Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. На основе коммерческих плазмид pFRT\LacZeo (Life Technologies) и pEGFP-N1 (Clontech) была сконструирована новая плазмида pFRT\GFP-Zeo, в которой ген ß-лактомазы (Lac) был заменен на ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с геном, кодирующим белок sh-ble, который является геном устойчивости к селективному антибиотику зеоцин. Плазмида pFRT\GFPZeo (5694 b.p.) нужна для введения FRT-сайта для гомологичной рекомбинации в активный район хроматина эукариотических клеток. 2. Клетки суспензионных линий CHO-S и DG-44 трансфецировали сконструированной плазмидой pFRT\GFP-Zeo. Стабильные клоны для каждой линии отбирали методом предельных разведений. При этом учитывали интенсивность флуоресценции GFP (рис. 1), которую оценивали на проточном цитофлуориметре NovoCyte (ACEA). В результате были получены суспензионные клеточные линии CHO-S/FRT и DG-44/FRT, содержащие FRT-сайт для гомологичной рекомбинации в хромосоме. Клеточные линии были наработаны и заложены на хранение для будущих экспериментов. 3. Конструирование двух векторных шаттл-плазмид, содержащих FRT-сайт для гомологичной рекомбинации, селективный ген дигидрофолат редуктазы (первая плазмида) или ген глутамин синтетеазы (вторая плазмида), которые позволяют амплифицировать интегрированные в геном плазмидные ДНК происходило в несколько этапов. 3.1. В коммерческой плазмиде pOptiVec-TOPO (Life Technologies), содержащей ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), IRES-элемент вируса энцефаломиокардита (EMCV) заменили на промотор фосфоглицераткиназы pGK, получив промежуточную плазмиду pOptiVec-DHFR (4402 b.p.). 3.2. В коммерческой плазмиде pOptiVec-TOPO (Life Technologies) заменили ген DHFR на ген, кодирующий глутаминсинтетазу (glul), получив новую плазмиду pOptiVec-glul. Для этого предварительно клонировали ген, кодирующего глутаминсинтетазу (glul) мыши. Функциональную активности клонированного гена glul доказали, отобрав клетки CHO-S, трансфецированные плазмидой pOptiVec-glul, способные стабильно расти в среде без глутамина, содержащей 25 µM метионин сульфоксимина (ингибитор глутамина). Исходные клетки CHO-S не могут расти в среде без глутамина. 3.3. На основе коммерческой плазмиды pCDNA5/FRT и созданной нами ранее плазмиды pbudCE4.1/full_Ab, содержащей оптимизированные гены, кодирующие константные домены тяжелой и легкой цепей антитела человека, была получена промежуточная плазмида pCDNA5/FRT-CL-CH (7908 b.p.), содержащая FRT-сайт для гомологичной рекомбинации и гены константных доменов тяжелой и легкой цепей антител. 3.4. Затем в плазмиду pCDNA5/FRT-CL-CH ввели последовательность, содержащую промотор гена фосфоглицераткиназы, ген, кодирующий DHFR, и сайт полиаденилирования тимидинкиназы, получив плазмиду pCDNA5/FRT-DHFR-CL-CH (9352 b.p.). 3.5. В плазмиду pCDNA5/FRT-CL-CH ввели последовательность, содержащую промотор фосфоглицераткиназы, ген, кодирующий глутаминсинтетазу и сайт полиаденилирования тимидинкиназы, получив плазмиду pCDNA5/FRT-glul-CL-CH (9302 b.p.). Таким образом, были получены оригинальные векторные шаттл-плазмиды pCDNA5/FRT-DHFR-CL-CH и pCDNA5/FRT-glul-CL-CH, содержащие FRT-сайт для гомологичной рекомбинации, оптимизированные гены константных доменов тяжелой и легкой цепей IgG человека, сайты полиаденилирования, соответствующие промоторы и сайты для быстрого клонирования генов, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антител. 