КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-14-00178

НазваниеПрименение ферментов для получения биологически активных нуклеозидов и нуклеиновых оснований

РуководительМихайлов Сергей Николаевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2016 - 2018

КонкурсКонкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словаферментативный синтез, нуклеозиды, лекарственные препараты, биологическая активность, нуклеозидфосфорилазы

Код ГРНТИ62.00.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В настоящее время в клинической практике используется ряд современных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов и обладающих широким спектром биологической активности, противоопухолевой (кладрибин, флударабин, пентостатин, неларабин, видаза, децитабин и др.), противовирусной (рибавирин, видарабин, зидовудин, ламивудин и др). Для получения практически важных нуклеозидов активно разрабатываются и применяются технологии, основанные на ферментативных реакциях трансгликозилирования - переноса углеводного остатка с одного гетероциклического основания на другое. Эти реакции катализируют нуклеозидфосфорилазы, которые осуществляют обратимый фосфоролиз рибонуклеозидов и 2′-дезоксирибонуклеозидов с образованием соответствующего гетероциклического основания и (2-дезокси)рибозо-1-фосфата. К нуклеозидфосфорилазам относятся тимидинфосфорилаза (ТФ) (КФ 2.4.2.4), уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) и пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФ) (КФ 2.4.2.1). Эти ферменты обнаружены почти у всех организмов, при этом отличия их первичной структуры сравнительно невелики. Равновесие реакций фосфоролиза сдвинуто в сторону образования нуклеозидов, причем в случае пуриновых более значительно. На этом и основана ферментативная реакция трансгликозилирования, в ходе которой происходит перенос углеводного остатка от пиримидинового нуклеозида (B-Nuc) на пуриновое гетероциклическое основание (B’). В зависимости от набора используемых исходных соединений и нуклеозидфосфорилаз в результате осуществления данного процесса происходит образование новых модифицированных нуклеозидов (B’-Nuc). Эта общая схема может быть распространена и легко адаптирована для получения практически важных нуклеозидов. Анализ литературных и собственных данных позволяет заключить, что ферментативные методы создания гликозидной связи могут конкурировать с химическими при получении 2'-дезоксирибонуклеозидов (кладрибин) и β-D-арабинофуранозилнуклеозидов (флударабин и неларабин). Несмотря на большое количество работ, посвященное этим ферментам, не определена роль функциональных групп нуклеозидов при формировании продуктивного фермент-субстратного комплекса. Практически отсутствуют данные о влиянии структуры нуклеозида и гетероциклического основания на положение равновесия реакции фосфоролиза, что важно для практического применение этих ферментов. Настоящий проект направлен на решение важной научно-практической задачи по использованию ферментов в синтезе биологически важных нуклеозидов. В рамках выполнения проекта планируется продолжить изучение субстратной специфичности и механизма действия рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз из различных источников, определить кинетические параметров и константы равновесия фосфоролиза природных нуклеозидов и их синтетических аналогов. Актуальными задачами являются оптимизация ферментативных методов создания N-гликозидной связи и расширение возможностей использования ферментов для получения нуклеозидов, нуклеиновых оснований и их производных. Будут определены оптимальные препаративные методы получения практически важных нуклеозидов, таких как кладрибин, флударабин и неларабин, что будет способствовать решению важной задачи по импортозамещению лекарственных препаратов.

