Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. На основе деминерализованного костного матрикса (ДКМ) ксеногенного происхождения разработан новый вариант остеопластического материала для самостоятельного применения в костной пластике или использования в качестве носителя для рекомбинантных факторов роста и регенерации костной ткани. Основными особенностями материала являются высокий уровень стандартизации, обеспечиваемый количественным контролем степени очистки по целому ряду параметров, а также пониженная иммуногенность за счет высокой степени очистки от неколлагеновых белков. Материал получен в нескольких формах: костные блоки, клинья, мембраны, стержни, хлопья. Технологический процесс получения высокоочищенного ДКМ включает следующие стадии: фрагментацию, удаление мягких тканей, перфорацию губчатого матрикса, обезжиривание, деминерализацию, удаление неколлагеновых белков, отмывку, лиофилизацию, стерилизацию. Для каждой стадии определены оптимальные условия обработки, введен контроль качества по ряду параметров: содержание липидного компонента, степень деминерализации, содержание неколлагеновых белков в экстрактах, влажность, pH, микробиологическая стерильность. В случае губчатых блоков крупного размера (более 1 см3) частоту перфораций для полной деминерализации оптимизировали с помощью томографического 3D-анализа на микрокомпьютерном томографе Skyscan 1176 («Bruker», США). Полноту деминерализации полученных видов исполнения костного матрикса контролировали также с помощью анализа элементного состава на различной глубине с использованием сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 3D («FEI Company», США). Хранить ДКМ, полученный по разработанной методике, следует при температуре от 0 до +4°С не более 2 лет. 2. Получены результаты по оценке регенеративного потенциала, эффективности и безопасности применения деминерализованного костного матрикса в виде мембран из губчатой костной ткани на модели регенерации краниальных дефектов критического размера у крыс. Для этой цели использовали гистологический анализ, микрокомпьютерную томографию и расчет скорости роста костной ткани с помощью мечения флуорохромами in vivo. Отработаны подходы для статистического анализа данных по оценке регенеративного потенциала остеопластических материалов. Эксперименты по оценке регенеративного потенциала ДКМ проводили на двух группах крыс стока Вистар по 6 голов каждая. В теменных костях черепа создавали 8-мм дефект, в группе 1 его оставляли незаполненным, в группе 2 его заполняли мембраной из ДКМ. Для расчёта скорости роста костной ткани животным подкожно вводили гидрохлорид тетрациклина однократно по окончании имплантации и ализарин красный S двукратно, на 40 и 50-е сутки после операции. Через 60 суток после имплантации проводили некропсию участка свода черепа с дефектом. По результатам гистоморфометрического и томографического исследований по всем количественно оцененным параметрам: площади минерализованного костного матрикса, скорости роста новообразованной костной ткани, суммарной эффективности регенерации, объему всех тканей (TV, tissue volume), площади поверхности всех тканей (TS, tissue surface), продемонстрированы статистически достоверные отличия (p<0,05) значений показателей в группе с ДКМ по сравнению с контрольной группой (статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрического критерия Краскела-Уоллиса в программе Statistica 12.0). Таким образом, продемонстрирован регенеративный потенциал полученного при выполнении проекта остеопластического материала – ДКМ ксеногенного происхождения с высокой и контролируемой степенью очистки. Результаты опубликованы в статье: Bartov et al. // Bull. Exp. Biol. Med.– 2016.– Vol. 162, No. 2.– P. 273-276. DOI 10.1007/s10517-016-3593-x, http://link.springer.com/article/10.1007/s10517-016-3593-x. В рамках реализации проекта была также проведена отработка применения статистических методов для анализа результатов тестирования биологической активности остеопластических материалов in vivo. Она проводилась с использованием данных, полученных в комплексной работе по изучению остеоинтеграции титановых имплантатов с биоактивной поверхностью. Выработанный алгоритм применения методов статистического анализа в зависимости от особенностей дизайна эксперимента и характера данных будет применяться для обработки результатов, полученных в проекте. Описание статистической обработки и ее результаты опубликованы в статье: Гайфуллин и др. // Морфология.