Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Основной целью Проекта является разработка комбинации геномных технологий, позволяющих получать трансгенных животных продуцентов востребованных белков человека. На первом этапе выполнения проекта проводились работы четырем основным направлениям. Направление 1. Одной из задач данного проекта является улучшение системы Cas9-опосредованной встройки трансгенов при помощи создания трансгенного животного, конститутивно экспрессирующего ген Cas9. Ранее нами была получена мышь CMV-Cas9, несущая ген Cas9 под конститутивным цитомегаловирусным промотором в геноме. Путем скрещивания полученного животного-основателя за отчетный период была получена линия гомозиготных трансенных животных CMV-Cas9. Мы провели качественный анализ экспрессии гена Cas9 в различных органах трансгенных животных методом ОТ-ПЦР и показали, что ген Cas9 экспрессируется во всех проанализированных органах, за исключением сердца. Кроме того, мы провели иммуногистохимическое окрашивание тканей яичника антителами против белка Cas9 и показали, что белок Cas9 присутствует в яйцеклетках трансгенных самок. Последний результат принципиально важен, поскольку показывает, что полученная нами линия CMV-Cas9 может быть использована для модификации генома животных путем инъекции необходимых конструкций в зиготу. Поскольку полученная линия CMV-Cas9 будет использована для получения на ее основе мышей несущих различные модификации генома, важно было показать, что интеграция самой конструкции CMV-Cas9 не сопровождается инсерционным мутагенезом каких-либо генов в геноме. Мы картировали место интеграции конструкции CMV-Cas9 в геноме мыши методом TAIL-PCR, и показали, что конструкция интегрировалась в одной копии в межгенный участок хромосомы 4. Направление 2. Одной из главных задач проекта является получение трансгенных мышей со встройкой гена человека hGM-CSF под промотор эндогенного альфа-S1-казеина мыши (Csn1s1) для изучения потенциала такого подхода в биотехнологии. Мы протестируем два варианта трансгенной интеграции – инсерция, то есть встройка трансгена в рамку считывания Csn1s1 непосредственно после старт-кодона, и замещение – замена всей кодирующей области Csn1s1 на трансген. Для получения указанных трансгенных животных была выбрана двух стадийная методика: на первом этапе получаются эмбриональные стволовые (ЭС) клетки с целевой модификацией генома, на втором этапе путем инъекции ЭС клеток в бластоцисту получаются химерные животные, которые служат основателями трансгенной линии мышей. За первый год выполнения проекта был реализован первый этап методики - получены линии ЭС клеток, несущие инсерцию hGM-CSF без удаления гена альфа-S1-казеина и полное замещение кодирующей части альфа-S1-казеина на hGM-CSF. Для получения трансгенных ЭС клеток мы применили систему CRISPR/Cas9. Также было показано, что полученные лини ЭС клеток имеют нормальный хромосомный состав, что очень важно, поскольку известно, что только ЭС клетки с нормальным кариотипом способны давать фертильных химерных животных. Направление 3. Одной из целей проекта является разработка системы активации промотора гена альфа-S1-казеина in vitro на основе белка dCas9 c активаторными доменами. На первом этапе для достижения поставленной цели мы сравнили две описанных системы для активации экспрессии генов dCas9-VP64-p65-Rta (dCas9-VPR) (Chavez et al., 2015) и dCas9-VP64 + MS2-p65-HSF1 (dCas9-MS2) в тестовой модели. В качестве тестовой модели были использованы первичные эмбриональные фибробласты, несущие в геноме ген EGFP под контролем промотора гена Oct4. СРАВНИМАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ! Было показано, что система dCas9-MS2 лучше подходит для заявленной цели, поскольку использует более воспроизводимую лентивирусную доставку конструкций кодирующих белок dCas9 c активаторными доменами в клетки. Направление 4. Одной из задач проекта является повышение эффективности Cas9-опосредованного трансгенеза с помощью присоединения к белку Cas9 доменов, стимулирующих гомологичную рекомбинацию. При выборе возможных «переключателей» механизма репарации с негомологичного соединения концов (NHEJ) на гомологичную рекомбинацию (HR) мы остановились на двух белках человека, которые положительно регулируют гомологичную рекомбинацию – CtIP и RNF169. Кодирующие части указанных белков были заклонированы в плазмиды, таким образом были получены конструкции, кодирующие белок Cas9 слитый с белками CtIP либо RNF169. Кроме того, были получены конструкции тестовой системы traffic light reporter (Chu et al., 2015), позволяющей количественно оценивать эффективность репарации разрывов, вносимых Cas9, по механизму гомологичной репарации. Таким образом, были созданы ключевые генетические конструкции для поиска путей увеличения эффективности Cas9-опосредованного трансгенеза с помощью присоединения к белку Cas9 доменов, стимулирующих гомологичную рекомбинацию.