Ожидаемые результаты
Представленный проект посвящен решению важной научно-практической задачи по использованию ферментов в синтезе биологически важных нуклеозидов . Полученные результаты позволят существенно расширить использование нуклеозидфосфорилаз для получения производных нуклеозидов и нуклеиновых оснований и оптимизировать технологию получения ряда субстанций лекарственных препаратов. Предлагаемые методы являются оригинальными и содержит патентоспособные решения. В ходе работы будут получены новые данные о субстратной специфичности и механизму действия нуклеозидфосфорилаз и определены возможности и ограничения ферментативных методов создания N-гликозидной связи в пуриновых 2'-дезоксирибо- и β-D-арабинонуклеозидах. Полученные данные будут представлять значение для развития этой области биохимии и биотехнологии. По результатам исследований будут опубликовано 8 статей в ведущих отечественных (Биоорганическая химия, Биохимия, Acta Naturae и др.) и международных журналах (European Journal of Medicinal Chemistry, Synthesis, Tetrahedron, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids и др.) и получен патент РФ. Полученные результаты будут представлены на Международных Конференциях, включая самую престижную в этой области International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В настоящее время в клинической практике используется около 100 лекарственных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов: половина противовирусных препаратов и четверть противоопухолевых препаратов относится к этой группе природных соединений. Существует два основных метода получения аналогов нуклеозидов. Первый основан на модификации природных соединений. Во втором сначала получают производные гетероциклических оснований или моносахаридные производные, а затем получают нуклеозиды. В этом случае ключевой стадией синтеза является образование N-гликозидной связи. К настоящему времени разработаны удобные и эффективные химические методы получения рибонуклеозидов. Стереоселективность реакции определяется 2’-О-ацильной группой, участвующей в образовании ацилоксониевого иона, продуктами этих реакций являются природные β-нуклеозиды, в которых гетероциклическое основание находится в транс-положении по отношению к 2’-О-ацильной группе. Когда эта группа отсутствует, как в случае 2-дезоксирибозы, образуется смесь α,β-изомеров, что существенно затрудняет выделение и очистку искомых соединений. При гликозилировании производных D-арабинозы образуются α-нуклеозиды, в которых гетероциклическое основание находится в транс-положении по отношению 2’-О-ацильной группе. Ферментативные методы образования N-гликозидной связи дополняют химические и в ряде случаев имеют несомненные преимущества, такие как регио- и стереоселективность. Для получения нуклеозидов используют нуклеозидфосфорилазы (НФ): ферменты, катализирующие обратимый фосфоролиз нуклеозидов с образованием α-D-(2-дезокси)рибозо-1 фосфата и гетероциклического основания. Равновесие этих реакций сдвинуто в сторону образования нуклеозидов, причем в случае пуриновых более значительно. На этом и основана ферментативная реакция трансгликозилирования, в ходе которой происходит перенос углеводного остатка от пиримидинового нуклеозида (Nuc1) на пуриновое гетероциклическое основание (Base2) с образованием пуринового нуклеозида (Nuc2) (схема 1). Nuc1 + Base2 + pi ↔ Sug-p + Base1 + Base2 ↔ Nuc2 + Base1 + pi Схема 1. Ферментативная реакция трансгликозилирования, где Nuc1 и Nuc2 пиримидиновый и пуриновый нуклеозид, Base1 и Base2 соответственно пиримидиновое и пуриновое гетероциклическое основание; pi – неорганический фосфат, а Sug-p α-D-(дезокси)рибозо-1 фосфат. В зависимости от набора используемых исходных соединений и нуклеозидфосфорилаз в результате осуществления данного процесса происходит образование новых модифицированных нуклеозидов (B’-Nuc). Для расширения возможностей ферментативного синтеза нуклеозидов необходим поиск новых субстратов (источников углеводных компонент) и оптимизация синтеза уже известных нуклеозидов. Важной частью данного проекта является изучение субстратной специфичности и механизма действия нуклеозидфосфорилаз из различных источников. Эти данные необходимы для выбора ферментов в реакции трансгликозилирования. Нуклеозидфосфорилазы играют ключевую роль в метаболизме нуклеозидов. Наиболее специфичным ферментом является тимидинфосфорилаза (ТФ) (EC 2.4.2.4), субстратами которой являются тимидин и 2'-дезоксиуридин. Помимо этих нуклеозидов, уридинфосфорилаза (УФ) (EC 2.4.2.3) осуществляет фосфоролиз и уридина. Наименее специфичны бактериальные пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) (EC 2.4.2.1), субстратами которых являются пуриновые нуклеозиды как рибо-, так и 2ꞌ-дезоксирибо-ряда. УФ и ПНФ также используют в качестве субстратов 1-(β-D-арабинофуранозил)пиримидины или -пурины. До начала