– 2016.– Т. 149, № 1.– С. 77–84. http://elibrary.ru/item.asp?id=25621269. 3. С использованием микробиологического синтеза в Escherichia coli получены три новых варианта рекомбинантного фактора BMP-2 человека: rhBMP-2, не содержащий дополнительных белковых доменов, а также два рекомбинантных белка, содержащие дополнительные белковые домены: s-tag-BMP-2 и lz-BMP-2. Целью введения дополнительных белковых доменов являлось повышение растворимости, стабилизация структуры и улучшение способности к димеризации белков. s-tag-BMP-2 несет на N-конце 15-звенный олигопептид из рибонуклеазы А поджелудочной железы быка. lz-BMP-2 содержит на N-конце димеризационный домен «лейциновая молния» дрожжевого транскрипционного фактора GCN4 (GCN4 leucine zipper, lz). Для белков s-tag-BMP-2 и lz-BMP-2 разработаны схемы выделения и очистки, включающие двухстадийную колоночную хроматографию на Ni-содержащем сорбенте и гепарин-сефарозе. Подобраны условия протеолитического гидролиза белка s-tag-BMP-2 энтерокиназой и получения в результате этого нативной формы rhBMP-2. В аналогичных условиях белок lz-BMP-2 не гидролизуется. При выделении и очистке целевых белков выход димерной формы белка в случае rhBMP-2 составил 9 мг, в случае s-tag-BMP-2 – 8,2 мг, в случае lz-BMP-2 – 1,7 мг из 1 г сырой биомассы штамма-продуцента. Растворимость полученных рекомбинантных белков в растворе 25 мМ ацетата аммония при pH 4,5 составляет 0,2 мг/мл для rhBMP-2 без дополнительных доменов, 3,5 мг/мл для s-tag-BMP-2 и 1,2 мг/мл для lz-BMP-2. По результатам MALDI-TOF-масс-спектрометрии молекулярные массы димерных и мономерных форм s-tag-BMP-2 и lz-BMP-2 соответствуют расчетным значениям. Лучшая растворимость белка s-tag-BMP-2 по сравнению с lz-BMP-2, больший выход при выделении, большая удельная активность в клеточном тесте in vitro и возможность получения на его основе rhBMP-2 без дополнительного белкового домена с помощью протеолитического гидролиза энтерокиназой делают его более перспективным с точки зрения биотехнологического и биомедицинского применения, в частности при создании остеопластических материалов на основе природных или синтетических носителей, насыщенных фактором роста, и их использования для регенерации костной ткани у животных и человека. 4. Исследованы иммунореактивность и биологическая активность всех вариантов рекомбинантных белков BMP-2. Порог обнаружения созданной в проекте ИФА тест-системой для всех вариантов rhBMP-2 – без доменов, s-tag-BMP-2 и lz-BMP-2 – составил 5 нг/мл. Все варианты BMP-2, полученные в проекте, демонстрировали активность в тесте по индукции активности щелочной фосфатазы, маркера остеобластической дифференцировки, миобластами линии С2С12, сравнимую с активностью коммерческого препарата rhBMP-2, полученного синтезом в E. coli («R&D Systems», США). Результаты, изложенные в п.п. 3 и 4, изложены в статьях: Карягина А.С. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.– 2016.– Т. 162, № 4 (в печати) и Карягина А.С. и др. // Биохимия.– 2017.– Т. 82 (в печати). 5. Биологическая активность рекомбинантных белков в составе различных материалов исследована in vivo (1) на модели эктопического остеогенеза у мышей при имплантации коллагенового носителя, (2) модели краниальных дефектов критического размера у крыс при имплантации дисков из ДКМ, (3) модели травмы коленного сустава (иссечение передней крестообразной связки) у крыс при введении сшитого гиалуроната Na, (4) модели имплантации в строму роговицы кроликов коллагеновой мембраны. (1) Исследование биологической активности in vivo на модели эктопического остеогенеза у мышей проводили с использованием гидрогелей из коллагена I типа с фибронектином плазмы крови человека, содержащих и не содержащих рекомбинантные белки s-tag-ВМР-2 и lz-BMP-2. По результатам гистологического анализа оба исследованных белка обладали остеоиндуктивными свойствами, при этом в случае применения препарата s-tag-BMP-2 очаги оссификации были более выражены. По результатам томографического анализа на 42-е сутки после операции наблюдалась минерализация имплантатов, содержащих s-tag-ВМР-2 и lz-BMP-2, при этом в контрольной группе участков минерализации обнаружено не было. При сравнении морфологических параметров костной ткани между группами с разными препаратами rhBMP-2 в случае применения препарата s-tag-BMP-2 было установлено достоверное увеличение значений (p<0,05, критерий Манна-Уитни) процента костной ткани (BV/TV, bone volume/tissue volume), а