Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проект направлен на идентификацию новых целевых генов ячменя (а также пшеницы), перспективных для последующей модификации, направленной на ускоренное создание генотипов с заранее заданными свойствами, и оптимизацию подходов для модификации ячменя путем геномного редактирования. В ходе первого года выполнения проекта получены следующие важные результаты: 1. Проведенный анализ литературы, позволил уточнить выбор двух генов-мишеней для геномного редактирования ячменя: ген Nud, мутация которого приводит к голозерности, и ген Vrs1, потеря функциональности которого приводит в многорядности колоса. Среди сибирских сортов ярового ячменя отобраны 10 сортов с учетом морфологических характеристик, а также хозяйственно ценных свойств, позволяющих им занимать большие посевные площади. Из них высокий регенерационный потенциал продемонстрировал пленчатый двурядный сорт Алей, который был выбран нами для дальнейшей работы по геномному редактированию. Проведенный анализ публикаций, посвященных применению методов геномного редактирования на однодольных растениях (Герасимова и др., 2017), позволил избрать стратегию модификации при помощи системы CRISPR/Cas. В качестве первого рабочего варианта был выбран вектор pBUN421, несущий элементы системы CRISPR/Cas под контролем промоторов, обладающих оптимальной активностью в клетках однодольных растений. У выбранного по результатам оценки каллусообразования и регенерации сорта Алей была определена структура генов Nud и Vrs1 путем секвенирования амплифицированных фрагментов геномной ДНК. Затем при помощи программы CRISPRdirect в пределах первого экзона гена Nud были подобраны уникальные сайты-мишени для системы CRISPR/Cas. Далее были созданы конструкции pBUN-NUD14 и pBUN-NUD50, несущие гены нРНК, нацеленных на сайты 14-36 и 50-72 кодирующей последовательности гена Nud соответственно. Правильность сборки конструкций подтверждена ПЦР со специфическими праймерами и секвенированием ПЦР-фрагментов. 2. Параллельно этой работе с целью дальнейшего выявления новых генов, контролирующих хозяйственно ценные признаки у сибирских сортов ярового ячменя, было осуществлено фенотипирование ок. 100 сортов и линий ячменя, высеянных в двух повторностях на опытном участке селекционно-генетического комплекса ИЦиГ СО РАН, и получены количественные данные по комплексу признаков, связанных с продуктивностью. Также осуществлен лабораторный скрининг проростков этой выборки сортов на засухоустойчивость. Результаты полевой и лабораторной оценки будут использованы в дальнейшем анализе ассоциаций между маркерами и признаками (планируемого после повторного фенотипирования и высокопроизводительного SNP-генотипирования в 2017 г.). 3. Параллельно при использовании генетических моделей проводились работы, нацеленные на выявление новых мишеней – генов, контролирующих полезные признаки, связанные с биохимическими характеристиками зерна злаков. По оксидантной активности экстрактов выделилась изогенная линия с черной меланинподобной окраской зерна (контролируемой геном Blp), достоверно превышавшая по этому показателю другие изогенные линии и сорта (в 1,7 – 2,4 раза). Путем анализа уникальной генетической модели пшеницы впервые показан статистически значимый эффект синтеза антоцианов в колеоптиле на радиорезистентность проростков пшеницы, полученных из зерна, облученного умеренной дозой - 50 Гр. При использовании генетических моделей растений и животных проведен эксперимент, нацеленный на изучение влияния ‘антоциановой’ диеты на когнитивные способности и ее нейропротекторное действие. Поведенческое фенотипирование показало, что интактные мыши из группы, получавшей зерно изогенной линии с высоким содержанием антоцианов, отличались повышенными показателями рабочей памяти по сравнению с животными, получавшими зерно без антоцианов. Таким образом, определенные гены, отвечающие за пигментацию зерна и проростков злаков, – являются привлекательными мишенями как для маркер-контролируемого отбора, так и направленной модификации методами геномного редактирования.