наших исследований субстратная специфичность этих ферментов была исследована недостаточно полно. Это связано с отсутствием удобных методов определения кинетических параметров фосфоролиза нуклеозидов. В ходе выполнения данного проекта в 2016 году получены следующие основные результаты. Для изучения субстратной специфичности УФ и ПНФ E.coli была использована большая библиотека модифицированных нуклеозидов, синтезированная в ИМБ РАН. Были измерены кинетические параметры и константы равновесия реакции ферментативного фосфоролиза около 60 производных уридина и аденозина, модифицированных в различных положениях гетероциклического основания и 2'-, 3'- и 5'-положениях рибозного остатка. Подтверждена важная роль 3'- и 5'-гидроксильных групп уридина для проявления субстратных свойств УФ E.coli и определена необычная конформация субстрата в активном центре фермента, в которой карбонильная группа во 2-ом положении находится вблизи 2'-протона углеводного остатка. Все изученные константы равновесия реакции фосфоролиза лежат в диапазоне 0,12-0,17 и мало зависят от структуры субстрата. Выявлены функциональные группы субстрата, ответственные за связывание с ПНФ E.coli. Определено сходство архитектуры активных центров УФ и ПНФ при связывании субстрата в напряженной конформации, в которой происходит наталкивание гетероциклического основания на 2ꞌ протон углеводного остатка. Все изученные константы равновесия ферментативной реакции фосфоролиза лежат в диапазоне 0,005-0,02 и мало зависят от структуры субстрата за исключением N1-метилпроизводных аденозина. В данном случае реакция фосфоролиза, по сравнению с ТФ и УФ, существенно сильнее сдвинута (в 17-20 раз) в сторону образования нуклеозида. Сравнение эффективностей фосфоролиза (kcat/Km) различными НФ E.coli позволило сделать следующие выводы. В случае получения пуриновых 2'-дезоксинуклеозидов исходя из пиримидиновых целесообразнее использовать пару ферментов ТФ и ПНФ. Только один фермент ПНФ может быть применен для синтеза производных уридина. Фосфоролиз рибонуклеозидов УФ проходит более эффективно, чем для 2'-дезоксинуклеозидов. Обратная ситуация наблюдается в случае ПНФ. Разработаны препаративные методы получения гидройодидов 7-метилгуанозина (7Me-Guo) и 7-метил-2-дезоксигуанозина (7Me-dGuo) и изучена их стабильность. Соединения могут храниться при -20°С в течение 3 месяцев без заметного разложения. В отличие от природных нуклеозидов, 7Me-dGuo необратимо подвергается фосфоролизу с образованием 7-метилгуанина, что позволяет использовать его для получения модифицированных 2'-дезоксинуклеозидов как пуринового, так и пиримидинового ряда. Мы впервые использовали данный нуклеозид в качестве донора α-D-дезокcирибозо-1 фосфата в реакции транс-гликозилирования с участием ПНФ и ТФ. По данному методу были получены 5-фтор-2’-дезоксиуридин, 5-этил-2’-дезоксиуридин, 5-изопропил-2’-дезоксиуридин и 2-хлор-6-аминопурин-2’-дезоксирибозид (кладрибин) с высокими выходами (80-82%). 7-Метилгуанозин был использован нами для получения ряда пиримидиновых рибонуклеозидов (5-фторуридин, 5-этилуридин и риботимидин) с выходами 80-81%. Предложен эффективный метод получения N6-модифицированных аденинов. В этом случае в качестве исходных соединений используются природные нуклеозиды, стоимость которых, как правило, существенно ниже стоимости гетероциклических оснований. В предложенной стратегии синтеза рибозный остаток выполняет функцию защитной группы. Ключевой стадией синтеза является гидролиз N-гликозидной связи ПНФ и солей мышьяковой кислоты, который протекает необратимо с образованием с высоким выходом целевых N6-замещенных оснований и неустойчивого α-D-рибозо-1-арсената, гидролизующегося нацело до рибозы и арсената в условиях реакции. В отчетные показатели 2016 входят ТРИ СТАТЬИ, опубликованные в журналах с высоким импакт-фактором. По данным WOS журнал «Current Topics in Medicinal Chemistry» в 2014 году входил в первый квартиль журналов в области медицинской химии, а в 2015 году - во второй, что свидетельствует о международном признании проводимых исследований. Публикации: 1. M. S. Drenichev, V. E. Oslovsky, S. N. Mikhailov. Cytokinin Nucleosides - Natural Compounds with a Unique Spectrum of Biological Activities. Current Topics in Medicinal Chemistry, 16, No 23 2562 – 2576 (2016). DOI: DOI: 10.2174/1568026616666160414123717. 2. S. N. Mikhailov, L.Scotti, R.K. Singla, M.T. Scotti. Perspectives in Medicinal Chemistry. Current Topics in Medicinal Chemistry, 16, No. 25 2725-2726 (2016). DOI: 10.2174/156802661625160816180839. 3. C.S. Alexeev, G.G.Sivets, T. N. Safonova, S.N. Mikhailov. Substrate specificity of E. coli uridine phosphorylase. Further evidences of high-syn conformation of the substrate in uridine phosphorolysis. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 35, Published online: 15 Nov 2016. DOI:10.1080/15257770.2016.1223306).