также плотности кости (BMD, bone mineral density). (2) Проведена оценка биологической активности in vivo белка s-tag-BMP-2 в составе остеопластического материала на основе ДКМ на модели краниальных дефектов критического размера у крыс. Результаты использования в данной модели ДКМ без введенного рекомбинантного фактора обсуждены в п. 2 данного раздела отчета. По всем оцененным показателям в группе животных, у которых краниальный дефект заполнялся ДКМ с введенным в него рекомбинантным белком s-tag-BMP-2, значения эффективности регенерации костной ткани оказались максимальными. Аналогичные результаты на модели краниальных дефектов были получены также при использовании белка lz-BMP-2. Результаты опубликованы в статье: Bartov et al. // Bull. Exp. Biol. Med.– 2016.– Vol. 162, No. 2.– P. 273–276 и в тезисах: Громов и др. // XXIII Российский национальный Конгресс «Человек и лекарство», Москва (11–14 апреля 2016 г.).– С. 172–173. (3) Биологическую активность s-tag-BMP-2 исследовали на модели хирургической травмы коленного сустава (иссечение передней крестообразной связки) у крыс при введении сшитого гиалуроната натрия с добавлением и без добавления фактора роста. Животным опытных групп в течение 5 недель проводили еженедельные инъекции материалов в коленные суставы, начиная со второй недели после индуцирования развития остеоартрита. По результатам гистоморфометрического и томографического анализов показано, что при лечении материалом с s-tag-BMP-2 наблюдалось не только замедление развития дегенеративных изменений в пораженном коленном суставе, но и восстановление его функции за счет регенерации и увеличения объема хрящевой ткани, а также улучшения параметров субхондральной кости. В отличие от предыдущих экспериментальных моделей in vivo, на модели травмы коленного сустава фактор роста s-tag-BMP-2 проявляет сочетанную остео- и хондроиндуктивную активность. Результаты опубликованы в тезисах: Громов и др. // XXIII Российский национальный Конгресс «Человек и лекарство», Москва (11–14 апреля 2016 г.).– С. 173. (4) На модели имплантации в строму роговицы кроликов коллагеновой мембраны с фактором роста s-tag-BMP-2 проведена оценка влияния рекомбинантного фактора на морфологию роговицы. Гистологический анализ показал постепенно нарастающее к 84-му дню после операции замещение имплантата соединительной тканью, неоваскуляризацию и утолщение роговицы. Такой подход может быть перспективным для укрепления бельм на различных этапах операции кератопротезирования. Результаты опубликованы в статье: Захаров и др. // Клиническая и экспериментальная морфология.–2016.– №4(20). –C. 36–42. 6. Отработаны условия стерилизации и хранения препаратов рекомбинантных белков BMP-2 и материалов с введенными в них белками BMP-2. 7. Разработана методика иммобилизации рекомбинантных белков BMP-2 на созданных в рамках проекта носителях на основе ДКМ ксеногенного происхождения.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Исследования 2017 года посвящены трем основным направлениям: получению дешевых, активных и высокоочищенных вариантов эритропоэтина для использования в репаративной хирургии; моделированию процессов заживления костной ткани под влиянием эритропоэтина и BMP-2, основного фактора регенерации тканей, и тестированию активности BMP-2, полученного на предыдущем этапе, в различных системах регенерации тканей. 1. Методом микробиологического синтеза в клетках E. coli получены 4 варианта рекомбинантного негликозилированного эритропоэтина, в состав белковой цепи которых включены дополнительные белковые домены для повышения растворимости белков при синтезе, стабилизации белковых молекул и/или для обеспечения удержания белка на носителе: (1) белок MBP-EPO, включающий последовательность мальтозосвязывающего белка (MBP) и последовательность эритропоэтина человека (EPO), (2) белок 6His-MBP-EPO, отличающийся от предыдущего варианта присутствием 6 остатков гистидина на N-конце, (3) белок 6His-s-tag-EPO, содержащий s-tag (15-звенный олигопептид из рибонуклеазы А поджелудочной железы быка) с 6 остатками гистидина (6His) на N-конце и последовательность эритропоэтина человека на C-конце и (4) белок HBD-EPO, содержащий последовательность гепаринсвязывающего домена из костного морфогенетического белка BMP-2 на N-конце и последовательность эритропоэтина на C-конце. MBP-EPO и 6His-MBP-EPO были очищены до гомогенного состояния. Была отработана методика гидролиза белков энтерокиназой. Однако попытки разделения