4. В шаттл-плазмиды pCDNA5/FRT-DHFR-CL-CH и pCDNA5/FRT-glul-CL-CH был встроен ген, кодирующий вариабельный домен тяжелой цепи антитела fh8Е, полученный путем ПЦР на основе созданной ранее в нашей лаборатории плазмиды pCHm2-8E; получены промежуточные плазмиды - pCDNA5/FRT-DHFR-CL-H_8E и pCDNA5/FRT-glul-CL-H_8E. Затем в промежуточные плазмиды pCDNA5/FRT-DHFR-CL-H_8E и pCDNA5/FRT-glul-CL-H_8E встроили ген, кодирующий вариабельный домен легкой цепи антитела fh8Е, полученный путем ПЦР на основе созданной ранее в нашей лаборатории плазмиды pCLm4-hygro-8E. Таким образом, были получены плазмиды pCDNA5/FRT-DHFR-full_8E и pCDNA5/FRT-glul-full_8E, кодирующие тяжелые и легкие цепи полноразмерного антитела человека против белка p35 ортопоксвирусов, содержащие FRT-сайт для гомологичной рекомбинации, селективный ген дигидрофолат редуктазы (первая плазмида) или ген глутамин синтетеазы (вторая плазмида). 5. Для получения штамма-продуцента полноразмерного антитела была оптимизирована методика трансфекции соответствующими плазмидами клеток созданных нами в ходе выполнения проекта двух линий: CHO-S/FRT и DG-44/FRT. Для этого на первом этапе выбрали соотношение вспомогательной плазмиды pOG44 с геном, кодирующим флиппазу, и плазмид, несущих гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи антитела fh8E (pCDNA5\FRT-DHFR-full_и pCDNA5\FRT-Glul-full_8E). Оптимальными оказались следующие условия трансфекции: - для клеток DG44\FRT: соотношение плазмиды pOG44 с любой из целевых плазмид (pCDNA5\FRT-DHFR-full_8E и pCDNA5\FRT-glul-full_8E) составило 1\19; - для клеток CHO-S\FRT: соотношение плазмид pOG44 с любой из целевых плазмид (pCDNA5\FRT-DHFR-full_8E и pCDNA5\FRT-glul-full_8E) составило 1\9. Затем популяции клеток DG-44/FRTс интегрированной плазмидой pCDNA5\FRT-DHFR-full_8E, DG-44/FRTс интегрированной плазмидой pCDNA5\FRT-glul-full_8E, CHO-S/FRTс интегрированной плазмидой pCDNA5\FRT-DHFR-full_8E и CHO-S/FRTс интегрированной плазмидой pCDNA5\FRT-glul-full_8E клонировали, отобрав по 10 клонов для каждого варианта (всего 40 клонов), и каждый клон проверили на чувствительность к зеоцину. В клонах, чувствительных к зеоцину, провели амплификацию встроенных генов. При этом оптимизировали состав сред. Успешность амплификации оценивали по удельной продуктивности, которую рассчитывали по формуле: qP = ((P1-P0)/(X1-X0))×µ, где P1-концентрация полноразмерного антитела 8Е в момент времени t1, Pt0-концентрация полноразмерного антитела 8Е в момент времени t0, X1-концентрация клеток в момент времени t1, X0-концентрация клеток в момент времени t0, а µ = ln(X1/X0)×1/(t1-t0). Уровень продукции антитела 8Е тестировали методом ИФА. Оптимальной для отбора клеток DG-44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full_8E) оказалась концентрация метотриксата (MTX) -100 нМ; клеток CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full_8E) – 400 нМ MTX; клеток DG-44/FRT(pCDNA5\FRT-glul-full_8E) – концентрация метионин сульфоксимина (MSX) - 25 мкМ; клеток CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-glul-full_8E) – MSX - 25 мкМ. Всего было получено четыре штамма продуцента антитела fh8E со следующей удельной продуктивностью : - DG-44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full_8E) - 4,2 пкг/клетку/день; - CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full_8E) - 1,1 пкг/клетку/день; - DG-44/FRT(pCDNA5\FRT-glul-full_8E) - 6,3 пкг/клетку/день; - CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-glul-full_8E) - 8,4 пкг/клетку/день. Таким образом, были оптимизированы условия трансфекции созданных нами суспензионных клеточных линий CHO-S/FRT и DG-44/FRT различными вариантами плазмид с геном, кодирующим полноразмерное антитело. Были созданы четыре штамма-продуцента полноразмерного человеческого антитела fh8E против белка р35 ортопоксвирусов. 