 

Публикации

1. Алексеев К.С., Поляков К.М., Михайлов С.Н. Substrate specificity of E. coli uridine phosphorylase. Evidences of high-syn conformation of the substrate XXII International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. Abstract book, P. 274-277 (год публикации - 2016).

2. Алексеев К.С., Сивец Г.Г., Сафонова Т.Н., Михайлов С.Н. Substrate Specificity of E. Coli Uridine Phosphorylase. Further Evidences of High-syn Conformation of the Substrate in Uridine Phosphorolysis Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, - (год публикации - 2016).

3. Дреничев М.С., Ословский В.Е., Михайлов С.Н. Cytokinin Nucleosides - Natural Compounds with a Unique Spectrum of Biological Activities Current Topics in Medicinal Chemistry, Vol. 16, No. 23, P. 2562-2576 (год публикации - 2016).

4. Михайлов С.Н. Применение нуклеозидфосфорилаз для получения практически важных нуклеозидов ACTA NATURAE, Спецвыпуск, Том 2, с. 47 (год публикации - 2016).

5. Михайлов С.Н., Скотти Л., Сингла Р.К., Скотти М.Т. Perspectives in Medicinal Chemistry Current Topics in Medicinal Chemistry, vol. 16, No. 25, p. 2725-2726 (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В настоящее время в клинической практике используется около 100 лекарственных препаратов на основе нуклеозидов: половина противовирусных препаратов и четверть противоопухолевых препаратов относится к этой группе природных соединений. Существует два основных метода получения аналогов нуклеозидов. Первый основан на модификации природных соединений. Во втором сначала получают производные гетероциклических оснований или моносахаридные производные, а затем получают нуклеозиды. В этом случае ключевой стадией синтеза является образование N-гликозидной связи. К настоящему времени разработаны удобные и эффективные химические методы получения рибонуклеозидов, в то же время выходы 2’-дезоксирибонуклеозидов существенно ниже. Ферментативные методы образования N-гликозидной связи дополняют химические и в ряде случаев имеют несомненные преимущества, такие как регио- и стереоселективность. При трансгликозилировании происходит перенос углеводного остатка от одного нуклеозида (rB1) на другое нуклеиновое основание (B2) с образованием нового нуклеозида (rB2). Первая стадия – фосфоролиз исходного нуклеозида (rB1) с образованием α-D-(2-дезокси)рибозо-1 фосфата (rP) и основания B1 (rB1 + P ↔ rP + B1), вторая - синтез нового нуклеозида из основания B2 и rP (B2 + rP ↔ P + rB2). В зависимости от набора используемых исходных соединений и нуклеозидфосфорилаз можно получать новые модифицированные нуклеозиды (rB2). Реакция трансгликозилирования широко используется для получения практически важных нуклозидов. Теоретический анализ этой шестикомпонентной реакции до настоящего времени не был проведен, а влияние концентраций исходных соединений (rB1, B2 и P) на выход нового нуклеозида rB2 определялась методом проб и ошибок. Из анализа реакции трансгликозилирования можно сделать два важных вывода: первое, для обратимых реакций максимальный выход продуктов наблюдается при достижении равновесного состояния и второе, результат суммарного процесса определяется только константами фосфоролиза при прочих равных условиях. Т.е., результат реакции зависит только от разницы свободных энергий начальных и конечных соединений. Фермент играет роль катализатора, и это дает возможность на основании знания констант фосфоролиза и исходных концентраций реагентов рассчитать равновесные концентрации всех 6 компонентов. Иными словами, реализация этой концепции перспективна для предсказания a priori влияния концентрационных факторов на выход продуктов. Мы показали, что при заданных константах фосфоролиза и исходных концентрациях реагирующих веществ равновесные концентрации продуктов (rB2 и B1) находятся решением системы двух нелинейных уравнений с двумя неизвестными. Для автоматизации расчетов была разработана специальная программа. Равновесные концентрации остальных компонентов рассчитываются на основании простых уравнений материального баланса. Разработанный нами подход является количественной моделью процесса трансгликозилирования. Он является важным инструментом для исследования влияния начальных условий на результат трансгликозилирования. На основании проведенных расчетов были сделаны следующие важные выводы. Выход нового нуклеозида rB2 тем выше, чем больше соотношение констант фосфоролиза исходного rB1 и конечного