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Основная цель проекта разработка технологии создания высокоэффективных животных-биопродуцентов клинически значимых рекомбинантных белков человека. В качестве таких перспективных биопродуцентов предлагается использовать животных, продуцирующих рекомбинантные белки в молоко при лактации. Мы выделили несколько ключевых проблем в данной области, требующих оптимизации и проведения исследовательских работ. Поэтому работы по гранту ведутся параллельно по нескольким взаимосвязанным направлениям. Направление 1. Получение и характеристика линии трансгенных мышей, конститутивно экспрессирующих ген Cas9. Основной целью работ по данному направлению за отчетный период была оценка применимости полученной до начала выполнения Гранта, линии трансгенных мышей CMV-Cas9 для экспериментов по направленному редактированию генома in vivo. Проведенный анализ показал, что при получении трансгенной линии произошла мутация в кодирующей части гена Cas9, которая не приводит к нарушению транскрипции гена, так как мы наблюдали транскрипт Cas9 во многих органах мышей, но нарушает трансляцию белка. Таким образом мы делаем вывод, что полученная в качестве задела по проекту линия трансгенных мышей CMV-Cas9 не годится для проведения экспериментов по направленному редактированию генома in vivo. Поэтому для дальнейших экспериментов по редактированию генома на зиготах мы будем применять микроинъекции матричных РНК кодирующих Cas9. Направление 2. Цель работ по направлению получение трансгенных мышей со встройкой гена человека hGM-CSF под промотор эндогенного альфа-S1-казеина мыши (Csn1s1) для изучения потенциала такого подхода в биотехнологии. Данное направление одно из ключевых в реализуемом проекте так как позволяет оценить перспективность применения последних достижений в области редактирования генома для создания животных продуцирующих высокоактивные рекомбинантные белки в молоко при лактации. Предполагается, что эндогенные промоторы генов молочных белков могут обеспечить максимально точный контроль экспрессии рекомбинантного белка в молочной железе и избежать проблемы эктопической экспрессии трансгена. Основная задача работ по данному направлению за отчетный период получение трансгенных животных, несущих различные варианты интеграции трансгена в локус альфа-S1-казеина. Мы отработали протокол получения трансгенных ЭС клеток с высоким потенциалом без использования встроенного селективного маркера. Использование этих клеток позволяет получать химер с высокой эффективностью. На основе 6 различных трансгенных ЭС клонов с двумя типами трансгенной встройки получено более 100 химерных животных. Отобраны фертильные химерные самцы, которые передают генотип трансгенных ЭС клеток потомкам (germ line transmission). В дополнение к основной цели получены трансгенные линии мышей, которые несут мутации в гене казеина, приводящие к нарушениям в сигнальном пептиде белка альфа-S1-казеина или к нокауту гена. Направление 3. Цель работ по данному направлению разработка системы для in vitro детекции работоспособности конструкции после встройки трансгенов под промотор альфа-S1-казеина. Проведенная оценка эффективности активации генов с помощью систем на основе Cas9 (dCas9-VPR и dCas9-VP64 + MS2-p65-HSF1) показала, что эти системы не подходят для создания модели in vitro тестирования работоспособности генетических конструкции из-за крайне низкой эффективности активации. Направление 4. Целью работ по данному направлению является повышение эффективности трансгенеза. 1. Создана и протестирована система для определения пути репарации двуцепочечного разрыва, вызванного Cas9 (на основе существующего traffic-light reporter). 2. Протестированы химерные белки на основе Cas9 (SpCas9-CtIP и SpCas9-RNF169). В условиях несинхронизированной клеточной культуры эффективность работы протестированных белков не отличается значимо от немодифицированного варианта Cas9. 3. Для исследования механизмов интеграции трансгенов были получены 10 трансгенных эмбрионов со встройкой баркодированных трансгенов. Мы также определили копийность встройки с помощью droplet digital PCR. Основной же результат - подготовка библиотеки ПЦР-продуктов, которые содержат баркоды в районе слияний копий трансгенов для секвенирования на платформе Illumina. 