6. Мышей иммунизировали конъюгатами синтетических олигосахаридов бета-глюкана и галактоманнана с бычьим сывороточным альбумином ((β-(1-3)-Glc)9-spacer-BSA и G5m-BSA), а также конъюгатом маннана с белком CRM - (α-Man-(1-3)-α-Man-(1-2)-α-Man-(1-2)- α-Man)17-CRM197). Отбор моноклональных антител (МКА) вели с использованием соответствующих антигенов, конъюгированных с биотином ((β-(1-3)-Glc)9-spacer-biotin, G5m-biotin, (α-Man-(1-3)-(α-Man-1-4)3)—biotin). Все конъюгаты синтезированы сотрудниками Лаборатории химии гликоконъюгатов ИОХ РАН им. Зелинского, РАН. В результате получена панель моноклональных антител мыши (МКА) против бета-глюкана (7 МКА), галактоманнана (7 МКА) и маннана (1 МКА). Гены, кодирующие вариабельные домены легких и тяжелых цепей полученных МКА, были секвенированы и проанализированы (Табл. 1, 2). Все отобранные МКА, за исключением одного МКА против галактоманнана, были наработаны в асцитах и очищены. Сродство всех МКА к соответствующим антигенам измерили методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием оптического биосенсора Proteon XPR 36 (Bio-Rad, США). Аффинность МКА 7B8 против галактоманнана составила КD = 3.9 × 10-9 M; аффинности МКА 3G11 и МКА 5H5 против бета-глюкана - КD = 1.3 × 10-8 M и КD = 1.9 × 10-9 M, соответственно (Рис. 2). Сродство других МКА к соответствующим лигандам оказалось > 10-6 М. Специфичность связывания МКА 7B8, 3G11 и 5H5 с клетками различных микроорганизмов оценили методом конфокальной микроскопии. Показано, что МКА3G11 и МКА5H5 против бета-1-3 глюкана, содержащегося в клеточной стенке низших грибов, связываются с клеточной стенкой Candida albicans и не связываются с клеточными стенками E.coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis. МКА 7B8 против галактоманнана, содержащегося в клеточной стенке Aspergillus spp., специфически связывается только с клеточной стенкой Aspergillus fumigatus и не связывается с клеточными стенками микроорганизмов, не имеющих в составе клеточной стенки галактоманан - Candida albicans, E.coli, S.aureus, Enterococcus faecalis (Рис. 3, 4). Таким образом, была создана панель МКА против синтетических олигосахаридов клеточной стенки низших грибов: 7 МКА против бета-1-3-глюкана, 7 МКА против галактоманнана и 1 МКА против маннана. МКА 7B8 (против галактоманнана), МКА 3G11 и МКА 5H5 (против бета-1-3-глюкана) продемонстрировали высокую аффинность и специфичность.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. С использованием разработанной ранее суспензионной клеточной линии CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-glul-full_8E), было наработано полноразмерное человеческое антитело fh8E против ортопоксвирусов. Аналогично было наработано полноразмерное человеческое антитело fh1А против ортопоксвирусов. Приблизительно 100 мкг антитела fh8E и 80 мкг антитела fh1A было очищено с использованием аффинной и анионообменной хроматографии. Электрофоретически было подтверждено присутствие у антител fh8E и fh1А тяжелых и легких цепей с молекулярными массами около 55 кДа и 25 кДа. С помощью вестерн-блот анализа было доказано наличие константных доменов иммуноглобулина человека у обоих антител. Методом MALDI-TOF масспектрометрии было показано отсутствие лидерных последовательностей в тяжелых и легких цепях антитела fh8E и подтверждено соответствие полипептидной последовательности этого антитела той последовательности, которая кодируется соответствующим геном, встроенным в плазмиду pCDNA5\FRT-glul-full_8E. Методом поверхностного плазмонного резонанса была определена аффинность взаимодействия полученных антител с рекомбинантным ортопоксвирусным белком p35delta12, способным конкурировать с вирусом осповакцины за связывание с анти-ортопоксвирусными моноклональными антителами. Равновесная константа аффинности (KD = koff / kon) для антитела fh8E составила 11,5 нM, а для антитела fh1A – 40 нм. 2. Анти-ортопоксвирусные свойства полноразмерных человеческих антител fh8E и fh1А были протестированы в реакции подавления бляшкообразования (PRNT) вирусов эктромелии, осповакцины и оспы коров in vitro. IC50 антитела fh8E составил около 25 мкг/мл для вируса эктромелии, IC50 антитела fh1A в отношении вируса осповакцины – 12.5 мкг/мл, а в отношении вируса оспы коров - 30 мкг/мл. Методом пептидного дисплея проведено картирование вируснейтрализующего эпитопа на белке р35 с использованием антитела fh1A. Показано, что вируснейтрализующий эпитоп ортопоксвирусного белка р35 является прерывистым, и аминокислотные остатки, расположенные на участках 15-19 аа и 232-237 аа, участвуют в формировании этого эпитопа. 