rB2 нуклеозидов. Увеличение концентрации фосфата приводит к уменьшению выхода нового нуклеозида rB2. Одновременное увеличение концентраций исходных соединений при постоянной концентрации фосфата приводит к увеличению выхода нуклеозида rB2 и позволяет приблизиться к предельному или «идеальному» значению при данном соотношении исходных соединений. Повышение концентрации одного из исходных веществ (нуклеозида или нуклеинового основания) при прочих равных условиях приводит к увеличению выхода rB2. Целесообразно использовать избыток наиболее доступного компонента (нуклеозида или нуклеинового основания). Выход rB2 не зависит от разбавления реакционной смеси. В случае ограниченной растворимости компонентов реакции это дает возможность работать в разбавленных растворах без потери в выходе целевого продукта и избежать ингибирования ферментов при высоких концентрациях веществ. Все выводы были подтверждены экспериментальными данными на модельной фосфоролитической реакции Urd + Ade ↔ Ado + Ura. Разработанная модель позволяет также сделать важные выводы о доноре гликозидного остатка. Использование уридина в качестве донора рибозы эффективно для синтеза пуриновых оснований, для которых соотношение констант фосфоролиза исходного и конечного нуклеозидов приближается к 20, и выход продукта может достигать 80% при минимальной концентрации неорганического фосфата. Для синтеза пиримидиновых нуклеозидов (соотношение констант около 1) необходимо использовать значительный избыток одного из исходных веществ или альтернативный донор рибозы. Таким донором может быть 7-метилгуанозин, для которого предполагается высокая константа фосфоролиза (>40). С его использованием возможен синтез пиримидиновых нуклеозидов с выходом > 80% при соотношении исходных соединений 1:1. По материалам работы была подготовлена статья «Forecast of outcome in phosphorolytic transglycosylation». В 2017 году были продолжены работы по использованию 7-метилгуанозина (7Me-Guo) и 7-метил-2-дезоксигуанозина (7Me-dGuo) в реакции трансгликозилирования. Мы впервые использовали данный нуклеозид в качестве донора α-D-дезокcирибозы в реакции трансгликозилирования с участием ПНФ и ТФ. По данному методу был получен ряд практически важных нуклеозидов: 5-фтор-2’-дезоксиуридин, 5-этил-2’-дезоксиуридин и 2-хлор-6-аминопурин-2’-дезоксирибозид (кладрибин) с высокими выходами (70-82%). По материалам этой работы подана заявка на патент РФ и опубликована статья в престижном журнале Advanced Synthesis & Catalysis. Важной частью данного проекта является изучение субстратной специфичности и механизма действия НФ из различных источников. Эти данные, помимо фундаментального интереса, важны для выбора ферментов в реакции трансгликозилирования. НФ играют ключевую роль в метаболизме нуклеозидов. Наиболее специфичным ферментом является тимидинфосфорилаза (ТФ) (EC 2.4.2.4), субстратами которой являются тимидин и 2'-дезоксиуридин. Помимо этих нуклеозидов, уридинфосфорилаза (УФ) (EC 2.4.2.3) осуществляет фосфоролиз и уридина. Наименее специфичны бактериальные пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) (EC 2.4.2.1), субстратами которых являются пуриновые нуклеозиды как рибо-, так и 2ꞌ-дезоксирибо-ряда. В недавних работах сообщалось, что этот фермент катализирует фосфоролиз и пиримидиновых нуклеозидов. Совместно с Р.С. Есиповым (к.х.н., с.н.с. ИБХ РАН) мы показали, что эта активность не связана с ПНФ E.coli, поскольку тщательно очищенный фермент не катализирует фосфоролиз уридина, 2’-дезоксиуридина, 5-метилуридина, тимидина и цитидина. Была изучена субстратная специфичность родственного фермента, ПНФ Enterobacter cloacae. Данный фермент является представителем группы трехсубъединичных пуриннуклеозидфосфорилаз NP-II (M. J. Pugmire, S. E. Ealick. Biochemical Journal, 361, 1-25 (2002). Было показано, что этот фермент проявляет высокую активность в отношении инозина, а также катализирует фосфоролиз уридина и тимидина. Ранее мы разработали удобный и эффективный ферментативный метод получения N6-замещенных аденинов, исходя из соответствующих N6-аденозинов. Метод заключается в ферментативном арсенолизе пуриновых нуклеозидов в присутствии ПНФ и солей мышьяковой кислоты. Образующийся в ходе реакции α-D-рибозо-1-арсенат, в отличие от α-D-рибозо-1-фосфата, быстро гидролизуется до D-рибозы и арсената, что приводит к нуклеиновым основаниям с высоким выходом . Этот метод был распространен для синтеза О6-замещенных