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект направлен на идентификацию новых целевых генов ячменя (а также пшеницы), перспективных для последующей модификации, направленной на ускоренное создание генотипов с заранее заданными свойствами, и оптимизацию подходов для модификации ячменя путем геномного редактирования. Для постановки метода геномного редактирования с использованием системы CRISPR/Cas на отечественных яровых сортах ячменя были выбраны два гена-мишени: Nud, аллельное состояние которого определяет пленчатый/голозерный фенотип и Vrs1 (определяет двурядность/шестирядность). Для модельного сорта Golden Promise и сорта Алей (выбранного на основе оценки регенерационного потенциала сибирских сортов в культуре in vitro) созданы и апробированы конструкции для модификации гена Nud на основе двух экспрессионных систем (pBUN и pSH), из которых pSH показала себя более эффективной (выявлено от 60 до 100% мутагенной активности испытуемых конструкций по сравнению с таковой на уровне 5% в случае использования другой экспрессионной системы). Для тестирования мутагенной активности созданных конструкций в клетках ячменя была поставлена методика изоляции протопластов сортов Алей и Golden Promise и их генетической трансформации. Проведенный систематический обзор (Короткова и др., 2017) работ по использованию системы CRISPR/Cas для редактирования генов сельскохозяйственных растений показал тенденцию предпочтения модифицировать хорошо проверенные в генно-инженерных исследованиях модельные сорта, тогда как потенциальную практическую ценность имеет распространение метода на возделываемые сорта, востребованные АПК. В связи с этим успешная апробация в проекте метода на немодельном сорте (сибирском сорте Алей) является существенным практическим достижением. Для дальнейшего получения растений этого сорта, мутантных по сайтам 14-36 и 50-72 гена Nud, на основе успешно апробированных конструкций pSH-Nud14 и pSH-Nud50 созданы бинарные векторы p6i-Nud14 и p6i-Nud50a. Для модификации второго гена-мишени (Vrs1) использовался опыт, полученный с геном Nud. Подобраны целевые сайты в первом экзоне, получены 3 конструкции pSH-Vrs1_29, pSH-Vrs1_33, pSH-Vrs1_33а для дальнейшей трансформации, запланированной на третий год проекта. Постановка метода геномного редактирования выполняется на удобных для этой цели генах, определяющих контрастный фенотип. Однако при этом стратегически важен поиск новых генов-мишеней, сведения о которых могут использоваться для улучшения существующих сортов как с помощью геномного редактирования, так и методами маркер-ориентированной селекции. В связи с этим в проекте проводится полногеномный анализ ассоциаций (GWAS) в сибирской коллекции ярового ячменя. Исследованы более 15 характеристик, связанных с продуктивностью растений и устойчивостью к факторам биотического и абиотического стресса. Коллекция генотипирована с использованием SNP-чипа высокой плотности (50K barley Illumina iSelect SNP array), изучена структура популяции, проводится анализ ассоциации данных генотипирования и фенотипирования, полученных в 2017 г. По результатам уже завершенного анализа выявлены 3 участка в хромосомах 1Н, 2Н и 3Н, ассоциированные с устойчивостью к темно-бурой пятнистости (Bykova et al., 2018). Среди SNP, связанных с устойчивостью, выбраны локусы, на основе которых в дальнейшем целесообразно будет создать удобные для диагностики ДНК-маркеры. В рамках поиска и исследования потенциальных генов-мишеней для селекции и редактирования в проекте отдельное внимание уделяется генетическим механизмам контроля биохимических характеристик зерна злаков, влияющих на диетическую ценность зерна, антиоксидантную активность и другие полезные характеристики (Glagoleva et al., 2017, Gordeeva et al. 2018). На предыдущем этапе работе на основе оценки антиоксидантной активности экстрактов выделилась изогенная линия с черной меланинподобной окраской зерна (контролируемой геном Blp, нуклеотидная последовательность которого и функции до сих пор не определены). За отчетный период при использовании подхода RNA-seq изогенных линий ячменя, отличающихся по этому гену, выявлено 957 дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) и определены связанные с ними метаболические пути (в частности, пути биосинтеза (i) мономеров суберина, (ii) предшественников дитерпеновых фитоалексинов, (iii) кутина, (iv) кутикулярного воска, а также (v) фенилпропаноидный путь). На основе полученных данных высказаны предположения как о механизмах формирования меланин-подобной окраски, так и о механизмах плейотропного действия локуса Blp на уровень антиоксидантнов в зерне, устойчивость растений к болезням колоса и некоторым видам абиотического стресса (Glagoleva