3. На основе двух кассетных плазмид pCDNA5/FRT-DHFR-full_8E и pCDNA5/FRT-glul-full_8E, созданных в ходе выполнения текущего проекта в 2016 г., сконструированы аналогичные плазмиды, в которых ген, кодирующий полноразмерное человеческое антитело fh8E против ортопоксвирусов было заменено на гены, кодирующие химерные антитела ch14D5а, ch1B1 и ch10C2 против различных эпитопов гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита: pCDNA5/FRT-DHFR-full_14D5, pCDNA5/FRT-DHFR-full_1B1, pCDNA5/FRT-DHFR-full_10C2, pCDNA5/FRT-glul-L_full_14D5, pCDNA5/FRT-glul-L_full_1B1, pCDNA5/FRT-glul-L_full_10C2. Правильность конструирования была подтверждена секвенированием. Кроме генов, кодирующих соответствующие химерные антитела, ДНК плазмид содержит все необходимые регуляторные последовательности, FRT-сайт для гомологичной рекомбинации, а также селективный ген дигидрофолат редуктазы (плазмиды серии DHFR) или ген глутаминсинтетазы (плазмиды серии glul-L). ДНК всех плазмид была наработана в клетках E. coli и очищена для последующей трансфекции эукариотических клеток. 4. На основе клеточных линий CHO-S/FRT и CHO-DG44/FRT и сконструированных плазмид были созданы четыре клеточных линий, продуцирующие химерные антитела ch14D5а, ch1B1 и ch10C2 против различных эпитопов гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. Для этого на первом этапе клетки были трансфицированы соответствующей плазмидой, несущей ген одного из целевых антител, совместно с вспомогательной плазмидой pOG44, содержащей ген флиппазы. Клетки CHO-S/FRT трансфицировали плазмидами pCDNA5/FRT-glul-L_full_14D5 и pOG44, а также плазмидами pCDNA5/FRT-glul-L_full_1B1 и pOG44 и плазмидами pCDNA5/FRT-glul-L_full_10C2 и pOG44. Клетки CHO-DG44/FRT трансфицировали парой плазмид pCDNA5/FRT-DHFR-full_10C2 и pOG44. После отбора клонов и амплификации генов было отобраны стабильные клеточные линии, продуцирующие соответствующие целевые химерные антитела со следующей удельной продуктивностью: CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-Glul-full_14D5) – 8,0 пкг/клетку в день; CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-Glul-full_1B1) – 8,3 пкг/клетку в день; CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-Glul-full_10C2) – 7,0 пкг/клетку в день; DG44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full_10C2) – 4,2 пкг/клетку в день. 5. Химерные антитела ch14D5а, ch1B1 и ch10C2 были наработаны в культура клеток CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-Glul-full_14D5), CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-Glul-full_1B1) и CHO-S/FRT(pCDNA5\FRT-Glul-full_10C2). Затем они были очищены хроматографически с использованием сорбента “Protein A sepharose CL-4B”. Методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием оптического биосенсора ProteOn XPR 36 (Bio-Rad) определены параметры, характеризующие сродство химерных антител ch14D5а, ch1B1 и ch10C2 к рекомбинантному белку Е вируса клещевого энцефалита. Полученные значения констант скорости диссоциации и ассоциации kd и ka, а также равновесной константы диссоциации комплексов KD составили: ch14D5: kd = 4,7 × 10(-4) с(-1); ka = 1,2 × 10(5) М(-1) с(-1); KD = 4,1 × 10(-9) M; ch1B1: kd = 8,1 × 10(-4) с(-1); ka = 4,2 × 10(5) М(-1) с(-1); KD = 2,0 × 10(-9) M; ch10C2: kd = 3,6 × 10(-3) с(-1), ka = 3,1 × 10(4) М(-1) с(-1), KD = 1,2 × 10(-7) M. 6. Специфическую противовирусную активность химерных антител ch14D5а, ch1B1 и ch10C2 определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием набора реагентов «Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК и РРГ» (ФГУП «НПО «Микроген»). Титры полученных химерных антител ch14D5а, ch1B1 и ch10C2 в РТГА составили 1:640, 1:320 и 1:20, соответственно. 