гипоксантинов. Ферментативный арсенолиз O-6-бензилинозина и O-6-(2-фенилэтил)инозина в присутствии ПНФ и Na2HAsO4×7H2O протекает необратимо с образованием целевых О6-замещенных оснований с количественными выходами (по данным ВЭЖХ). По мере протекания реакции конечный продукт выпадает из реакционной смеси в виде кристаллического осадка. Последующая фильтрация и промывание водой дает О6-бензилгипоксантин и O-6-(2-фенилэтил)гипоксантин с высокими выходами (85-90%). По материалам работы подготовлена статья «Chemoenzymatic Synthesis of Cytokinins from Nucleosides: Ribose as a Blocking Group». В этой работе для получения цитокининовых производных в качестве исходных были использованы N6- и О6-замещенные нуклеозиды, рибозный остаток в которых выполняет функцию защитной группы, удаляемой ферментативным арсенолизом. Для анализа следов токсичного арсената был разработан метод на основе HPLC-HRMS, позволяющий определять до 10 нмоль AsO43-. В 2017 году подготовлена к печати глава по синтезу этой группы соединений «Synthesis of Cytokinin Nucleosides», которая принята к печати и будет опубликована в продолжающемся издании Current Protocols in Nucleic Acids Chemistry. Полученные в данной работе производные N6-бензиладенина были использованы для изучения цитокининовых рецепторов в растениях. Была подготовлена статья «Cytokinin activity of N6-benzyladenine derivatives assayed by interaction with the receptors in planta, in vitro, and in silico» в журнал Phytochemistry. В 2016-2017 годах опубликованы ТРИ СТАТЬИ в журналах с высоким импакт-фактором. По данным http://www.scimagojr.com журнал «Current Topics in Medicinal Chemistry» в 2014 году входил в первый квартиль журналов в области «Drug design», а в 2015-2016 года - во второй квартиль. Журнал «Advanced Synthesis & Catalysis» входит в первый квартиль журналов в области «Catalysis» и «Organic chemistry». Полученные результаты также были доложены на международных конференциях, что свидетельствует о международном признании проводимых исследований. Публикации 2016-2017 года: 1. M. S. Drenichev, V. E. Oslovsky, S. N. Mikhailov. Cytokinin Nucleosides - Natural Compounds with a Unique Spectrum of Biological Activities. Current Topics in Medicinal Chemistry, 16, No 23 2562 – 2576 (2016). DOI: DOI: 10.2174/1568026616666160414123717. 2. S. N. Mikhailov, L.Scotti, R.K. Singla, M.T. Scotti. Perspectives in Medicinal Chemistry. Current Topics in Medicinal Chemistry, 16, No. 25 2725-2726 (2016). DOI: 10.2174/156802661625160816180839. 3.C.S. Alexeev, G.G.Sivets, T. N. Safonova, S.N. Mikhailov. Substrate specificity of E. coli uridine phosphorylase. Further evidences of high-syn conformation of the substrate in uridine phosphorolysis. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 36, № 2, 107-121 (2017). DOI: 10.1080/15257770.2016.1223306. 4.M.S. Drenichev, C.S. Alexeev, N.N. Kurochkin, S.N. Mikhailov. Use of nucleoside phosphorylases for the preparation of 2′-deoxynucleosides. Advanced Synthesis & Catalysis DOI 10.1002/adsc.201701005. 5. M.S. Drenichev, V.E. Oslovsky, V.I. Tararov, S.N. Mikhailov. Synthesis of Cytokinin Nucleosides. Current Protocol in Nucleic Acids Chemistry, Supplement 72, Chapter 14, Unit 15. Принято к печати без исправлений, в ближайшее время ожидается правка. 6. К.С.Алексеев, М.С.Дреничев, С.Н.Михайлов. Способ применения нуклеозидфосфорилаз для получения 2′-дезоксинуклеозидов. Заявка на патент РФ №2017119092, дата подачи 1.06.2017. 7.Vladimir E. Oslovsky, Pavel N. Solyev, Konstantin M. Polyakov, Cyril S. Alexeev, Sergey N. Mikhailov. Chemoenzymatic Synthesis of Cytokinins from Nucleosides: Ribose as a Blocking Group. Catalysts. Послано в печать. На исправлении после рецензирования. 8. Ekaterina M Savelieva, Vladimir E Oslovsky; Dmitry S Karlov; Nikolay N Kurochkin; Irina A Getman, Sergey N Lomin, Georgy V Sidorov, Sergey N Mikhailov, Dmitry I Osolodkin, Georgy A. Romanov. Cytokinin activity of N6-benzyladenine derivatives assayed by interaction with the receptors in planta, in vitro, and in silico. Phytochemistry. Послано в печать 9. Cyrill S. Alexeev, Irina V. Kulikova, Sergei Gavryushov, Vitali I. Tararov, Sergey N. Mikhailov. Forecast of outcome in phosphorolytic transglycosylation. Green Chemistry Подготовлена к печати. Всего за 2016-2017 годы опубликовано 5 статей в международных рецензируемых журналах, подана заявка на патент РФ и 3 статьи подготовлено к печати.