et al., 2017). Помимо расшифровки молекулярных механизмов формирования черной окраски зерновки ячменя пшеницы, были идентифицированы последовательностей регуляторных генов, контролирующих процесс синтеза антоцианов в алейроновом слое зерновки (гены HvMyc2, HvMpc2 и HvWD40, продукты которых являются транскрипционными факторами, формирующими единый комплекс, необходимый для активации структурных генов биосинтеза антоцианов в клетках алейрона). Локализация гена HvMyc2, специфически экспрессирующегося только в алейроне, совпала с внутрихромосомной локализацией кластера генов Blx, контролирующих голубую окраску зерна. В гене HvMyc2 выявлена мутация, приводящая к сдвигу рамки считывания и в итоге к нарушению синтеза антоцианов и потере окраски (Strygina et al., 2017). Разработанный на основе этих отличий CAPS-маркер может в дальнейшем применяться для маркер-ориентированной селекции сортов с повышенным содержанием в зерне антоцианов – биологически активных соединений широкого спектра действия. В проекте при использовании генетических моделей растений и животных проводятся эксперименты нацеленные на изучение влияния ‘антоциановой’ зерновой диеты на когнитивные способности, нейропротекторное действие и продолжительность жизни животных. На предыдущем этапе был показано, что интактные мыши из группы, получавшей зерно изогенной линии с высоким содержанием антоцианов, отличались повышенными показателями рабочей памяти по сравнению с животными, получавшими зерно без антоцианов, вместе с тем влияния антоциановой диеты в случае нейродегенеративных нарушений, вызванных введением амилоида-бета, не выявлено. За отчетный период исследованы морфологические и биохимические особенности образцов тканей, взятых от испытуемых ранее животных. Различий между группами животных, получавших зерно разных изогенных линий пшеницы, не выявлено, однако отмечены изменения, связанные с зерновой диетой в целом. Влияния антоциановой зерновой диеты на продолжительность жизни животных не отмечено. 1. Короткова А.М., Герасимова С.В., Шумный В.К., Хлесткина Е.К. Гены сельскохозяйственных растений, модифицированные с помощью системы CRISPR/Cas. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017;21(2):250-258. DOI 10.18699/VJ17.244 2. Bykova I.V., Lashina N.M., Efimov V.M., Afanasenko O.S., Khlestkina E.K. Identification of 50K Illumina-chip SNPs associated with resistance to spot blotch in barley. BMC Plant Biology. 2018. In press. DOI: 10.1186/s12870-017-1198-9 3. Glagoleva A.Y., Shmakov N.V., Shoeva O.Y., Vasiliev G.V., Shatskaya N.V., Börner A., Afonnikov D.A., Khlestkina E.K. Metabolic pathways and genes identified by RNA-seq analysis of barley near-isogenic lines differing by allelic state of the Black lemma and pericarp (Blp) gene. BMC Plant Biology. 17(Suppl 1): 182. doi: 10.1186/s12870-017-1124-1 4. Gordeeva E.I., Shoeva O.Yu., Yudina R.S., Kukoeva T.V., Khlestkina E.K. Effect of Seed Pre-sowing Gamma-irradiation Treatment in Bread Wheat Lines Differing by Anthocyanin Pigmentation. Cereal Res Commun. 2018. DOI: 10.1556/0806.45.2017.059. 5. Strygina K.V., Börner A., Khlestkina E.K. Identification and characterization of regulatory network components for anthocyanin synthesis in barley aleurone. BMC Plant Biology. 17(Suppl 1): 184. doi: 10.1186/s12870-017-1122-3

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проект направлен на идентификацию новых целевых генов злаков, перспективных для последующей модификации, направленной на ускоренное создание генотипов с заранее заданными свойствами, и оптимизацию подходов для модификации ячменя путем геномного редактирования. В результате постановки метода геномного редактирования с использованием системы CRISPR/Cas на модельном сорте и отечественных яровых сортах ячменя при использовании двух генов-мишеней (Nud, аллельное состояние которого определяет пленчатый/голозерный фенотип, и Vrs1, определяющего двурядность/шестирядность) получены следующие результаты: впервые осуществлена модификация генома методом CRISPR/Cas в протопластах ячменя; впервые проведена модификация генома немодельного сорта ячменя (при помощи РНК-направленной эндонуклеазы Cas9 внесены мутации в гены Nud и Vrs1 в протопластах ячменя сибирского сорта «Алей»); впервые при помощи геномного редактирования из пленчатого ячменя получен голозерный. Постановка метода геномного редактирования выполняется на удобных для