Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проанализирована трехмерная структура 16 ранее обнаруженных структурных семейств белков, содержащих кальцийсвязывающие петли типа Dx[DN]xDG. Также проанализированы структуры других кальцийсвязывающих белков со структурным кальцийсвязывающим мотивом типа DxDxDG. Найдены четыре новых семейства белков, содержащие кальцийсвязывающий мотив типа DxDxDG. Идентифицированы и описаны два новых кальцийсвязывающих окружения белка: зона “кальциевой лопасти” (12 белковых семейств) и зона “EF-руки” (8 семейств). Каждое из этих кальцийсвязывающих окружений белков включает в себя три структурных элемента: (а) хорошо известный характерный мотив Dx[DN]xDG; (б) смежный структурно идентичный сегмент, связывающий ион металла тем же способом между зоной кальциевой лопасти и зоной EF-руки; (в) структурно вариабельный сегмент, который отличает зону кальциевой лопасти от зоны EF-руки. Используя структурно идентичные сегменты изучаемых белков в качестве основы, удалось сконструировать классический кальцийсвязывающий центр типа EF-руки, реализованный в кальмодулине, на основе двух различных кальцийсвязывающих мотивов из двух не связанных друг с другом белков. Проведено сравнение с белком дикого типа следующих белков с С-концом, меченным полигистидиновой меткой (6xHis): кальмодулин человека, α-парвальбумин крысы, онкомодулин крысы, белки S100P и S100B человека, рековерин человека. Изучение всех уровней структурной организации белков (масс-спектрометрия, круговой дихроизм, флуоресцентные плавления, химические сшивки) показало, что введение полигистидиновой метки вызывает выраженные изменения хотя бы на одном из структурных уровней организации белка. Таким образом, введение полигистидиновой метки в кальцийсвязывающие белки семейства EF-руки оправдано лишь в случае изучения мутантных форм белка, обладающих свойствами, объективно препятствующими их изучению. Например, в случае необходимости разработки мутант-специфичной процедуры выделения белка, требующей значительных усилий и времени. Изучение мутантной формы β-парвальбумина крысы (PA), в которой единственный остаток цистеина в неактивной AB-петле белка заменен на серин (C19S), показало, что введение гомологичной замены C19S в PA снижает его α-спиральность и термостабильность, увеличивает доступность растворителю гидрофобных остатков белка, а также снижает сродство белка к катионам кальция и магния. Следовательно, остаток C39 β-парвальбумина важен для поддержания структурно-функционального статуса белка. Обнаружена склонность β-парвальбумина к дисульфидной димеризации в мягких окисляющих условиях, что указывает на его редокс-чувствительность. Отметим, что ранее нами была показана редокс-чувствительность и ее функциональная значимость для единственного цистеина рековерина быка, расположенного в идентичном положении его неактивной AB-петли. Этот остаток консервативен во всем семействе нейрональных кальциевых сенсоров. Изучен механизм заполнения кальцийсвязывающих центров рекомбинантного α-парвальбумина (PA). Кальций- и магний-связывающие свойства мутантных форм PA, включая PA-CD (инактивирован CD центр), PA-EF (инактивирован EF центр) и PA-CD/-EF (инактивированы оба центра), а также белок дикого типа, изученные методами титрований, металлических буферов, а также равновесного диализа, указывают на реализацию последовательного механизма заполнения кальцийсвязывающих центров белка катионами кальция и магния, при котором CD центр заполняется первым, с последующим заполнением EF центра. Полученные данные опровергают данные других авторов (Eur.J.Biochem. 1996, 242(2): 249-255), по-видимому, искаженные вследствие применения множества негомологичных замен. Разработан метод применения метода атомно-абсорбционной спектроскопии с электротермическим способом атомизации пробы для изучения сродства к металлам кальцийсвязывающих белков, с использованием микродиализной планшетной системы. Проведен подробный анализ имеющейся литературы, а также полученных коллективом проекта за последние годы данных по структурно-функциональным свойствам белков семейства парвальбумина. Результаты исследования опубликованы в виде обзорной статьи: Permyakov E.A., Uversky V.N., Permyakov S.E. Parvalbumin as a pleomorphic protein. Current Protein and Peptide Science, 2016, v14. Pubmed ID: 27964700. Doi: 10.2174/1389203717666161213115746.