 

Публикации

1. Алексеев Кирилл Сергеевич, Дреничев Михаил Сергеевич, Михайлов Сергей Николаевич Способ применения нуклеозидфосфорилаз для получения 2′-дезоксинуклеозидов -, 2017119092 (год публикации - ).

2. Дреничев М.С., Алексеев К.С., Курочкин Н.Н., Михайлов С.Н. Use of Nucleoside Phosphorylases for the Preparation of Purine and Pyrimidine 2′-Deoxynucleosides Advanced Synthesis & Catalysis, - (год публикации - 2017).

3. Дреничев М.С., Ословский В.Е., Тараров В.И., Михайлов С.Н. Synthesis of Cytokinin Nucleosides Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, CPNC Supp. 71: Unit 14.15 (год публикации - 2017).

4. Михайлов С.Н. APPLICATION OF ENZYMES FOR THE PREPARATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE NUCLEOSIDES 8th INTERNATIONAL CONFERENCE “BIOMATERIALS AND NANOBIOMATERIALS: Recent Advances Safety-Toxicology And Ecology Issues”, 07-14 MAY, 2017, AGAPI BEACH, HERAKLION, CRETE - GREECE, Abstract book, p. 9-10 (год публикации - 2017).

5. Михайлов С.Н., Ословский В.Е., Дреничев М.С., Алексеев К.С. Synthesis of purines from nucleosides: ribose as a blocking group. Book of Abstracts, XVllth Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components, Cesky Krumlov, Czech Republic, June 4 - 9, 2017, Book of Abstracts, p. 171 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Практически важным результатом работы в 2018 году является разработка ферментативного синтеза α-D-рибозо-1-фосфата и α-D-2-дезоксирибозо-1-фосфата. В качестве субстратов для ПНФ E.coli были выбраны 7-метил-2′-дезоксигуанозин и 7-метилгуанозин, в этом случае фосфоролиз протекает необратимо. После кристаллизации α-D-рибозо-1-фосфат и α-D-2-дезоксирибозо-1-фосфат были получены с высокими выходами (74-96%), что существенно выше, чем в ранее опубликованных работах по ферментативному синтезу этих соединений. Несомненными достоинствами данного метода являются: использование легко доступных солей 7-метилгуанозина и 7-метил-2′-дезоксигуанозина, стереоспецифичность ферментативной реакции, полнота превращения исходных соединений (7-метилгуанозина и 7-метил-2′-дезоксигуанозин подвергаются фосфоролизу необратимо) и высокий выход целевых продуктов. Полученные результаты были оформлены в качестве заявки на патент РФ и по этим материалам готовится статья. Была изучена субстратная специфичность ряда термофильных ферментов: уридинфосфорилазы из штамма MR-1 Shewanella oneidensis (фермент предоставлен сотрудником Института биохимии имени А.Н. Баха РАН д.б.н. проф. В.П. Вейко), пиримидиннуклеозидфосфорилазы Thermus thermophillus (фермент предоставлен сотрудником Института микробиологии НАН Беларуси к.б.н С.В.Квачем) и пуриннуклеозидфосфорилазы Thermus thermophillus II (фермент предоставлен сотрудником Института биоорганической химии к.х.н Р.С.Есиповым) в отношении природных нуклеозидов и их производных и проведено их сравнение с бактериальными ферментами из E. Coli. Разработан удобный и эффектиный метод получения кладрибина исходя из 7-метил-2′-дезоксигуанозина как донора 2′-дезоксирибозы. для синтеза этого важного препарата также был использован α-D-2-дезоксирибозо-1-фосфат. По сравнению с реакцией трансгликозилирования эти методы имеют существенные преимущества. Определены оптимальные условия проведения реакции (пониженная температура проведения ферментативной реакции и рН реакционной среды) и подобраны соотношение реагентов, что позволило получить с 70% выходом кладрибин высокой степени чистоты. Ряд биологически активных пуриновых нуклеозидов (видарабин, флударабин и др.) являются производными D-арабинофуранозы и их химический синтез является достаточно сложным. Использование ферментов для их получения помогло бы решить эту важную задачу. Ранее нами при изучении субстратной специфичности ПНФ E.coli и УФ E.coli было показано, что эффективность (Kcat/KM) фосфоролиза и синтеза арабинопроизводных примерно на три порядка меньше по сравнению с фосфоролизом и синтезом природных рибонуклеозидов. Поэтому для получения арабинопроизводных приходится значительно увеличивать избытки оснований или исходных нуклеозидов, а также концентрацию ферментов. Попытка использования ПНФ T. Thermophillus II не привела к существенному ускорению реакции трансгликозилирования. Обнаружено, что 2,2’-O-ангидроарабинофуранозилурацил эффективно ингибирует ПНФ и УФ в микромолярных концентрациях, что подтверждает сходную архитектуру активных центров этих ферментов. Изучены субстратные и ингибиторные свойства нескольких L-аналогов природных нуклеозидов. L-Уридин и L-N6-бензиладенозин были синтезированы исходя из L-рибозы, которую превращали в 1-О-ацетил-2,3,5-три-О-бензоил- L-рибофуранозу и использовали для гликозилировния урацила и N6-бензиладенина по методу Форбрюггена. Было показано, что L-производные аденозина и уридина не являются ни субстратами, ни эффективными ингибиторами ПНФ и УФ E. coli. В 2018 году проведена большая работа по подготовке и написанию статьей и патента. Было подготовлено и направлено в печать 5 статей и заявка на патент РФ. Опубликована в январском номере 2018 года финальная версия статьи: M. S. Drenichev, C. S. Alexeev, N. N. Kurochkin, S. N. Mikhailov. Use of nucleoside phosphorylases for the preparation of 2′-deoxynucleosides. Advanced Synthesis & Catalysis, , 360, No 2. 305 –312 (2018). Опубликованы в 2018 году следующие статьи: 1.V. E. Oslovsky, P. N. Solyev, K. M. Polyakov, C. S. Alexeev, S. N. Mikhailov. Chemoenzymatic Synthesis of Cytokinins from Nucleosides: Ribose as a Blocking Group. Organic & Biomolecular Chemistry, 16, 2156 – 2163 (2018). 2.C. S. Alexeev, I. V. Kulikova, S. Gavryushov, V. I. Tararov, S. N. Mikhailov. Quantitative Prediction of Yield in Transglycosylation Reaction Catalyzed by Nucleoside Phosphorylases. Advanced Synthesis & Catalysis. 360, 3090-3096 (2018). 3.M. S. Drenichev, V. E. Oslovsky, V. I. Tararov, S. N. Mikhailov. Synthesis of N6‐Substituted Adenosines as Cytokinin Nucleosides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Supplement 72 (1), Unit 15, 14.15.1-14.15.16 (2018) 4.V. E. Oslovsky, M. S. Drenichev, C. S. Alexeev, P. N. Solyev, R. S. Esipov, S. N. Mikhailov. Synthesis of cytokinins via PNP-catalyzed enzymatic arsenolysis of purine nucleosides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, e61, (2018). Получен патент РФ: К.С.Алексеев, М.С.Дреничев, С.Н.Михайлов. Применение нуклеозидфосфорилаз для получения 2ꞌ-дезоксинуклеозидов. Заявка на патент РФ №2017119092, дата подачи 1.06.2017. Дата регистрации: 17.08.2018 Опубликовано: 17.08.2018 Бюл. № 23 Патент РФ 2664 472. Послана и зарегистрирована заявка на патент РФ: И.В.Варижук, К.С.Алексеев, М.С.Дреничев, С.Н.Михайлов. Способ получения α-D-рибозо-1-фосфата и α-D-2-дезоксирибозо-1-фосфата фосфоролизом 7-метилгуанозина и 7-метил-2’-дезоксигуанозина. Заявка на патент РФ №2018128931, дата подачи 7.08.2018. Всего по результатам работы по проекту в 2016-2018 годах опубликовано 8 статей, их них 3 статьи опубликованы в журналах из первого квартиля. Получен патент РФ и подана заявка на патент РФ.

