных векторов были созданы плазмиды, кодирующие ген nnLuz, которые были названы, соответственно, nnLuz/pGAP_Kan, nnLuz/pET23, nnLuz/C1. Работа данных ДНК-конструкций была проверена в клетках соответствующих организмов: nnLuz/pGAP_Kan в дрожжах P. pastoris GS115, nnLuz/pET23 в бактериях E. coli BL21 CodonPlus (DE3) и nnLuz/C1 в культурах человеческих клеток HEK293T, HeLa и культуре мышиных клеток CT26. В каждом из случаев в ответ на добавление люциферина грибов к клеткам возникала биолюминесценция, которую можно было детектировать люминометром Glomax 20/20 (Promega). С помощью векторов nnLuz/pGAP_Kan, nnLuz/pET23 были созданы штаммы-продуценты рекомбинантной люциферазы: штамм дрожжей P. pastoris GS115 и штамм бактерий E. coli BL21 CodonPlus (DE3), соответственно.

 

Публикации

1. - Российские учёные научили грибы светиться всеми цветами радуги Наука в Сибири, 27 апреля 2017 (год публикации - ).

2. Каськова З.М., Дёрр Ф.А., Петушков В.Н., Пуртов К.В., Царькова А.С., Родионова Н.С., Михеев К.С., Гугля Е.Б., Котлобай А.А, Балеева Н.С., Баранов М.С., Арсеньев А.С., Гительзон И.И., Лукьянов С., Ямпольский И.В. ... Mechanism and color modulation of fungal bioluminescence Science Advances, Vol. 3, no. 4, e1602847 (год публикации - 2017).

3. Пуртов К. В., Осипова З. М., Петушков В. Н., Родионова Н. С., Царькова А. С., Котлобай А. А., Чепурных Т. В., Гороховатский А. Ю., Ямпольский И. В., Гительзон И. И. Структура оксилюциферина грибов – продукта реакции биолюминесценции ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, том 477, № 2, с. 245–248 (год публикации - 2017).

4. Ямпольский И.В. Fungal bioluminescence system: luciferin, luciferase and luciferin biosynthesis FEBS Journal, 284 (Suppl. 1) (2017) p. 189, P.1.3-027 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В результате работ, выполненных в течение 2018 года, наша научная группа смогла приблизиться к пониманию пространственной структуры белка из принципиально нового семейства, не имеющего описанных гомологов, - люциферазы грибов. В связи с уникальностью открытого нами фермента, и низкой предсказательной силы алгоритмов, рассчитывающих трёхмерные пространственные структуры для белков, структура гомологов которых не описана экспериментально, нам удалось получить слабо достоверную модель трёхмерной структуры люциферазы. Однако нами были вполне успешно определены консервативные участки, необходимые для функционирования люциферазы, предсказаны элементы вторичной структуры (6 альфа-спиралей и от 5 до 6 бета-участков для люцифераз различных грибов). С помощью экспериментальных подходов направленного и случайного мутагенеза мы определили роль цистеиновых остатков в белке люциферазы N. nambi: в частности, при точечных заменах на сериновые остатки или остатки, типичные для люцифераз других грибов наблюдалось падение люминесценции в различной степени; при случайном мутагенезе выявлялась тенденция к исчезновению люминесцентной активности при замене аминокислотных остатков Asp127, Arg136, Ser144, Asp173, Arg176, Glu237, Glu238, что дает основание для дальнейших исследований путем сайт-направленного мутагенеза именно этих аминокислот. Была разработана методика выделения функционально-активной люциферазы nnLuz-CHis, проэкспрессированной в клетках P. pastoris, анализ спектра кругового дихроизма это препарата указывает на то, что люцифераза, выделенная после экспрессии в клетках P.pastoris обладает выраженной вторичной структурой и может быть использована для дальнейшего установления её структуры методами рентгеновской кристаллографии, а также ЯМР. Кроме того, нами были созданы специфичная количественная тест-система на кофейную кислоту, работающая в пределах концентраций субстрата от 10 mkM до 12,5 mM. При этом предел детекции тест-системы достигает 50 пмоль.

 

Публикации

1. - НАУКА Гриб-светильник: ученые смогут создать живые предметы обихода Известия, 27 ноября 2018 (год публикации - ).

2. - Ученые выяснили, как светятся грибы, и создали светящиеся дрожжи Газета.ru, 27.11.2018 (год публикации - ).

3. - Российские биологи создали дрожжи, светящиеся в темноте РИА Новости, 27 ноября (год публикации - ).

4. Котлобай А.А, Саркисян К., Мокрушина Ю., Маркет-Хоубен М.,Серебровская Е., Маркина Н., Сомермеер Л.Г., Гороховатский А., Пуртов К.В., Петушков В.Н., Родионова Н.С., ... Genetically encodable bioluminescent system from fungi PNAS, vol. 115 no. 49 (год публикации - 2018).

5. Пуртов К.В., Гороховатский А.Ю., Котлобай А.А., Осипова З.М., Петушков В.Н., Родионова Н.С., Царькова А.С., Чепурных Т.В., Ямпольский И.В., Гительзон И.И. Isolation and Purification of Fungal Luciferase from Neonothopanus nimbi Doklady Biochemistry and Biophysics, Volume 480, Issue 1, May 2018, P. 177-180 (год публикации - 2018).

6. Ямпольский И.В., Пуртов К.В. New bioluminescence systems: luciferins, luciferases and luciferin biosynthesis pathways FEBS OPEN BIO, V. 8 P.: 26-26 (год публикации - 2018).