продуктов протеолитического гидролиза – MBP и rhEPO – с помощью колоночной хроматографии оказались безуспешными. Можно предположить, что после протеолиза энтерокиназой MBP и EPO остаются связанными в стойком комплексе из-за противоположных зарядов и, возможно, других видов взаимодействий. Нами был успешно реализован другой подход — введение на N-конец белка дополнительного домена, включающего последовательность из 6 остатков гистидина (6His), s-tag и сайт гидролиза энтерокиназы. Была разработана схема выделения рекомбинантного белка 6His-s-tag-EPO. Также был отработан способ получения rhEPO без дополнительных белковых доменов, включающий протеолитический гидролиз 6His-s-tag-EPO энтерокиназой и последующую очистку. Были подобраны условия рефолдинга белков. Разработанные процедуры очистки и рефолдинга белков 6His-s-tag-EPO и rhEPO позволяют получить белки с нативной структурой, характерной для эритропоэтина. Об этом свидетельствует наличие специфической активности, а также проведенный масс-спектрометрический анализ, показавший присутствие двух дисульфидных связей в молекулах белков. Специфическую активность препаратов эритропоэтина in vitro оценивали в пролиферативном тесте на культуре клеток линии эритролейкемии человека TF-1. Она составляла 13,4% от активности Эпостима (эпоэтина бета, препарата гликозилированного эукариотического эритропоэтина производства ООО «Фармапарк», Россия) для 6His-s-tag-EPO и 12,9% для rhEPO. Вышеизложенные результаты опубликованы в статье Grunina T.M. et al. Recombinant human erythropoietin with additional processable protein domains: purification of protein synthesized in Escherichia coli heterologous expression system. // Biochemistry (Moscow).–2017.–Vol. 82, No. 11.–P. 1285–1294 (https://link.springer.com/article/10.1134/S0006297917110062). Для обеспечения удержания белка на носителе (деминерализованном костном матриксе, ДКМ) при местном введении в область имплантации получен химерный рекомбинантный белок HBD-EPO, содержащий последовательность гепаринсвязывающего домена из костного морфогенетического белка BMP-2 на N-конце и последовательность эритропоэтина на C-конце. Разработан метод хроматографической очистки этого белка. Показано, что он способен эффективно связываться с ДКМ. Удельная активность белка HBD-EPO составляет около 5,5% от активности эпоэтина бета при тестировании in vitro на клеточной модели и in vivo по возрастанию количества ретикулоцитов в крови мышей при подкожном введении белка в смеси с гепарином. Результаты экспериментов c белком HBD-EPO описаны в примерах зарегистрированной в 2017 г. в ФИПС заявки на изобретение (Заявка на патент от 31.10.2017, Рег. № 2017137947). Следует отметить, что белки 6-His-s-tag-EPO и EPO без дополнительного домена в используемой in vivo модели активности не проявили, что, возможно, связано с низкой по сравнению с эукариотическим EPO молекулярной массой негликозилированных белков бактериального происхождения, которые за счет этого очень быстро элиминируются из системного кровотока. При образовании комплекса с гепарином молекулярная масса HBD-EPO увеличивается примерно в два раза, что, по-видимому, способствует увеличению времени его циркуляции в кровотоке. Таким образом рекомбинантный белок HBD-EPO обладает активностью, подтвержденной in vitro и in vivo. Это делает его перспективным кандидатом для применения в целях репарации дефектов костной ткани. Мы предполагаем, что для данного белка разница в активности по сравнению с эукариотическим EPO будет компенсироваться повышением локальной концентрации цитокина за счет его удержания в месте введения благодаря гепаринсвязывающему домену, обеспечивающему прочное связывание с ДКМ. С помощью иммунизации кроликов белком 6His-MBP-EPO, а также Эпостимом с полным и неполным адъювантом Фрейнда получены 2 поликлональные сыворотки. Сыворотка, полученная при иммунизации 6His-MBP-EPO в Вестерн-иммуноблоттинге узнает и MBP, и EPO-домены всех полученных вариантов эритропоэтина, а также, несколько слабее, Эпостим. Сыворотка, полученная при иммунизации препаратом Эпостим, также узнает все варианты эритропоэтина, полученные в проекте, но существенно слабее. Также методом Вестерн-иммуноблоттинга была проверена способность коммерческих моноклональных антител EP1, EP2, EP3, EP5, EP8, EP25 («Биалекса», Россия) взаимодействовать с полученными нами вариантами рекомбинантного эритропоэтина. Было показано, что из шести проверенных вариантов антител только клон EP8 