Аннотация результатов, полученных в 2016 году
На первом этапе проекта изучена возможность активации резидентных с-kit+ стволовых клеток сердца (СКС) при экспрессии в миокарде крысы с моделью инфаркта факторов роста (VEGF и HGF). При исследовании влияния плазмидной экспрессии VEGF и HGF в периинфарктной зоне сердца крысы на аккумуляцию с-kit+CКС (с-kit+, СD45-) было установлено, что количество этих клеток в периинфарктной зоне возрастает в группах животных, которым в нее вводили плазмиду с геном VEGF, HGF, а также комбинацию этих плазмид с генами по сравнению с количеством этих клеток у животных контрольной группы, которым вводили «пустой» вектор. Однако, достоверно более выраженная аккумуляция этих клеток в периинфарктной зоне определялась только у животных, которым вводили плазмиду с HGF или комбинацию плазмид. Это, вероятно, обусловлено тем, что именно HGF, рецепторы к которому присутствуют на поверхности СКС, является фактором, регулирующим миграцию этих клеток из предсердных и верхушечных ниш в область инфаркта. Помимо с-kit+CКС в регенеративных процессах в сердце участвуют мультипотентные прогениторные клетки эпикарда (WT1+) которые дифференцируются в основном в эндотелиальные и гладкомышечные клетки, мигрируют в поврежденный миокард и участвуют в неоангиогенезе. Ключевым этапом в мобилизации пула клеток эпикарда является активация эпителиально–мезенхимального перехода, преводящая к приобретению ими мезенхимального фенотипа, повышению миграционных, адгезивных свойств, устойчивости к апоптозу и индукции секреторной активности. В группах HGF и VEGF+HGF наблюдалось увеличение количества клеток данного типа в периинфарктной зоне, но наиболее значительное увеличение их количества отмечалось в группе HGF. Таким образом, плазмидная экспрессия HGF и VEGF+HGF в периинфарктной зоне сердца крысы способствует аккумуляции как с-kit+резидентных стволовых клеток сердца, так и мультипотентных прогениторных клеток эпикарда в периинфарктной зоне. Исследование влияния экспрессии этих факторов на процессы васкуляризации миокарда показало, что введение плазмид с генами VEGF и HGF вызывало стимуляцию ангиогенеза в периинфарктной зоне, что проявлялось большим количеством капилляров (CD31+ структур без видимого просвета) в сравнении с введением пустой плазмиды. Совместное введение плазмид VEGF+HGF приводило к увеличению ангиогенного эффекта по сравнению с введением плазмиды с одним фактором. Каких-либо корреляционных зависимостей между аккумуляцией с-kit+СКС и мультипотентных прогениторных клеток эпикарда в периинфарктной зоне с количеством сосудов (капилляров или артериол) обнаружено не было. Количество пролиферирующих кардиомиоцитов в периинфарктной зоне в группах HGF и комбинации плазмид (HGF+VEGF) было больше, чем в контрольной группе, в то время как в группе VEGF оно не отличалось от контроля. Проведенные морфометрические исследования показали, что достоверное уменьшение размера постинфарктного фиброза (рубца) на 14-й день, что может отражать уменьшение размера инфаркта, наблюдалось только в группе животных, которым вводили комбинацию плазмид (HGF+VEGF). Введение плазмид с генами VEGF и HGF и их комбинации препятствовало истончению поврежденной стенки левого желудочка, но только в группе VEGF+HGF наблюдалось достоверное уменьшение распространенности трансмурального повреждения. Это соотносилось с большим количеством пролиферирующих кардиомиоцитов в периинфарктной зоне и более выраженным ангиогенезам в миокарде. Таким образом, полученные данные подтвердили возможность стимуляции эндогенных регенеративных процессов в сердце с помощью плазмидной экспрессии факторов роста в постинфарктном миокарде. Разработана методика генетической модификации ММСК крысы с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса, несущего ген SDF-1 или SCF. На основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса сконструированы