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1) Отталкиваясь от строения кальцийсвязывающих центров парвальбумина и интегрина, как репрезентативных структур доменов типа «EF-рука» и «кальциевая лопасть», соответственно, на двух независимых представительных выборках белков обнаружены четыре новых распознающих катионы кальция модуля белков: состоящий из одного аминокислотного остатка модуль типа I (ORI), состоящий из трех аминокислотных остатков модуль типа I (TRI), состоящий из одного остатка модуль типа II (ORII) и состоящий из трех аминокислотных остатков модуль типа II (TRII). Исходя из количества и природы вариабельных атомов этих модулей, модули типа I и II теоретически могут быть представлены четырьмя и двенадцатью вариантами, соответственно. Анализ белков, связывающих катион металла кислородом карбонильной группы основной цепи в области так называемой «ниши» (описаны в работе (Torrance, Leader et al. 2009)), показывает присутствие в белках практически всех возможных вариантов модулей, распознающих катионы кальция. Парвальбумин, интегрин альфа-IIb и шестнадцать других белков с различными кальцийсвязанными «нишами» содержат различные комбинации последовательно соединенных модулей OR(I/II) и TR(I/II). Объединенный модуль OR(I/II)+TR(I/II) образует трипептид, использующий для связывания иона металла три атома основной цепи: азот n (донор), кислород n (акцептор) и азот n+2 (донор). Таким образом, описанные модули ORI, TRI, ORII и TRII могут служить в качестве элементарных блоков для конструирования более сложных субструктур распознающих катионы кальция в различных кальцийсвязывающих центрах не связанных друг с другом белков. 2) Методами спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса и спектрофлуориметрического титрования сывороточным альбумином белка S100P, меченного флуоресцеином, показано, что мономерная форма рекомбинантного белка S100P человека взаимодействует с сывороточным альбумином человека (САЧ) в условиях избытка кальция с равновесной константой диссоциации комплекса, равной 25-50 нМ. Удаление кальция, димеризация S100P или гликирование САЧ в условиях in vitro блокируют взаимодействие между S100P и САЧ. Взаимодействие S100P-САЧ селективно, поскольку мономерный S100P человека не связывает бычий сывороточный альбумин, а мономерный белок S100В человека не взаимодействует с САЧ. Обнаруженное селективное и высокоспецифичное, зависящее от конформации взаимодействие между S100P и САЧ показывает, что функциональные свойства мономерной и димерной форм белков S100 различны, а также вызывает вопрос о правомочности клеточных тестов и животных моделей, используемых при исследованиях (пато)физиологических функций белков S100. 3) Апо-формы некоторых парвальбуминов не обладают жесткой третичной структурой, однако распространенность этого явления и его функциональная значимость до сих пор не ясны. В поисках разупорядоченных парвальбуминов мы исследовали конформационную стабильность парвальбумина β-1 кижуча, используя методы кругового дихроизма, сканирующей калориметрии, флуоресценции зондов, ограниченного протеолиза, химических сшивок и динамического рассеяния света. Показано, что апо-парвальбумин кижуча является, в основном, мономерным белком с заметно дезорганизованной вторичной структурой и отсутствием жесткой третичной структуры. Анализ склонности к внутренней неупорядоченности в группах парвальбуминов со свернутой или развернутой апо-формой с использованием алгоритма VSL2P показал, что N-концевая область белка, включающая в себя α-спираль А, петлю AB и N-концевую половину α-спирали B, менее упорядочена в парвальбуминах с развернутой апо-формой. Применение структурных критериев, разработанных для дискриминации разупорядоченных парвальбуминов, показывает, что 16-19% парвальбуминов разупорядочены. Показано, что структурная нестабильность апо-β-парвальбуминов служит признаком повышенного сродства к ионам кальция. 