этой цели генах, определяющих контрастный фенотип. Однако при этом стратегически важен поиск новых генов-мишеней, сведения о которых могут использоваться для улучшения существующих сортов как с помощью геномного редактирования, так и методами маркер-ориентированной селекции. В связи с этим в проекте проводился полногеномный анализ ассоциаций (GWAS) в сибирской коллекции ярового ячменя. В результате в дополнение к ранее выявленным в проекте геномным районам, значимо ассоциированным с устойчивостью к темно-бурой пятнистости, в 2018 году проведенный анализ позволил выявить значимую ассоциацию 25 геномных районов ячменя со следующими характеристиками: число продуктивных побегов (3 района в хромосомах 2H, 3H и 7H), плотность колоса (по одному району в хромосомах 1H и 2H и по два района в хромосомах 6H и 7H), длина остей (2 района в хромосоме 6H), вес зерна (3 района в хромосомах 2H, 3H, 4H), срок колошения (2 района в хромосомах 2H и 7H), устойчивость к корневой гнили (1 район в хромосоме 5H), устойчивость к сетчатой пятнистости (по одному району в хромосомах 1H и 6H, два района в хромосоме 2H и три района в хромосоме 3H) и стеблевой ржавчине (1 район в хромосоме 3H). Полученные результаты проведенного GWAS-анализа являются основой для дальнейшего выделения генов-кандидатов, контролирующих изученные признаки у сибирских сортов ячменя, и разработки диагностических ДНК-маркеров для ускоренного отбора растений с заранее заданными свойствами. В рамках поиска и исследования потенциальных генов-мишеней для селекции и редактирования в проекте отдельное внимание уделяется генетическим механизмам контроля биохимических характеристик зерна злаков, влияющих на диетическую ценность зерна, антиоксидантную активность и другие полезные характеристики. Ранее в проекте на основе оценки антиоксидантной активности экстрактов выделилась изогенная линия с черной меланинподобной окраской зерна (контролируемой геном Blp, нуклеотидная последовательность которого и функции до сих пор не определены). В 2018 году среди 40 генов, лежащих в районе локуса Blp, на основе оценки экспрессии были выявлены 11 кандидатных генов, причем явно выраженная дифференциальная экспрессия между образцами, несущими доминантный и рецессивный аллель Blp, наблюдалась для двух генов, один из которых кодирует пирин, второй – фосфатазу РАР27. Предсказание внутриклеточной локализации белковых продуктов выявленных в локусе Blp генов-кандидатов вместе с полученными данными об их экспрессии является основой для дальнейшего установления единственного гена из списка кандидатов, который определяет контрастный фенотип. Помимо расшифровки молекулярных механизмов формирования черной окраски зерновки ячменя, продолжено изучение регуляторных генов, активирующих синтез антоцианов в различных частях зерновки злаков. Впервые описаны гены семейства R2R3-Myb: HvMpc1-H2, HvMpc1-H3 и TaMpc1-A2. Тканевая специализация каждого из генов данного семейства, по всей видимости, является причиной поддержания нескольких копий одного и того же гена в геноме. Данные по различиям в аллельных вариантах выявленных генов могут использоваться для маркер-контролируемого отбора линий, в которых антоцианы будут накапливаться одновременно в разных тканях, что будет способствовать повышению общего содержания антоцианов в зерне. На примере пшеницы мы отработали оптимальную схему ускоренного создания гибридного материала для дальнейшего отбора и передачи в ГСИ сортов злаков с повышенным содержанием антоцианов в перикарпе зерна. Создание гибридного материала осуществляется за 5 поколений с использованием двухступенчатого маркер-контролируемого отбора. Целесообразность создания богатых антоцианами сортов злаков обусловлена устойчивостью данных биологически активных соединений к процессу обработки (выпечки) и вместе с тем и их профилактическим действием: в частности, за отчетный период проекта на модельных животных показано, что употребление антоцианов зерна может иметь профилактическое значение в отношении нейродегенеративных изменений, вызванных болезнью Паркинсона. Показано благотворное влияние зерновой диеты с высоким содержанием антоцианов на рабочую память и молекулярные процессы нейрорегенерации. Изучение поведенческих дефицитов в условиях естественного старения показало, что полифенольные соединения положительно влияют на среднюю продолжительность жизни и сохранение общего тонуса организма.