вирусные векторы, несущие кДНК генов SDF1 и SCF крысы. Разработан оптимальный протокол генетической модификации ММСК крысы рекомбинантным ААВ, позволяющим получить до 80% трансдуцированных клеток. Получены модифицированные ММСК жировой ткани крысы, гиперэкспрессирующие и продуцирующие SDF1 и SCF. Исследовано влияния модификации на основные функции ММСК жировой ткани крысы: жизнеспособность/пролиферацию, дифференцировочные способности, экспрессию и секрецию биологически активных молекул. Мы показали, что жизнеспособность/пролиферация модифицированных ММСК (как с SDF-1, так и с SCF) значимо снижается по сравнению с нетрансдуцированными ММСК, при этом не происходит клеточной гибели, но скорость прироста числа модифицированных ММСК оказалась существенно ниже, чем у контрольных клеток, что свидетельсвтует о замедлении пролиферации генетически модифицированных ММСК. В тоже время генетическая модификация не влияла на способность ММСК к быстрой адгезии на белки внеклеточного матрикса: коллаген 1 типа, витронектин, фибронектин и фетальную бычью сыворотку. Генетическая модификация также не изменяла способности ММСК к индуцированным дифференцировкам в адипогенном, остогенном, эндотелиальном и кардиомиоцитарном направлениях. При исследовании влияния генетической модификации на экспрессию и секрецию биологически активных факторов мы обнаружили значительное увеличение мРНК матриксной металлопротеиназы MMP9 и снижение экспрессии мРНК матриксного белка фибронектина в модифицированных клетках ( как SDF-1a, так и SCF). Экспрессия FGF2,TGF-b, VEGF, MMP2, IGF-1 и коллагена 1 , а также рецептора SDF-1a CXCR4- не изменялась. Интересной находкой, требующей дальнейшего изучения, является обнаруженное нами усиление экспрессии воспалительного цитокина TNF-a в модифицированных SDF-1а ММСК. При исследовании содержания ММР9 и TNF-a в кондиционированной среде модифицированных ММСК мы обнаружили их увеличение ММР9 в клетках, продуцирующих SDF-1а и SCF, и увеличение TNF-a по в клетках, продуцирующих SDF-1а по сравнению с немодифицированными клетками. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что генетическая модификация ММСК жировой ткани крысы ААВ, несущим гены SDF-1a и SCF крысы, снижает пролиферативную активность клеток, не влияет существенно на их способность к адгезии на матриксные белки, не влияет на их сопособность к характерным дифференцировкам в адипогенном и остеогенном направлениях, а также в эндотелиальном и кардиомиоцитарном направлениях. Генетическая модификация ААВ с генами SDF-1a и SCF сопровождается помимо увеличения экспрессии этих генов, возрастанием экспрессии гена ММР9 и TNF-a и их секреции модифицированными клетками, что требует дальнейшего изучения в плане оценки влияния на формирование модифицированными клетками клеточных пластов. Изучено влияние продуктов секреции генетически модифицированных ММСК на функциональное состояние резидентных стволовых клеток сердца. Полученные результаты показали, что продукты секреции модифицированных ММСК, продуцирующих SCF и SDF-1, оказывают значительный стимулирующий эффект на жизнеспособность c-kit+ СКС крысы, сравнимый по силе с эффектом фетальной сыворотки и превышающий эффект важнейшего регулятора пролиферации этих клеток IGF-1. В меньше степени выражено повышение миграционного эффекта продуктов секреции модифицированных ММСК в сравнении с немодифицированными ММСК, что, вероятно, обуловлено недостаточной концентрацией SCF и SDF-1a в кондиционированных средах для проявления полного хемотактического эффекта. Продукты секреции модифицированных ММСК стимулируют формирование кардиосфер in vitro и способствуют значительному увеличению их размера. Анализ влияния продуктов секреции генетически модифицированных ММСК на экспрессию генов факторов роста в клетках кардиосфер с помощью ПЦР в реальном времени показал, что культивирование клеток кардиосфер в присутствии кондиционированной среды ММСК-SDF повышает экспрессию в клетках кардиосфер VEGF, HGF и IGF1, а в присутствии кондиционированной среды ММСК- SCF – только IGF1. Все эти факторы роста регулируют жизнеспособность, пролиферацию, миграцию как самих клеток кардиосфер, так и кардиомиоцитов и эндотелиоцитов. В целом эти результаты указывают на повышение регенеративных свойств ММСК при их генетической модификации, усиливающей продукцию SCF и SDF-1a, что обосновывает их использование для трансплантации в поврежденный миокард с целью стимуляции его репарации/регенерации.