7. На основе двух кассетных плазмид pCDNA5/FRT-DHFR-full_8E и pCDNA5/FRT-glul-full_8E, созданных в 2016 г., сконструированы аналогичные плазмиды, в которых ген, кодирующий полноразмерное человеческое антитело fh8E против ортопоксвирусов был заменен на гены, кодирующие химерные антитела ch3G11 и ch5H5 (против бета-глюкана), ch7B8 и ch8G4 (против галактоманнана) и ch6С6 (против маннана): pCDNA5/FRT-DHFR-full-3G11; pCDNA5/FRT-DHFR-full-5H5; pCDNA5/FRT-DHFR-full-7B8; pCDNA5/FRT-DHFR-full-8G4; pCDNA5/FRT-DHFR-full-6C6; pCDNA5/FRT-glul-L_full-3G11; pCDNA5/FRT-glul-L_full-5H5; pCDNA5/FRT-glul-L_full-7B8; pCDNA5/FRT-glul-L_full-8G4; pCDNA5/FRT-glul-L_full-6C6. Правильность конструирования была подтверждена секвенированием. Кроме генов, кодирующих соответствующие химерные антитела, ДНК плазмид содержит все необходимые регуляторные последовательности, FRT-сайт для гомологичной рекомбинации, а также селективный ген дигидрофолатредуктазы (плазмиды серии DHFR) или ген глутаминсинтетазы (плазмиды серии glul-L). ДНК всех плазмид была наработана в клетках E. coli и очищена для последующей трансфекции эукариотических клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Для исследования протективных свойств полноразмерных антител человека fh1A и fh8E использовали мышей линии BALB/c, которых i.p. заражали вирусом эктромелии 50 LD50 и через сутки после заражения внутривенно вводили антитела fh1A и fh8E в дозировках 100 мкг/мышь и 10 мкг/мышь в 0.9% NaCl. Контрольной группе вводили аналогичный объем 0.9% NaCl. Было показано, что однократное введение этих антител не защищало мышей от заражения вирусом эктромелии (наблюдалась 100% смертность животных, как в контрольной группе, так и в экспериментальных группах). Однако, анализ средней продолжительности жизни (СПЖ) показал достоверное (P<0,05) увеличение СПЖ при введении зараженным животным 100 мкг антител fh1A или fh8E по сравнению с контрольной группой. Введение обоих антител в низкой дозировке не приводило к статистически значимому повышению СПЖ. Этот результат свидетельствует о недостаточной протективной активности полноразмерных антител человека fh1A и fh8E при однократном введении. Вместе с тем, известно, что ортопоксвирусы используют различные рецепторы для проникновения в клетку. Ранее было показано, что для эффективной защиты модельных животных от вируса осповакцины или вируса оспы коров, которые значительно менее вирулентны для мышей, необходимо использовать коктейль антител, направленных к нескольким иммуногенным белкам ортопоксвирусов, в частности, белкам, кодируемым открытыми рамками трансляции (ОРТ) B5R, H3L и A27L (по классификации вируса осповакцины). Сконструированные нами полноразмерные человеческие антитела fh1A и fh8E направлены к белку р35, кодируемому ОРТ H3L и могут быть полезны для такого коктейля. 