4) Замена на аланин остатков «черных» и «серых» кластеров β-парвальбумина крысы не приводит к существенным изменениям на уровне четвертичной структуры белка (содержание мономера не ниже 64%, независимо от содержания кальция/магния). При этом усредненная величина абсолютных изменений гидродинамического радиуса апо-формы белка, вызванных заменами на аланин отдельных остатков «черного» кластера, в три раза превышает таковую в случае замен остатков «серого» кластера белка. Аналогичным образом усредненная величина абсолютных изменений термостабильности кальций/магний-загруженных форм белка, вызванных заменами на аланин остатков «черного» кластера, в три раза превышает таковую для замен остатков «серого» кластера. Наблюдается существенное увеличение доступности растворителю гидрофобных участков белка для всех мутантов, независимо от содержания кальция/магния (за исключением апо-формы мутанта по «серому» кластеру G61A). Для всех кластерных мутантов за исключением апо-формы мутанта по «серому» кластеру G61A наблюдается выраженное снижение α-спиральности белка, независимо от содержания кальция/магния. Наконец, средняя величина снижения общей свободной энергии связывания ионов кальция, вызванного заменами на аланин отдельных остатков «черного» кластера белка, в 4-7 раз превышает таковую для замен остатков «серого» кластера. В целом, несмотря на сложную картину вкладов отдельных остатков «черных»/«серых» кластеров β-парвальбумина в поддержание структурно-функционального статуса белка, по ряду параметров, таких как, гидродинамический радиус апо-формы белка, термостабильность кальций/магний-загруженных форм белка и общая энергия связывания белком катионов кальция, аланиновые замены остатков «черного» кластера β-парвальбумина сопровождаются в разы более выраженными эффектами, нежели таковые замены остатков «серого» кластера белка. Полученный результат указывает на более существенный вклад аминокислотных остатков «черного» кластера β-парвальбумина в поддержание структурных и функциональных свойств белка, нежели таковой вклад остатков «серого» кластера. 5) Замена на аланин остатков «черных» и «серых» кластеров кальмодулина человека не приводит к существенным изменениям на уровне четвертичной структуры белка (содержание мономера не ниже 55%, независимо от содержания кальция/магния). При этом наблюдается снижение доступности растворителю гидрофобных участков кальцийзагруженного белка для всех мутантов, за исключением замен по «черным» кластерам F66A и Y139A/F142A. При этом лишь мутанты F66A и Y139A демонстрируют увеличение стехиометрии связывания с мелиттином на 0,5 и 1,9 единиц, соответственно (2,1 для белка дикого типа), при падении сродства к мелиттину на 2-2,4 порядка величины (Kd=4 нМ для белка дикого типа). Наиболее выраженное снижение стехиометрии связывания мелиттина (до величин 1,1-1,2) наблюдается для мутантов по «серому» кластеру I53A и I126A (при падении сродства к мелиттину на порядок величины), а также мутанту по «черному» кластеру F17A (при сохранении сродства к меллитину). Самые незначительные изменения параметров связывания с мелиттином наблюдаются для мутанта по «черному» кластеру F69A. При этом мутант F69A демонстрирует максимальное снижение термостабильности апо-формы белка, составляющее 19°С. Наибольшее увеличение термостабильности апо-формы белка (на 7°С) наблюдается для мутанта по серому кластеру L106A. В целом, наблюдается сложная картина вкладов отдельных остатков «черных» и «серых» кластеров кальмодулина в поддержание структурного и функционального статуса белка. Аналогичная сложная картина эффектов, сопровождающих замены кластерных остатков белка на аланин, наблюдается в случае белка S100P человека, что, по-видимому, является следствием димерности белка. Тем не менее, в отношении связывания кальцийсвязанной формой белка S100P интерлейкина-11 человека средняя величина снижения общей свободной энергии связывания интерлейкина-11, вызванного заменами на аланин отдельных остатков «черного» кластера белка S100P, в 2,4-2,6 раз превышает таковую для замен остатков «серого» кластера. Полученный