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
На втором этапе проекта было продолжено изучение регенеративного потенциала генетически модифицированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) жировой ткани, экспрессирующих гены SCF и/ или SDF. Для этого было проведено: 1.Исследование секреции внеклеточных везикул (микровезикул и экзосом) генетически модифицированными ММСК, продуцирующими SDF-1 или SCF, состав везикул и их влияние на функции СКС и апоптоз культивированных кардиомиоцитов. 2.Разработана методика получения многослойных клеточных конструкций (cell sheets) из генетически модифицированных ММСК, продуцирующих SDF-1 или SCF, и исследованы характеристики ММСК в составе этих конструкций. 3.Исследовано влияние прямых контактов между СКС и ММСК на функциональные характеристики СКС в составе комбинированных многослойных конструкций (cell sheets), состоящих из СКС и ММСК. Для изучения эффектов внеклеточных везикул (ВВ), секретируемых данными клетками, была разработана методика их выделения и очистки, изучены основные параметры ВВ ММСК ЖТ крысы. Было показано, что ВВ, высвобождаемые ММСК, в основном имеют размер от 80 до 160 нм и обладают характерной для таких частиц чашевидной формой. Иммунофенотип этих структур также представлен специфичными для ВВ маркерами CD81, CD63, HSP70, CD9, а кроме того содержит поверхностные маркеры ММСК, такие как CD73, CD90. Протеомный анализ и анализ на содержание рибонуклеиновых кислот показал наличие во ВВ ММСК более 100 различных белков и несколько десятков микроРНК. Были обнаружены различия в белковом составе везикул, полученных от генетически модифицированных и немодифицированных клеток. Так, во ВВ генетически модифицированных ММСК, гиперэкспрессирующих SCF, был обнаружен SCF, а также хемокин MCP-3, чего не было во ВВ немодифицированных клеток или во ВВ ММСК-GFP. Регенеративный потенциал ВВ от ММСК был оценен по их влиянию на стволовые клетки сердца (CКC) крысы, экспрессирующие специфический маркер c-kit, на дифференцированные неонатальные кардиомиоциты крысы, а также на кардиосферы, как экспериментальную модель тканевой ниши СКС. Несмотря на то, что везикулы эффективно проникали и в культивируемые клетки сердца и в кардиосферы, не было обнаружено каких-либо значимых эффектов этих частиц. Они не влияли на пролиферативную и миграционную активность СКС, пролиферацию и апоптоз кардиомиоцитов. Различий между действием ВВ, полученных от модифицированных и немодифицированных ММСК не было обнаружено. Мы также выяснили, что ВВ не оказывают существенного влияния на сборку кардиосфер и их клеточный состав. В целом, полученные в данной части работы результаты не выявили значимых эффектов изолированных ВВ как модифицированных, так и немодифицированных ММСК крысы, на функции клеток сердца, важные для регенеративных процессов. В то же время, эти эффекты наблюдались у целой кондиционированной среды этих клеток, что указывает на более значимый вклад секреции растворимых факторов. Не исключена возможность того, что ВВ оказывают специфическое действие на другие процессы, важные для регенерации тканей, например, ангиогенез или дифференцировку стволовых клеток. Оценка этих эффектов не планировалась на данном этапе, но она будет проведена на следующем этапе работы. Стоит также учитывать, что представленные данные