взаимодействует со всеми полученными вариантами рекомбинантного EPO и эпоэтином бета. На основе EP-8 отработана постановка непрямого ИФА, в котором также было показано взаимодействие данных антител с белками s-tag-EPO, HBD-EPO и эпоэтином бета. 2. Для построения схемы математической предиктивной модели остеогенеза, предназначенной для подбора и коррекции концентраций s-tag-BMP-2 и эритропоэтина, входящих в состав разрабатываемых остеопластических материалов, был проведен анализ литературных источников, описывающих основные компоненты в системе имплантат – остеогенные факторы – место имплантации. Остеогенными факторами и их формами, концентрации которых учитываются в модели, являются BMP2a – активная форма BMP-2, стимулирующая образование костной ткани; BMP2b - связанная с носителем неактивная форма BMP2; BMP-2_HSC – активная форма BMP-2, синтезируемая стволовыми гематопоэтическими клетками (HSC, Hematopoetic Stem Cells) при воздействии локальных концентраций активного эритропоэтина; EPOa - активная форма EPO, локальная концентрация в области травмы; EPOin - введенный в место травмы (injected) эритропоэтин (или эритропоэтин, введенный в составе имплантируемого материала); Bone – образуемая костная ткань; Bone source – некий «источник кости» - понятие, обозначающее вещества из которых строится костная ткань, или в которые она переходит при резорбции. Схема модели построена в Cell Designer (http://www.celldesigner.org/) и преобразована в файл математической ODE (Ordinary Differential Expressions) модели на языке SBML (Systems Biology Markup Language, http://sbml.org/Main_Page/). Все взаимодействия в созданной математической модели остеогенеза описаны с помощью закона действующих масс для линейных преобразований и переходов компонентов в модели или уравнения Михаэлиса-Ментен для ферментативных кинетик в программах для работы с биологическими математическими моделями на базе SBML (Copasi и DBSolve). Описанные математически процессы объединены в виде системы дифференциальных уравнений в формате SBML. Для придания созданной модели предиктивных свойств (поведения, близкого к реальной биологической системе) проведен фиттинг (подбор параметров в дифференциальных уравнениях) модели с помощью найденных в литературе наборов данных, количественно характеризующих взаимодействия между компонентами модели и описывающих конечные эффекты воздействия различных концентраций остеогенных факторов. 3. А) Проведена оценка остеоиндуктивных свойств рекомбинантного белка s-tag-BMP-2, полученного на первом году выполнения проекта, иммобилизованного на деминерализованном костном матриксе (ДКМ), на модели регенерации краниальных дефектов критического размера у мышей, а также модели имплантации пористого титанового матрикса в дефекты бедренных и большеберцовых костей кроликов. Полученные данные свидетельствуют о высокой остеоиндуктивности материалов с s-tag-BMP-2. Результаты этих исследований опубликованы в статье Bartov M.S. et al. Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) with Additional Protein Domain Synthesized in E. coli: In Vivo Osteoinductivity in Experimental Models on Small and Large Laboratory Animals. // Bulletin of experimental biology and medicine.–2017.–V. 164, № 2.–P. 148–151 (https://link.springer.com/article/10.1007/s10517-017-3945-1). По результатам данной разработки также получен патент на полезную модель, представляющую собой устройство для вентрального спондилодеза позвоночного двигательного сегмента, ранее разработанное коллегами из Института травматологии и ортопедии им. В.Д. Чаклина, г. Екатеринбург, http://poleznayamodel.ru/model/14/142727.html). Устройство отличается тем, что имплантат выполнен из пористого титана с алмазоподобным покрытием, насыщенного рекомбинантным человеческим костным морфогенетическим белком-2 (Бердюгин К.