4. Завершено исследование эффектов инсерционного мутагенеза от трансгена с hGM-CSF у мышей, полученных через пронуклеарную микроинъекцию. Показано, что трансген нарушил работу гена Cntn5, вызвав делецию и заблокировав синтез белка Cntn5 через включение своих экзонов в транскрипты Cntn5. SpCas9-RNF169. По результатам анализа опубликована статья (Smirnov et al., 2017).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основная цель проекта разработка технологии создания высокоэффективных животных-биопродуцентов клинически значимых рекомбинантных белков человека. В качестве таких перспективных биопродуцентов предлагается использовать животных, продуцирующих рекомбинантные белки в молоко при лактации. Мы выделили несколько ключевых проблем в данной области, требующих оптимизации и проведения исследовательских работ. Поэтому работы по гранту ведутся параллельно по нескольким направлениям. Задача1. Целью работ по данному направлению является оценка потенциала локуса альфа-S1-казеина (ген Csn1s1) для получения животных-продуцентов рекомбинантых белков С целью изучения потенциала локуса альфа-S1-казеина (ген Csn1s1) для встройки конструкций были созданы две трансгенные линии мышей: (1) встройка трансгена hGM-CSF без удаления кодирующей части гена Csn1s1 («INS-GM») и (2) полная замена кодирующей части Csn1s1 на hGM-CSF («REP-GM»). В этом году мы провели скрещивания гетерозиготных животных для получения гетерозиготных и гомозиготных самок в двух трансгенных линиях. Для линии INS-GM было получено ожидаемое расщепление по генотипам 1:2:1, тогда как в линии REP-GM наблюдался сильный дефицит гомозигот. Это может говорить о негативном влиянии проведенной модификации генома на жизнеспособность животных. Подчеркнем, что это неожиданный результат, так как по современным представлениям альфа-S1-казеин необходим только для выкармливания потомков, и его нокаут (путем сдвига рамки считывания) не сказывается на жизнеспособности носителей такой мутации. Далее, мы оценили секрецию белка hGM-CSF в молоке и крови трансгенных самок на 10 день лактации. Анализ методом ELISA показал, что в молоке гетерозиготных по трансгену мышей присутствует белок hGM-CSF. Концентрация hGM-CSF составила 2-5 мкг/мл для гетерозигот INS-GM и 100-500 мкг/мл для гетерозигот REP-GM. Мы не обнаружили белок hGM-CSF в крови самок INS-GM, но у самок REP-GM белок hGM-CSF в крови детектировался (1-3 мкг/мл). Попадание белка в кровоток может объясняться всасыванием из молочной железы или неспецифической экспрессией трансгена в других органах. Белок hGM-CSF выявляется в молоке трансгенных самок и при Вестерн блот анализе. Для регуляторных элементов молочных генов (Csn1s1, Csn2, WAP) характерна высокая тканеспецифичность, что и делает их привлекательными кандидатами для создания молочных биореакторов. Мы ожидали, что выбранный нами тип встройки не только обеспечит высокий уровень белка в молоке (см. линию REP-GM), но и гарантирует отсутствие эктопической экспрессии при лактации. К нашему удивлению, ОТ-ПЦР на мРНК трансгена hGM-CSF обнаружил высокую экспрессию трансгена почти во всех тканях для линии REP-GM. В линии INS-GM мРНК трансгена hGM-CSF локализовалась в молочной железе и мышцах. Таким образом, мы показали, что встройка трансгена hGM-CSF без удаления кодирующей части гена Csn1s1 позволяет добиться высокой продукции рекомбинантного белка в молоко, по этому показателю линия INS-GM сопоставима с полученными ранее в нашей лаборатории линиями мышей, у которых экспрессия hGM-CSF контролировалась лишь фрагментом промотора гена Csn1s1 (Burkov et al., 2013). Поэтому такой способ может быть рекомендован для создания животных-продуцентов фармакологически ценных белков. Полная замена кодирующей части Csn1s1 на hGM-CSF («REP-GM») приводит к значительно большей (на два порядка) продукции белка в молоко, однако, это сопровождается эктопической экспрессией трансгенной конструкции во многих органах, а также значительно снижает жизнеспособность животных в гомозиготном состоянии. Поэтому такой вариант нельзя рекомендовать для создания животных-продуцентов. На наш взгляд этот неожиданный результат требует дальнейшего изучения для установления причин эктопической активации конструкции. Задача 2. Целью работ по данному направлению является оценка влияния мутаций в сигнальном пептиде альфа-S1-казеина на продукцию белка в молоке. В ходе выполнения проекта мы обнаружили четырех животных, имеющих мутации в сигнальном пептиде белка альфа-S1-казеина. Для каждого из вариантов мутации были проведены скрещивания и отобраны гомозиготные самки. В качестве отрицательного контроля использовалась полученная нами линия, нокаутная по Csn1s1. К сожалению, из-за проблем с коммерческим набором для оценки концентрации белка Csn1s1 мы не смогли оценить влияние обнаруженных в ходе