получены в условиях экспериментов in vitro, что не исключает возможного существования регенеративного терапевтического потенциала внеклеточных везикул ММСК in vivo, что также будет проверено на следующем этапе. В другой части работ по проекту была разработана оптимальная методика получения многослойных конструкций из пластов клеток (cell sheets), образованных генетически модифицированными и немодифицированными ММСК. Было показано, что ММСК сохраняют свой иммунофенотип в составе таких конструкций, характеризуются низкой долей апоптоза и пролиферации, активно синтезируют внеклеточный матрикс. При этом генетическая модификация не препятствует получению cell sheets и не оказывает влияния на описанные параметры. Отработан метод создания комбинированных клеточных конструкций, состоящих из ММСК и СКС. Было показано, что разные типы клеток особым образом распределяются в таких cell sheets. CКС, занимают положение по краям комбинированной конструкции, а в срединной части локализуются преимущественно ММСК. При этом между двумя типами клеток формировались плотные щелевые контакты, что было продемонстрировано окрашиванием на коннексин 43. Образование контактов между клетками было выявлено и в условиях со-культивирования ММСК и СКС. Интересным фактом является продемонстрированное нами значительное (более чем в 2 раза) увеличение пролиферации клеток в комбинированном пласте. Необходимо отметить, что боле, чем 70% активно пролиферирующих клеток обнаружено в краевых зонах клеточного пласта, богатых СКС. Мы также показали, что в комбинированном клеточном пласте наблюдается активация сигнального пути Notch, опосредующего межклеточную коммуникацию. Полученные данные свидетельствуют не только об экспрессии рецепторов Notch лигандов, но также об увеличении экспрессии Notch эффекторного гена Hes1 в клетках комбинированных клеточных пластов. Принимая во внимание тот факт, что активация Hes 1 типична для эндотелиальных клеток мы далее исследовали экспрессию раннего маркера эндотелиальной дифференцировки ETS1 в клетках комбинированного пласта. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что более 30% клеток комбинированных клеточных пластов являются позитивными по ETS 1, что может указывать на вступление их в эндотелиальную дифференцировку. Таким образом, формирование клеточных пластов из ММСК и СКС способствует пролиферации клеток и их эндотелиальной дифференцировке, что может быть важным для более быстрой васкуляризации клеточного пласта после трансплантации. Все задачи 2017 года выполнены полностью, что обеспечивает основу для выполнения задач 2018 года, направленных на изучение регенеративных эффектов трансплантации клеточных пластов из генетически модифицированных ММСК на модели инфаркта миокарда.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение третьего года выполнения работ по проекту была отработана методика эпикардиальной имплантации многослойных клеточных конструкций (клеточных пластов - cell sheets) из модифицированных МСК, продуцирующих SCF, на модели инфаркта у крыс и проведена оценка состояния клеток в имплантате, степень его васкуляризации и интеграции в ткань сердца. Для этого клетки имплантата метили витальным красителем перед имплантацией и анализировали жизнеспособность клеток в составе многослойного клеточного пласта после его эпикардиальной имплантации крысам с инфарктом миокарда, степень их интеграции в прилегающую ткань сердца, а также васкуляризацию самого клеточного пласта как один из факторов, опосредующих его приживление и долгосрочность терапевтического эффекта от его применения. При этом начиная с 5 дня после имплантации наблюдалась интеграция клеточного графта в подлежащие слои миокарда и миграция флуоресцентно меченых клеток в окружающую ткань. Трансплантированные клетки сохраняли продукцию SCF, о чем свидетельствует иммунофлуоресцентное окрашивание специфическими