 

Публикации

1. - Удивительный бактериальный фермент для биотехнологии Полит.ру, Pro Science, 05 августа 2018 (год публикации - ).

2. Алексеев К.С., Куликова И.В.,Гаврюшов С.А., Тараров В.И., Михайлов С.Н. Quantitative Prediction of Yield in Transglycosylation Reaction Catalyzed by Nucleoside Phosphorylases Advanced Synthesis & Catalysis, 2018, 360, 3090–3096 (год публикации - 2018).

3. Алексеев К.С.,Дреничев М.С., Михайлов С.Н. Use of 7-methyl-2’-deoxyguanosine for the preparation of 2 0 -deoxynucleosides FEBS Open Bio, FEBS Open Bio, Volume 8, Supplement 1, P. 174 (год публикации - 2018).

4. Алексеев Кирилл Сергеевич, Дреничев Михаил Сергевич, Михайлов Сергей Николаевич Гидройодная соль 7-метил-2'-дезоксигуанозина в качестве субстрата для получения 2'- дезоксинуклеозидов методом ферментативного трансгликозилирования -, RU2664472C1 (год публикации - ).

5. И.В. Варижук, К.С. Алексеев, М.С.Дреничев, С.Н. Михайлов Способ получения α-D-рибозо-1-фосфата и α-D-2-дезоксирибозо-1-фосфата фосфоролизом 7-метилгуанозина и 7-метил-2’-дезоксигуанозина -, Заявка на патент РФ №2018128931 (год публикации - ).

6. Михайлов С.Н. REVERSIBLE ENZYMATIC REACTIONS. HOW TO INCREASE THE YIELD OF THE TARGET NUCLEOSIDES AND NUCLEIC BASIS BIONANOTOX 2018, 9th INTERNATIONAL CONFERENCE “BIOMATERIALS AND NANOBIOMATERIALS, 06-13 MAY, 2018, p. 21-22 (год публикации - 2018).

7. Ословский В.Е., Дреничев М.С., Алексеев К.С., Сольев П.Н., Есипов Р.С., Михайлов С.Н. Synthesis of Cytokinins via Enzymatic Arsenolysis of Purine Nucleosides Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2018, 75(1), e61 (год публикации - 2018).

8. Ословский В.Е.,Сольев П.Н.,Поляков К.М., Алексеев К.С., Михайлов С.Н. Chemoenzymatic synthesis of cytokinins from nucleosides: ribose as a blocking group Organic & Biomolecular Chemistry, 2018, 16, 2156-2163 (год публикации - 2018).