Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За отчетный период в ходе выполнения работы было проведено секвенирование малых РНК в двух линиях эмбриональных стволовых клеток, четырех линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и двух линиях эмбриональных фибробластов крысы Rattus norvegicus. Проведена обработка полученных сырых данных и выравнивание последовательностей на геном крысы. В результате, была выявлена экспрессия 674 известных миРНК крысы. Для данных миРНК был проведен подсчет уровня экспрессии и анализ дифференциальной-экспрессии между группами плюрипотентных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов. Таким образом, была показана дифференциальная-экспрессия 219 миРНК, из которых 77 миРНК имели повышенный уровень экспрессии в плюрипотентных стволовых клетках, 142 миРНК имели повышенный уровень экспрессии в эмбриональных фибробластах. На основе экспрессии известных миРНК был проведен анализ по методу главных компонент и кластерный анализ. В результате данных анализов было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки крысы схожи с эмбриональными стволовыми клетками по паттерну экспрессии миРНК и отличаются от эмбриональных фибробластов. Среди миРНК, экспрессирующихся на высоком уровне в плюрипотентных стволовых клетках крысы, были выявлены миРНК кластера мир-290-295 и семейства мир-200, для которых ранее было показано участие в регуляции плюрипотентного состояния и процесса репрограммирования у мыши. Для дифференциально-экспрессирующихся миРНК с разницей в экспрессии не менее 10 раз между группами проведен поиск подтвержденных генов-мишеней. Для выявленных генов-мишеней был выполнен анализ категорий Gene Ontology и показано, что данные гены-мишени участвуют в таких процессах, как регуляция транскрипции, поддержание стволовых клеток, пролиферация клеток, клеточная адгезия, регуляция дифференцировки. Кроме того, были построены генные сети, демонстрирующие участие дифференциально-экспрессирующихся миРНК и их генов-мишеней в процессе поддержания стволовых клеток и мезенхимально-эпителиальном переходе, одном из ключевых процессов в ходе репрограммирования фибробластов к плюрипотентному состоянию. Проведен поиск новых, ранее не аннотированных миРНК крысы с использованием трех различных программ. Выявлено 404 новых зрелых миРНК крысы. Выполнен подсчет уровня экспрессии и анализ дифференциальной экспрессии между группами плюрипотентных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов. Показано, что 10 новых миРНК имеют повышенный уровень экспрессии в плюрипотентных стволовых клетках, 13 новых миРНК имеют повышенный уровень экспрессии в эмбриональных фибробластах. Для 305 новых миРНК крысы был проведен поиск потенциальных генов-мишеней с использованием трех различных программ. В результате было выявлено 86583 потенциальных генов-мишеней. Для генов-мишеней 10 миРНК с максимальным уровнем экспрессии в плюрипотентных стволовых клетках и 10 миРНК с максимальным уровнем экспрессии в эмбриональных фибробластах проведен анализ категорий Gene Ontology и сигнальных путей KEGG. Среди наиболее значимых GO категорий для генов-мишеней 10 новых миРНК с максимальной экспрессией в плюрипотентных стволовых клетках были выявлены такие как: процессы в эмбриональном развитии, клеточная миграция, регуляция экспрессии генов. Анализ сигнальных путей KEGG, проведенный на том же пуле генов-мишеней показал их участие в таких сигнальных путях, как Wnt и TGF-beta.