выполнения проекта мутаций в сигнальном пептиде белка альфа-S1-казеина на концентрацию альфа-S1-казеина в молоке. Задачи 3-4. Целью работ по данному направлению является повышение эффективности CRISPR/Cas9-опосредованного трансгенеза с помощью присоединения к белку Cas9 доменов, стимулирующих гомологичную рекомбинацию. Одной из задач, поставленных на 2018 год, стала синхронизация клеточной культуры Phoenix_TLR_№1. Мы подобрали оптимальные условия синхронизации с помощью обработки клеток обратимыми ингибиторы клеточной пролиферации афидиколин и нокодазол. Следующая задача – совместить протокол синхронизации с трансфекцией плазмид. Мы провели серию экспериментов, в которых трансфецировали клетки либо сразу после отмывки от ингибиторов, либо же трансфекция предшествовала отмывке на несколько часов. Стоит отметить, что и синхронизация, и трансфекция, представляют для клеток стресс, что серьезно сказывается на их жизнеспособности. Из-за очень узкого временного окна в котором нам необходимо подвергнуть клетки последовательно обоим стрессам клетки не успевают восстановиться и массово погибают. Во всех трестировавшихся вариантах совмещения трансфекции с обработкой ингибиторами клеточного цикла количество выживших клеток не позволило получить достоверных воспроизводимых результатов, поэтому все дальнейшие тесты мы проводили на несинхронизированных культурах. Мы показали, что белки CtIP, Kat5, RNF169, Rad52 слитые с Cas9 не оказывают значимого влияния на выбор пути репарации внесенного двуцепочечного разрыва ДНК в несинхронизированной культуре Phoenix_TLR_№1. Из протестированных белков: CtIP, Kat5, RNF169, Rad52, только сверхэкспрессия RNF169 позволяет значимо в два раза увеличить частоту репарации по пути гомологичной рекомбинации. Чтобы проверить достоверность выводов, полученных на нашей экспериментальной системе (клетки линии HEK293 (Phoenix)), мы провели дополнительный эксперимент, задачей которого стало сравнение эффективности получение таргетной встройки генетической конструкции в геном ЭСК мыши. Встройка фрагмента длиной 2Kb осуществлялась в третий экзон гена Csn1s1. Успешную интеграцию по механизму гомологичной рекомбинации детектировали с помощью ПЦР. Поскольку такой эксперимент трудо- и времязатратный, мы сравнивали только два варианта: Cas9 дикого типа и Cas9 слитый с CtIP. В одном из ранних экспериментов этот вариант на уровне тенденции повышал эффективность гомологичной рекомбинации. Однако проведенный анализ показал отсутствие отличий между белком Cas9-CtIP и немодифицированным белком Cas9: количество клонов с интеграцией трансгена было сравнимо (Таб. 2). Таким образом, мы в независимом эксперименте убедились, что оценки, получаемые с помощью репортерной системы TLR верны. Общий вывод работ по этому направлению – присоединения к белку Cas9 доменов, стимулирующих гомологичную рекомбинацию не позволяет значительно влиять на выбор пути репарации разрыва. Задача 5. Целью работ по данному направлению была оценка роли отдельных путей репарации двуцепочечных разрывов ДНК в формировании тандема конкатемерных копий при получении трансгенных животных методом пронуклеарной микроинъекции. Ключевым этапом создания трансгенных животных является интеграция генетической конструкции в геном. Хорошо известно, что интеграция осуществляется клеточными системами репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Ранние эмбрионы и зигота в том числе по ряду признаков сильно отличаются от всех остальных клеточных типов - например, по длительности клеточного цикла и особенностям организации генома. Однако, особенности процессов репарации ДНК в зиготах практически не описаны. Поэтому в рамках выполнения проекта мы поставили задачу охарактеризовать основные механизмы репарации ДНК, ответственные за процессинг инъецированных в зиготу молекул ДНК. В прошлом году мы создали библиотеку баркодированных генетических конструкций, с помощью которой получили 10 трансгенных животных. Использование ДНК баркодирования позволяет различать индивидуальные молекулы генетической конструкции, которые были инъецированы в пронуклеус зиготы, и потому позволяет пролить свет на молекулярные механизмы, отвечающие за образование тандема, состоящего из введенных молекул ДНК, а также на механизмы, отвечающие за интеграцию тандема в геном. В этом году с помощью секвенирования следующего поколения мы определили состав ДНК баркодов в каждом из трансгенных животных. Анализ результатов показал, что главную роль в процессинге введеных в зиготу молекул экзогенной ДНК играет гомологичная рекомбинация. На основе полученных данных предложена модель описывающая процессинг введенных в пронуклеус экзогенных молекул ДНК.