2. На первом этапе перепроверили специфичность химерных антител ch14D5, ch1B1 и ch10C2 к доменам гликопротеина Е ВКЭ. Методом Вестерн-блот анализа с использованием набора рекомбинантных вариантов белка Е было показано, что антитело ch10C2 выявляет домены I + II белка Е ВКЭ, в то время как антитела ch14D5 и ch1B1 направлены к домену III гликопротеина Е ВКЭ. Затем методом Вестерн-блот анализа было показано, что антитела ch14D5 и ch1B1 связывают N-концевой фрагмент домена III. Затем, для более точного картирования эпитопов, выявляемых антителами ch14D5 и ch1B1, использовали метод фагового дисплея. С помощью комбинаторных пептидных библиотек PhD-12 и PhD-C7C (New England Biolabs, США) было показано, что эпитопы, узнаваемые вируснейтрализующими антителами ch14D5 и ch1B1, совпадают или существенно перекрываются, так как пептиды, отобранные по связыванию с обоими антителами, соответствовали трем сходным участкам домена III: aa 307–313, aa 333–338 и aa 341–348. Для исследования противовирусной активности химерных антител ch14D5, ch1B1 и ch10C2 в экспериментах in vivo, мышей (10 г) заражали i.p. суспензией ВКЭ. Через 1, 2 или 3 дня мышам i.m. однократно вводили исследуемое антитело в дозировках 100 мкг/мышь или 10 мкг/мышь или 0,9% NaCl (контроль). Были получены следующие результаты: - При заражении мышей ВКЭ в дозировке 316 ЛД50 и введении антител ch14D5, ch1B1 или ch10C2 через сутки, антитела ch14D5 и ch1B1 показали достаточно высокую эффективность, существенно превысившую эффективность коммерческого препарата сывороточного иммуноглобулина, введенного в тех же дозировках. Антитело ch10C2 в этих условиях протективную активность не проявило. - При заражении мышей ВКЭ в дозировке 3-5 ЛД50 и введении антител ch14D5, ch1B1 или ch10C2 через сутки, антитело ch10C2 показало слабую протективную активность и только в дозировке 100 мкг/мышь. Антитела ch14D5, ch1B1 обеспечили высокий процент защиты животных. - Антитело ch14D5 продемонстрировало высокую эффективность протекции мышей, зараженных не только Европейским субтипом ВКЭ, но и Сибирским и Дальневосточным субтипами, причем эффективность протекции не зависела от субтипа ВКЭ. - Антитело ch14D5 продемонстрировало способность защищать мышей и при терапевтическом применении, то есть при введении через 2 и 3 дня после заражения. Все полученные в экспериментах in vivo результаты свидетельствуют о высоком терапевтическом потенциале химерного антитела ch14D5. 3. Для исследований, способно ли антитело ch14D5 усиливать инфекцию, использовали ту же мышиную модель – мышей заражали i.p. ВКЭ и через 1 сутки (или через 2 или 3 дня) вводили препараты антител. На первом этапе подобрали суб-протективную дозу для антитела ch14D5 - 0.4-0.5 μg per mouse, при введении которой 100% зараженных мышей погибает. При этом, СПЖ групп мышей, получивших такие суб-протективные дозировки антитела ch14D5, статистически значимо не отличались от СПЖ мышей, которым вместо антитела ch14D5 вводили 0.9%, что показывает отсутствие усиления инфекции, опосредованного введением суб-протективных доз антитела ch14D5. Аналогичные эксперименты провели, вводя мышам через сутки после заражения исходные моноклональные антитела mAb14D5 и mAb10C2 и химерное антитело ch10C2. Кроме того, провели эксперименты с лечением мышей суб-протективной концентрацией антитела ch14D5 через два и три дня после заражения мышей ВКЭ. Суммированные результаты подтвердили, что СПЖ, наблюдаемая при введении суб-протективных доз как химерных антител ch14D5 и ch10C2, так и исходных моноклональных антител, даже несколько превышает СПЖ контрольных мышей, хотя это превышение статистически не значимо. Полученные данные доказывают отсутствие эффекта усиления инфекции, опосредованного введением как исходных моноклональных антител mAb10C2 и mAb14D5, так и созданных на их основе химерных антител ch14D5 и ch10C2. Более того, одновременное введение химерных антител ch14D5 и ch10C2, направленных к разным доменам белка Е ВКЭ, не повлияло на защитные свойства антитела ch14D5. 