А. и др. Устройство для вентрального спондилодеза позвоночного двигательного сегмента. Патент на полезную модель № 174104). Б) Активность s-tag-BMP-2 in vivo также была исследована нами в составе сшитого гиалуроната натрия на модели химически индуцированного одностороннего остеоартрита (ОА) коленного сустава крыс. В качестве препарата сравнения использовали широко применяемый в медицинской практике вязкоупругий имплантат для внутрисуставных инъекций Durolane® ("Smith&Nephew", США), представляющий собой сшитый гиалуронат натрия без добавления факторов роста. Характерные патологические изменения, выявляемые макроскопически и гистологически в группе с s-tag-BMP-2 в составе сшитого гиалуроната натрия были достоверно менее выражены, чем в группах с препаратом сравнения и физраствором (p<0,05). Полученные данные свидетельствуют в пользу перспективности дальнейшего изучения препаратов на основе rhBMP-2 с целью их терапевтического применения для лечения остеоартрита. Ранее rhBMP-2 для лечения суставных патологий не использовался. В) Проведена оценка влияния s-tag-BMP-2 в составе коллагеновой мембраны на морфологические и биомеханические характеристики роговицы при имплантации. Работа выполнена на 24 кроликах породы Шиншилла. В результате имплантации в роговицу коллагеновой мембраны с s-tag-BMP-2 наблюдалось изменение морфологии нативной роговицы кролика за счет образования плотной соединительной ткани и улучшение ее биомеханических характеристик. Таким образом, имплантация коллагеновой мембраны с s-tag-BMP-2 является перспективным направлением для укрепления бельм на различных этапах кератопротезирования. Результаты работы опубликованы в статье Захаров В.Д. и др. Влияние фактора роста rhBMP-2 в составе коллагенового носителя на морфологические и биомеханические характеристики роговицы. // Офтальмохирургия.–2016.–№ 4.–С. 20–28 (http://www.ophthalmosurgery.ru/jour/article/view/291). Таким образом, помимо использования материалов с rhBMP-2 для лечения костных патологий, они представляются перспективными для лечения ОА, а также для использования в офтальмологии.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году основной целью работ по проекту было исследование регенеративного потенциала и эффективности применения остеопластических материалов с добавлением полученных нами рекомбинантных белков s-tag-BMP-2 и вариантов эритропоэтина (EPO). В 2017 году были получены несколько вариантов EPO путем микробиологического синтеза в клетках Escherichia coli. В 2018 г. было необходимо продолжить сравнительную характеристику этих белков с целью выявления наиболее перспективных вариантов для использования в экспериментах по регенерации костной ткани. Сравнение свойств проводилось между белком 6His-s-tag-EPO, несущим s-tag (15-звенный олигопептид из рибонуклеазы А поджелудочной железы быка) с 6 остатками гистидина (6His) на N-конце и последовательность эритропоэтина человека на C-конце, и белком HBD-EPO, содержащим последовательность гепаринсвязывающего домена (HBD) из костного морфогенетического белка BMP-2 на N-конце и последовательность эритропоэтина на C-конце. Последовательность s-tag вводилась в белок с целью повысить растворимость белка, последовательность HBD – с целью получить вариант эритропоэтина, способный к самопроизвольному связыванию с носителем – деминерализованным костным матриксом (ДКМ), содержащим гепаран-сульфат, за счет электростатического взаимодействия. В качестве препарата сравнения использовали коммерческий препарат эпостим (эукариотический эритропоэтин производства ООО «Фармапарк», Россия), отличающийся от вариантов EPO, синтезированных в E. coli, большей молекулярной массой за счет гликозилирования. В 2018 году было проведено масс-спектрометрическое исследование белка HBD-EPO (как ранее 6His-s-tag-EPO), которое и в случае HBD-EPO подтвердило нативную укладку молекулы белка в выделенных препаратах и наличие двух характерных дисульфидных связей. Изучение фармакокинетики HBD-EPO и эпостима показало, что при подкожной инъекции HBD-EPO практически полностью выводится из организма за первые 10 часов, в то время как концентрация эпостима в образцах плазмы крови на протяжении 48 ч после введения снижалась слабо. Это подтвердило ранее полученные данные о том, что варианты EPO, полученные синтезом в клетках E. сoli, значительно быстрее выводятся из организма, чем гликозилированные более высокомолекулярные формы, полученные эукариотическом синтезом. При подкожной имплантации дисков из ДКМ, несущих HBD-EPO или эпостим в одинаковых дозах, HBD-EPO проявлял значительно более выраженную, чем у эпостима, местную активность, заключающуюся в способности индуцировать васкуляризацию тканей. Вероятно, это объясняется тем, что HBD-EPO, в отличие от эпостима, способен удерживаться на ДКМ, что обеспечивает пролонгированное действие белка в месте имплантации. Ввиду быстрого выведения из организма вариантов эритропоэтина, синтезированных в клетках E. coli, единственным адекватным способом доставки этих вариантов белка для регенерации костной ткани является местная аппликация в составе имплантируемого материала. Такой