результат указывает на более существенный вклад аминокислотных остатков «черного» кластера белка S100P в поддержание функциональных свойств белка, нежели таковой вклад остатков «серого» кластера. Суммируя, помимо получения важных данных по закономерностям строения кальцийсвязывающих центров белков, обнаружения взаимодействия между белком S100P и сывороточным альбумином, а также установления структурных критериев неупорядоченности в парвальбуминах, изучено влияние замен на аланин отдельных остатков консервативных кластеров спаренных доменов «EF-руки» выбранных для анализа белков этого семейства (кальмодулин, парвальбумин и белок S100P) на их структурные, физико-химические и функциональные свойства, что позволило выявить позиции этих кластеров, наиболее принципиальные для поддержания структурно-функционального статуса этих белков. Тем самым, получены новые данные по структурным основам функционирования спаренных доменов «EF-руки» в нескольких репрезентативных подсемействах белков “EF-руки”: 1) канонический кальциевый сенсор (кальмодулин); 2) неканонический кальциевый сенсор (белок S100P); 3) канонический кальциевый буфер (парвальбумин).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году были продолжены теоретические исследования структурных основ функционирования кальцийсвязывающих центров белков, включая центры в спаренных доменах типа «EF-рука». В то время, как в предыдущие годы основное внимание было обращено на строение и свойства «черного» и «серого» кластеров, в 2018 году было начато изучение взаимодействий между этими кластерами. На основе плазмидных векторов, разработанных на первых стадиях выполнения проекта, получены плазмидные векторы для бактериальной экспрессии, несущие гены кальмодулина человека и рековерина человека с заменами на аланин одиночных аминокислотных остатков «черных» и «серых» кластеров спаренных «EF-рук» исследуемых белков (без дополнительных меток). Все исследуемые белки, были экспрессированы в E. coli и выделены в миллиграммовых количествах. Продолжены структурные, физико-химические и функциональные исследования мутантных форм кальмодулина и рековерина с использованием следующих методов: 1. Проведено изучение вторичной структуры полученных препаратов белков методом спектроскопии кругового дихроизма в зависимости от концентрации ионов кальция/магния. 2. Проведено исследование стабильности третичной структуры полученных препаратов белков в отношении тепловой денатурации методами дифференциальной сканирующей калориметрии, а также собственной люминесценции белка в зависимости от концентрации ионов кальция/магния. 3. Проведено изучение четвертичной структуры полученных препаратов белков методами химических сшивок (глутаровый альдегид или EDAC/сульфо-NHS) и динамического рассеяния света в зависимости от концентрации кальция/магния. 4. Проведено исследование сродства полученных препаратов белков к катионам кальция/магния методами прямого спектрофлуориметрического титрования металлами, спектрофлуориметрического титрования металлами с использованием буферов металлов, а также методом равновесного диализа с детекцией металла с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии. 5. Изучены металл-зависимые изменения доступности растворителю гидрофобных участков полученных препаратов белков при помощи флуоресцентного гидрофобного зонда, бис-АНС. 6. Проведены следующие функциональные исследования полученных препаратов белков: - Продолжено изучение взаимодействия кальцийсвязанной формы препаратов мутантных кальмодулинов с мелиттином, цитолитическим пептидом пчелиного яда, широко используемым в качестве модельного белка-мишени кальмодулина. - Изучено влияние аланиновых мутаций в «черном» и «сером» кластерах рековерина на его функцию - ингибирование фосфорилирования родопсина. Проведен подробный анализ полученных за все время выполнения проекта экспериментальных данных по влиянию аланиновых замен в «черном» и «сером» кластерах белков семейства «EF-руки» - парвальбумина, белка S100, кальмодулина и рековерина. Часть результатов анализа опубликована в 2018 году, как минимум, в трех статьях, еще несколько статей