антителами. Клетки внутри имплантата активно пролиферировали (иммуногистохимическое окрашивание на бромдезоксиуредин), небольшое количество клеток находилось в апоптозе (окрашивание на активированную каспазу 3). Клетки имплантата не дифференцировались в остеогенном или адипогенном направлении, а также в кардиомиоцитарном направлении. Выявлено наличие распространенной сосудистой сети внутри меченого клеточного пласта уже через 5 дней после его трансплантации. При этом, часть трансплантированных клеток (меченых красителем) ко-экспрессировала маркер эндотелия CD31, что косвенно указывает на их участие в формировании новых сосудов, вероятно, за счет инкорпорации в стенку прорастающих в имплантат сосудов. Исследовано влияния эпикардиальной имплантации многослойных клеточных пластов (cell sheets) из модифицированных МСК на эндогенные регенеративные процессы, ремоделирование и функцию сердца после инфаркта, ангио-артериогенез, развитие фиброза, воспалительные реакции. Морфометрия показала снижение доли рубцовой ткани в стенке левого желудочка в группе МСК- SCF по сравнению с контрольной группой без лечения и группой МСК – GFP. Трансплантация клеточных пластов из МСК препятствовала истончению стенки ЛЖ в области инфаркта – толщина в группах МСК- GFP и МСК- SCF была достоверно больше, чем в контрольной группе. Это способствовало меньшей дилатации полости ЛЖ. Гистологический анализ области рубцовой ткани показал, что при трансплантации клеточных пластов, экспрессирующих SCF, зона жизнеспособного миокарда (площадь сохраненных островков мышечной ткани в зоне фиброза по отношению к площади рубца) была достоверно выше, чем в других группах, и составляла 29,6±4,0%, что было достоверно больше, чем в группе трансплантации клеточного пласта из МСК, экспрессирующих GFP (11,1±2,5%) и не отличался от такового (12,7±0,9%) в группе без лечения (12,7±0,9%) (p<0,05). При этом уровень апотоза в клетках области рубца, оцениваемый окрашиванием срезов ткани на активированную каспазу 3, не различался в группах трансплантации пластов из МСК, но был ниже, чем в группе без лечения. Таким образом, имплантация пластов из МСК способствует сохранению жизнеспособного миокарда в области рубца, что в свою очередь препятствует истончению стенки левого желудочка в области инфаркта и развитию постинфарктного ремоделирования левого желудочка. При трансплантации клеточных пластов из МСК-GFP и МСК - SCF наблюдалось значительное увеличение числа сосудов с просветом в зоне повреждения под трансплантатами, наиболее выраженное в группе МСК – SCF. Помимо этого трансплантация пластов из МСК-SCF способствовала аккумуляции в зоне трансплантации клеток, которые несут CD117 — рецептор к SCF, среди которых отмечены гематопоэтические клетки-предшественники костного мозга, резидентные прогениторные клетки сердца (c-kit+), тучные клетки, которые могут вносить свой вклад в стимуляцию артериогенеза и регенеративных процессов. Более того, эпикардиальная имплантация клеточных пластов из МСК приводила к значительному повышению количества активированных клеток эпикарда (WT1+) клеток в зоне эпикарда и субэпикардиальной зоне, причем этот эффект наиболее выражен в группе трансплантации пласта из МСК-SCF. При исследовании функции сердца отмечена тенденция к ее увеличению в группе МСК-SCF, но не достигающая достоверности. Таким образом, в результате выполнения задач 3 года проекта отработана методика эпикардиальной имплантации многослойных клеточных конструкций (клеточных пластов - cell sheets) из модифицированных МСК, продуцирующих SCF, на модели инфаркта у крыс и продемонстрированы регенеративные эффекты такой трансплантации, что создает основу для дальнейшей разработки метода клеточной кардиомиопластики на основе использования клеточных пластов из модифицированных аденоассоциированным вирусом МСК, продуцирующих SCF, для лечения больных с тяжелой ишемической кардиомиопатией.