вариант введения мог бы обеспечить полученный нами белок HBD-EPO, однако, как показано в 2017 году, он обладает пониженной активностью in vitro по сравнению с эпостимом и даже по сравнению с 6His-s-tag-EPO, полученным также микробиологическим синтезом. Активность in vitro и, как следствие, другие виды биологической активности белка могут быть улучшены с помощью методов белковой инженерии, таких, как перестановка доменов и их пространственное разобщение за счет вставки более длинного и более жесткого междоменного спейсера. Руководствуясь этими соображениями, в 2018 году были проведены работы по получению другого варианта эритропоэтина – EPO-HBD. EPO-HBD отличается от HBD-EPO обратным расположением доменов и наличием более жесткого и длинного междоменного спейсера, состоящего из 8 повторов остатков аланина и пролина вместо 3 повторов глицина и серина у HBD-EPO. Была проведена характеристика свойств полученного белка в сравнении с ранее полученными нами вариантами EPO и эпостимом. Для очищенного белка EPO-HBD, а также белков 6His-s-tag-EPO, HBD-EPO и эпостима в ходе одного и того же эксперимента была измерена активность in vitro на культуре клеток линии TF-1 эритролейкемии человека. EC50 для эпостима составила 0,68 нг/мл, для 6His-s-tag-EPO, EPO-HBD и HBD-EPO – 4,3; 24,15 и 319,40 нг/мл соответственно, что свидетельствует о существенном улучшении in vitro активности EPO-HBD по сравнению с HBD-EPO (в 13,5 раз). Результаты определения активности in vitro на культуре клеток эритролейкемии согласуются с данными сравнительной оценки аффинности белков к рецептору эритропоэтина (EPOR), полученными методом биослойной интерферометрии. По степени снижения скорости ассоциации с EPOR белки располагаются в порядке: эпостим (максимальная скорость ассоциации) - 6His-s-tag-EPO - EPO-HBD - HBD-EPO, что соответствует порядку снижения активности in vitro. Для оценки связывания исследуемых белков c носителем ДКМ были проведены эксперименты по исследованию кинетики связывания/выхода белков из дисков ДКМ. Максимальное количество белка связалось с ДКМ в случае EPO-HBD. Наименьшее связывание и самый низкий выход из ДКМ продемонстрировал белок 6-His-s-tag-EPO, в составе которого отсутствует гепарин-связывающий домен. Также был проведен расширенный эксперимент по изучению способности белков 6His-s-tag-EPO, HBD-EPO, EPO-HBD и эпостима индуцировать васкуляризацию тканей при местном введении на ДКМ. Максимально выраженную способность стимулировать васкуляризацию тканей продемонстрировал белок EPO-HBD. Вводить эритропоэтин в организм с целью изучения возможности его использования для регенерации костной ткани можно двумя способами – инъекционным (дробное подкожное введение рядом с местом имплантации) и местным – однократное введение в место имплантации в составе имплантируемого материала. Для инъекционного способа введения белок должен обладать способностью достаточно долго персистировать в организме, для местного – удерживаться на носителе и медленно и постепенно выходить из него. Поскольку варианты EPO, полученные синтезом в клетках прокариотических продуцентов, выводятся из кровотока значительно быстрее вариантов EPO, полученных эукариотическим синтезом, для экспериментов по инъекционному введению был выбран эпостим, полученный в эукариотическом продуценте. Для местного введения были выбраны HBD-EPO и полученный позднее EPO-HBD, обладающий улучшенными свойствами по сравнению с HBD-EPO. В 2018 году были проведены пилотные эксперименты по совместному действию s-tag-BMP-2 и EPO на регенерацию костной ткани, в ходе которых была показана принципиальная возможность улучшения параметров регенерации при дополнительном введении EPO – как инъекционном, так и местном. В ходе пилотных экспериментов были предварительно определены дозы белковых факторов и сроки наблюдения для основных экспериментов. На основании литературных данных и полученных нами экспериментальных данных подобран оптимальный набор параметров предиктивной модели, описывающей процесс регенерации костной ткани при имплантации материала с факторами BMP-2 и EPO. Модель адекватно описывает наблюдающиеся в эксперименте явления и может быть использована при подборе доз и соотношений факторов для достижения оптимальных параметров репарации дефектов костной ткани. Данные, полученные в пилотных экспериментах, и результаты моделирования были использованы для выбора концентраций факторов при исследовании совместного действия s-tag-BMP-2 и эпостима на