находятся на стадии написания. «Черный» и «серый» кластеры β-парвальбумина (известен как "онкомодулин") крысы составлены из F48, A100, F103 и G61, L64, M87, соответственно. В настоящем исследовании мы последовательно заменяли эти аминокислотные остатки на Ala, за исключением Ala100, который был заменен на Val. Показано, что, несмотря на довольно сложную картину влияния отдельных аминокислотных остатков «черного» и «серого» кластера на поддержание структурного и функционального статуса β-парвальбумина крысы, аланиновые замены в «черном» кластере вызывают более существенные изменения различных структурных параметров белков таких, как гидродинамический радиус апо-формы, тепловая стабильность Ca2+/Mg2+-насыщенных форм и полная энергия связывания кальция, по сравнению с изменениями, вызываемыми аминокислотными заменами в «сером» кластере. Эти наблюдения были далее подтверждены результатами компьютерного анализа влияния этих мутаций на предрасположенность β-парвальбумина крысы к внутреннему разупорядочению, которые показали, что локальная предрасположенность к разупорядочению и общий уровень предсказанной разупорядоченности сильно зависят от мутаций в «черном» кластере, в то время как мутации в «сером» кластере оказывают гораздо меньшее влияние. Полученные результаты показывают, что аминокислотные остатки, входящие в «черный» кластер, дают более существенный вклад в поддержание структурных и функциональных свойств белка по сравнению с аминокислотными остатками «серого» кластера. Полигистидиновые метки часто используются в ходе аффинной очистки рекомбинантных белков, экспрессируемых в системах экспрессии прокариот. Проведено сравнительное исследование физических свойств содержащего и не содержащего His-метку рекомбинантных β-парвальбуминов крысы. Обнаружено, что присоединение His-метки увеличивает содержание α-спиралей и уменьшает содержание β-структуры и β-поворотов в апо-форме β-парвальбумина. В противоположность этому, присоединение His-метки уменьшает содержание α-спиралей более, чем на 10%, и увеличивает содержание β-структуры и β-поворотов в Ca2+-насыщенной форме β-парвальбумина. Согласно данным метода динамического рассеяния света, апо-состояние содержащего His-метку β-парвальбумина крысы менее компактно по сравнению с апо-состоянием немеченного белка. Удивительно то, что присоединение His-метки практически не изменяет гидродинамический радиус Ca2+-насыщенного β-парвальбумина крысы. Присоединение His-метки сдвигает пики тепловой денатурации как апо-, так и Ca2+-насыщенного β-парвальбумина крысы в сторону более высоких температур на 3-4°C и слегка уменьшает его сродство к кальцию. Результаты этой работы должны учитываться при работе с парвальбуминами, содержащими His-метку. Исследовано взаимоотношение между положением «черного» и «серого» структурных кластеров в парвальбумине и положением областей аминокислотной последовательности с тенденцией к внутренней разупорядоченности. Наш анализ обнаружил, что в парвальбумине аминокислотные остатки, расположенные вблизи консервативных структурных кластеров, являются частями консервативных мотивов, обогащенных аминокислотными остатками, вызывающими разупорядочение структуры. По этой причине кластеры, найденные в парвальбумине, характеризуются не только присутствием консервативных аминокислотных остатков, но также и консервативным распределением предрасположенности к разупорядоченности внутри их последовательностей, что говорит о присутствии консервативной структурной динамики в апо-формах парвальбумина, причем «черный» кластер обладает, по-видимому, большей подвижностью, чем «серый» кластер. «Черный» и «серый» кластеры в белке S100P состоят из аминокислотных остатков F15, F71, F74 и L33, L58, K30, соответственно. В настоящей работе мы последовательно заменяли эти остатки на Ala. Обнаружено, что аланиновые замены в «черном» и «сером» кластерах вызывают сравнимые изменения физических свойств S100P. Лишь в случае тепловой денатурации, мутации в «черном» кластере вызывают более существенные изменения параметров денатурации по сравнению с изменениями, вызываемыми аналогичными мутациями в «сером» кластере. Сделан