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Была проведена валидации экспрессии известных (miR-295-3p, miR-741-3p, miR-743a-3p) и новых (novel-1 (chrX:−:151288045–151288101, rn5), novel-2 (chr7:+:70463555–70463635, rn5, гомолог mmu-miR-26), novel-3 (chr3:+:16697079–16697143, rn5, гомолог mmu-miR-199), novel-4 (chr18:−:69422790–69422857, rn5)) миРНК крысы методом ПЦР в реальном времени. Проведен анализ экспрессии миРНК miR-295-3p, miR-741-3p, miR-743a-3p, novel-1, novel-4 в ходе дифференцировки плюрипотентных клеток крысы и в органах взрослых особей. Было показано, что уровень экспрессии miR-295-3p, miR-741-3p, miR-743a-3p, novel-1 снижается при дифференцировке плюрипотентных клеток, что свидетельствует в пользу участия данных миРНК в регуляции процессов поддержания плюрипотентности и репрограммирования. Показано, что miR-295-3p, miR-743a-3p экспрессируются в семенниках на сравнимом с плюрипотентными клетками уровне, а miR-741-3p в семенниках, легких, селезенке и яичниках крысы. Известно, что miR-741 и miR-743a локализуются в относительной близости miR-463, miR-465, miR-471, miR-743b, miR-871, miR-878, miR-880, miR-881 и miR-883. Данные миРНК характеризуются повышенным уровнем экспрессии в плюрипотентных клетках крысы однако они и их гомологи у мыши являются практически неизученными. На основании полученных данных данные миРНК и миРНК novel-1 были выбраны и сгруппированы для дальнейшего изучения в контексте регуляции процессов поддержания плюрипотентности и репрограммирования клеток крысы. Получены линии фибробластов крысы с делециями участков генома размером от 100 до 45,000 п.н., кодирующих данные миРНК, что позволит провести анализ их участия в процессе репрограммирования. Для сверхэкспрессии миРНК в клетках эукариот была создана и апробирована лентивирусная система. С использованием биоинформатического анализа имеющихся литературных данных определены ключевые гены-мишени дифференциально-экспрессирующихся миРНК, задействованные в регуляции процессов поддержания плюрипотентности и репрограммирования клеток крысы.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В результате экспериментов по репрограммированию фибробластов крысы с делецией участка генома, кодирующего все 14 микроРНК с miR-743a по miR-465, было показано, что наличие данной делеции приводит к ингибированию процесса репрограммирования клеток крысы к плюрипотентному состоянию. Установлено, что клетки, полученные в результате репрограммирования фибробластов с нокаутом данных микроРНК, образуют неплотные колонии, отличающиеся от колоний ЭСК и ИПСК крысы, окрашиваются на щелочную фосфатазу и поверхностный антиген SSEA-1, но погибают при отсутствии экспрессии экзогенных факторов плюрипотентности. Проведен анализ экспрессии маркеров плюрипотентного состояния в клетках с делецией микроРНК. Показано, что экспрессия маркеров плюрипотентного состояния в данных клетках значительно снижена в сравнении с контрольными клетками. Стоит отметить, что полученные клетки с нокаутом микроРНК могут впоследствии быть использованы в качестве модельной системы для изучения генов-мишеней этих 14 микроРНК. Показано, что эффективность репрограммирования субклонированных линий фибробластов крысы с делециями групп микроРНК: (1) miR-743a, miR-743b, miR-742, miR-883; (2) miR-471, miR-3551, miR-741, miR-463; (3) miR-880, miR-878, miR-881, miR-871; (4) miR-3580, miR-465, также значительно снижена по сравнению с контрольной группой клеток. Данные результаты свидетельствуют в пользу того, что в каждой из данных групп присутствуют микроРНК, участвующие в регуляции репрограммирования клеток крысы к плюрипотентному состоянию. При этом, при сверхэкспрессии групп микроРНК увеличение эффективности репрограммирования не наблюдалось. Проведен подробный анализ потенциальных генов-мишеней 14 исследуемых микроРНК для установления предполагаемого механизма их действия при репрограммировании. Выявлено, что список потенциальных генов-мишеней обогащен генами сигнального пути Tgf-beta, ингибирование которого способствует репрограммированию клеток мыши. Также, среди генов-мишеней присутствуют другие ингибиторы плюрипотентного состояния, такие как Setd7, Tcf7l2, Wif1. Таким образом, в результате выполнения проекта были выявлены новые микроРНК – участники процесса репрограммирования к плюрипотентному состоянию у крысы и предложен возможный механизм их действия.