4. На основе клеточных линий DG44/FRT и сконструированных плазмид были созданы 5 клеточных линий, продуцирующие химерные антитела ch3G11, ch5H5, ch7B8, ch8G4 и ch6С6 против синтетических олигосахаридов (бета-глюкана, галактоманнана и маннана). Для этого на первом этапе клетки были трансфицированы соответствующей плазмидой, несущей ген одного из целевых антител, совместно с вспомогательной плазмидой pOG44, содержащей ген флиппазы. Клетки DG44/FRT трансфицировали парами плазмид pCDNA5\FRT-DHFR-full-3G11 и pOG44, pCDNA5\FRT-DHFR-full-5H5 и pOG44, pCDNA5\FRT-DHFR-full-7B8 и pOG44, pCDNA5\FRT-DHFR-full-8G4 и pOG44, а также pCDNA5\FRT-DHFR-full-6С6 и pOG44. После отбора клонов и амплификации генов было отобраны стабильные клеточные линии, продуцирующие соответствующие целевые химерные антитела со следующей удельной продуктивностью: DG44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full-3G11) – 8,5 пкг/клетку в день; DG44/FRT (pCDNA5\FRT-DHFR-full-5H5) – 8,1 пкг/клетку в день; DG44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full-7B8)– 7,6 пкг/клетку в день; DG44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full-8G4) – 0,1 пкг/клетку в день; DG44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full-6C6) – 6,0 пкг/клетку в день. 5. Химерные антитела ch3G11, ch5H5, ch7B8 и ch6C6 были наработаны в культуре клеток DG44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full-3G11), DG44/FRT (pCDNA5\FRT-DHFR-full-5H5), DG44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full-7B8) и DG44/FRT(pCDNA5\FRT-DHFR-full-6C6). Затем они были очищены хроматографически с использованием сорбента “Protein A sepharose CL-4B”. Методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием оптического биосенсора ProteOn XPR 36 (Bio-Rad) определены параметры, характеризующие сродство химерных антител ch3G11, ch5H5, ch7B8 и ch6C6 к синтетическим олигосахаридам бета-глюкану, галактоманнану и маннану. Полученные значения констант скорости диссоциации и ассоциации kd и ka, а также равновесной константы диссоциации комплексов KD составили: ch3G11: kd = 1.0 × 10(-4) с(-1); ka = 6.4 × 10(4) М(-1) с(-1); KD = 17±2 × 10(-9) M; ch5H5: kd = 2,5 × 10(-3) с(-1); ka = 2,3 × 10(5) М(-1) с(-1); KD = 6,4±0,5 × 10(-9) M; ch7B8: kd = 6,7 × 10(-4) с(-1), ka = 6,1 × 10(4) М(-1) с(-1), KD = 11±1 × 10(-9) M. Как и предпологалось, химерное антитело ch6C6, как и исходное моноклональное mAb6C6, оказалось низкоаффинными (KD > 1 µM). Аффинность полученных антител ch3G11 и ch5H5 и наработанные количества позволили провести запланированные эксперименты in vivo. 6. Антимикотическую активность химерных антител ch3G11 и ch5H5, направленных к синтетическому бета-глюкану, исследовали в мышиной модели системного кандидоза в 2-х вариантах, описанных ранее, – летальная и нелетальная модель (Clancy et al., 2009; Torosantucci et al., 2009). Результаты исследования в нелетальной модели показали, что при применении химерного антитела ch3G11 в дозировке 150 мкг/мышь наблюдалось существенное, статистически достоверное (p value < 0.001) уменьшение количества выросших колоний по сравнению с таковым в группе контрольных мышей. Уменьшение уровня C. albicans в почках мышей, которым вводили антитело ch5H5 в той же дозировке, было статистически не значимым. Результаты исследования в летальном варианте модели системного кандидоза показали, что оба химерных антитела обладали протективной активностью, причем антитело ch5H5 показало большую эффективность. Введение этого антитела в дозе 150 µg/mouse обеспечило 50% выживаемость мышей, зараженных летальной дозой C. albicans. При введении антитела ch3G11 в дозе 150 µg/mouse наблюдалась 75% смертность. При введении обоих антител дозе 15 µg/mouse, как и в контрольной группе, наблюдалась 100% смертность. Вместе с тем, в группах мышей, которым вводили антитела ch3G11 и ch5H5 в дозе 15 µg/mouse наблюдалось увеличение средней продолжительности жизни (17.5 ± 4.7 и 14.3 ± 6.1, соответственно, против 8.7 ± 5.0 в контрольной группе), хотя разница не была статистически значима.