вывод о том, что, в противоположность парвальбумину, белок S100P характеризуется аналогичными структурными и динамическими свойствами в областях «черного» и «серого» кластера. Показано, что связывание кальция димерным S100P хорошо описываются схемой связывания, предполагающей наличие одного сильного центра с K1 = 2.5×106 M-1 и трех кооперативно взаимодействующих слабых центров с K2 = 4.9×104 M-1. Аланиновые мутации в «черном» и «сером» кластерах S100P вызывают, в основном, уменьшение кооперативности связывания кальция слабыми центрами. «Черный» и «серый» кластеры в N-концевом домене рекомбинантного рековерина составлены аминокислотными остатками соответственно F35, F83, Y86 и F70, Q46, F49. «Черный» и «серый» кластеры в C-концевой части рекомбинантного рековерина составлены аминокислотными остатками соответственно F106, E169, F172 и W156, K119, V122. Обнаружено, что аланиновые замены аминокислотных остатков в «черных» и «серых» кластерах в большинстве случаев приводят к росту степени спиральности белка. Показано, что мутации в «черном» и «сером» кластерах С-концевой части рековерина, вызывают существенное снижение его термостабильности (до 16ºС), причем эффект наиболее выражен в случае мутаций в «сером» кластере. Мутации в «черном» и «сером» кластерах N-концевой части рековерина приводят как к увеличению, так и к снижению термостабильности белка. Обнаружено, что кластерные мутации могут как увеличивать, так и уменьшать сродство рековерина к Ca2+. В некоторых случаях при мутации происходит изменение механизма связывания Ca2+ с последовательного на кооперативный. Аланиновые замены в «черном» и «сером» кластерах рекомбинантного рековерина человека, как правило, приводят к ухудшению его способности ингибировать родопсинкиназу в присутствии кальция. Удивительно, что замена остатка триптофана 156 на аланин в С-концевом «сером» кластере приводит к тому, что этот мутант не ингибирует, а активирует фосфорилирование родопсина как в присутствии, так и в отсутствие кальция. Обнаружено, что кластерные мутации в «черном» и «сером» кластере C-концевой части рековерина в большинстве случаев улучшают его связывание мембранами в присутствии кальция. Проведено изучение физико-химических свойств кальмодулина человека дикого типа и его мутантов по «черным» и «серым» кластерам: F17A, F66A, F69A («черный» кластер N-концевого домена); T30A, L33A, I53A («серый» кластер N-концевого домена); F90A, Y139A, F142A («черный» кластер С-концевого домена); L106A, I126A («серый» кластер С-концевого домена; третий остаток кластера - Ala). Аланиновые мутации в «черном» кластере уменьшают содержание α-спиралей апо-формы кальмодулина, особенно мутации в «черном» кластере N-концевого домена. В Са2+-загруженной форме у всех мутантов по «серому» кластеру наблюдается снижение доли α-спиралей. В Mg2+-загруженной форме наблюдаются менее драматические изменения в содержании неупорядоченных структур и α-спиралей у мутантов по «серому» кластеру. Полученные результаты говорят о том, что точечные замены в консервативных кластерах могут приводить к большому количеству разнонаправленных структурных эффектов, но не приводят к полному разрушению вторичной структуры белка. Результаты метода химических сшивок с помощью EDAC/сульфо-NHS показывают, что кальмодулин человека дикого типа и его точечные мутанты по «серому» кластеру склонны к образованию димеров при 15°C как в апо-форме так и в металл-загруженных формах. В кальций-загруженной форме все белки обладают способностью образовывать олигомеры более крупного порядка. Исследовали взаимодействие различных форм кальмодулина и его мутантов с пептидом из пчелиного яда, мелиттином, который часто используется в качестве модельного белка-мишени кальмодулина. Обнаружено, что мутанты по «черному» кластеру F17A, F69A, Y139A характеризуются повышенными константами диссоциации комплекса с мелиттином. Такой результат согласуется с гипотезой о функциональной значимости чёрного кластера. У мутантов L33A, F66A и F142A наблюдается незначительное увеличение констант диссоциации комплекса, а для T30A, L106A, I126A, F90A – небольшое уменьшение.