регенерацию краниальных дефектов костной ткани критического размера у мышей. На диски ДКМ наносили s-tag-BMP-2 в количестве 1 и 10 мкг, эпостим в дозе 6000 ME/кг вводили за 6 инъекций c интервалом в 2 дня. При обеих концентрациях s-tag-BMP-2 добавление эпостима оказало положительный эффект на регенерацию костной ткани. Наиболее выраженное влияние на остеогенез наблюдалось при меньшей концентрации s-tag-BMP-2 (1 мкг). Это означает, что при сочетанном действии BMP-2 и EPO концентрация BMP-2 может быть значительно снижена, что уменьшит риск возникновения нежелательных реакций. В эксперименте по совместному применению s-tag-BMP-2 в дозе 1 мкг и EPO-HBD в дозе 10 мкг, иммобилизованных на дисках из ДКМ, для регенерации краниальных дефектов критического размера у мышей показано, что: 1) введение EPO в дополнение к s-tag-BMP-2 приводит к существенному приросту доли новообразованной минерализованной костной ткани, начиная со срока 3 недели; 2) гистоморфометрия образцов на сроке 3 недели показала большую долю костной ткани и наличие костного мозга у животных группы ДКМ + s-tag-BMP-2 + EPO по сравнению с группой ДКМ + s-tag-BMP-2. Результаты, полученные в данном эксперименте, оказались практически идентичными результатам, полученным в эксперименте, где вместо EPO-HBD был использован эпостим, способ введения был не местный, а инъекционный, и s-tag-BMP-2 вводили на дисках из ДКМ в концентрации 1 мкг. Это говорит о том, что EPO прокариотического происхождения может быть с успехом использован для улучшения количественных и качественных параметров костной ткани в процессе регенерации. Местный однократный способ введения фактора имеет очевидные преимущества перед многократным инъекционным, что делает полученный в проекте белок EPO-HBD перспективным с точки зрения разработки на его основе препаратов для реконструктивной медицины. Проведено исследование токсичности остеопластических материалов с белковыми факторами s-tag-BMP-2, EPO-HBD и s-tag-BMP-2 + EPO-HBD при однократном введении лабораторным животным. Показано, что остеопластические материалы вне зависимости от содержащегося белкового фактора безопасны при однократном введении мышам и могут быть рекомендованы к использованию в реконструктивной хирургии. Подобраны условия иммобилизации на ДКМ рекомбинантных белков s-tag-BMP-2 и HBD-содержащих вариантов эритропоэтина. Определены условия лиофильного высушивания остеопластических материалов с нанесенными рекомбинантными белками и условия стерилизации и хранения. Установлен срок хранения остеопластических материалов. Основные результаты 2018 года: 1) при использовании двух различных способов введения эритропоэтина (местного и инъекционного) для двух различных вариантов эритропоэтина (про- и эукариотического происхождения) на модели восстановления краниальных дефектов критического размера у мышей показано, что при совместном применении s-tag-BMP-2 с эритропоэтином практически полное восстановление дефекта костной ткани может быть достигнуто за 6 недель при низкой концентрации s-tag-BMP-2 (1 мкг на дефект). Совместное применение BMP-2-содержащих материалов с разрешенными для клинического применения вариантами эритропоэтина может помочь усовершенствовать и сделать более безопасными существующие схемы лечения. 2) Полученный нами вариант эритропоэтина EPO-HBD, синтезированный в клетках E. coli, способен в сочетании с низкими дозами s-tag-BMP-2 приводить к эффективной репарации дефектов костной ткани при местном введении в составе имплантата, что делает перспективным его применение в реконструктивной медицине. Результаты работы за 2018 год опубликованы в трех статьях в изданиях, индексируемых в базах данных «Web of Science» и/или «Scopus»: 1) Karyagina A.S. et al. Biochemistry (Moscow).–2018.–Vol. 83, No. 10.–P. 1207–1221. https://link.springer.com/ article/10.1134/S0006297918100061; 2) Karyagina A.S. et al. Biochemistry (Moscow), 2019 (in press). doi: 10.1134/S000629791901005X, http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/ inpress/pdf/BM18-197.pdf; 3) Gromov A.V. et al. Bulletin of experimental biology and medicine.–2019 (in press). По результатам работы получен 1 патент: Патент на изобретение № 2664192. Опубликовано: 15.08.2018 Бюл. № 23. http://www.findpatent.ru/ patent/266/2664192.html. Результаты работы представлены в 5 докладах на двух конференциях: http://www.biomos.ru/conference/articles.htm, https://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2018/index.htm.