Аннотация результатов, полученных в 2016 году
После адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии у крыс, наркотизированных пентобарбиталом, воспроизводили коронароокклюзию (20 мин) и реперфузию (3 ч), после чего оценивали соотношение зона инфаркта/область риска (ЗИ/ОР). Фармакологические агенты вводили внутривенно за 15 мин до коронароокклюзии. Результаты исследований свидетельствуют о том, что инфаркт-лимитирующий эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии (ХННГ) зависит от активации индуцибельной NO-синтазы. Установлено, что в кардиопротекторном эффекте ХННГ задействована протеинкиназа С. Ингибитор тирозинкиназ генистеин ослаблял, но не устранял инфаркт-лимитирующий эффект адаптации к гипоксии. Другие киназы (PI3-киназы и MEK/ERK1/2-киназ) не участвовали в реализации защитного действия ХННГ. После гипоксического прекондиционирования (ГП) у крыс, наркотизированных хлоралозой, воспроизводили коронароокклюзию (45 мин) и реперфузию (2 ч), после чего оценивали соотношение ЗИ/ОР. Фармакологические агенты вводили внутривенно за 15 мин до ГП. Установлено, что эндогенные агонисты аденозиновых и опиоидных рецепторов не участвуют в гипоксическом прекондиционировании . Участники проекта обнаружили, что инфаркт-лимитирующий эффект ГП связан с активацией индуцибельной NO-синтазы. Было показано, что кардиопротекторный эффект гипоксического прекондиционирования зависит от активации протеинкиназы С. Другие киназы (тирозинкиназы, PI3-киназа, MEK/ERK1/2-киназа) не участвуют в ГП. Установлено, что в реализации инфаркт-лимитирующего действия ГП важную роль играют митоКАТФ-каналы. В ходе выполнения экспериментов было показано, что 2-меркаптопропионилглицин устраняет инфаркт-лимитирующий эффект ГП, в то время как тролокс и темпол не влияют на протекторный эффект гипоксического прекондиционирования. Известно, что тролокс и темпол непосредственно взаимодействуют со свободными радикалами, в то время как 2-МПГ является восстановителем сульфгидрильных групп [Меньщикова Е.Б. и др., 2006]. Уместно предположить, что свободные радикалы, с которыми взаимодействует тролокс и темпол, не участвуют в прекондиционировании. Мы предполагаем, что в ГП участвуют АФК с которыми реагирует 2-МПГ. Возможно, что 2-МПГ напрямую не реагирует с этими АФК, но предотвращает окисление сульфгидрильных групп под действием АФК.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Работа выполнена на аутбредных конвенциональных крысах-самцах Вистар массой 250 – 320 г. Хроническую непрерывную нормобарическую гипоксию (ХННГ) проводили путем непрерывного содержания крыс в специальной герметичной камере, содержание кислорода в которой было снижено до 12% в течение 21 дня. Экспериментальные исследования на изолированном сердце проведены с использованием метода Лангендорфа – ретроградной перфузии миокарда через аорту раствором Кребса-Хензелайта. Показатели насосной функции сердца измеряли в изо-волюмическом режиме с помощью датчика давления SS13L (Biopac System Inc., Goleta, Калифорния, США), сопряженного с баллончиком, помещенным в полость левого желудочка. Запись изменения дав¬ления в левом желудочке и оличественную обра¬ботку параметров осуществляли с помощью аппарата для электрофизиологиче¬ских исследований MP35 (Biopac System Inc., Goleta, США) и программного обеспечения INSTBSL-W компании Biopac System Inc., (Goleta, США). Степень повреждения кардиомиоцитов оценивали по активности креатинфосфокиназы (КФК) в оттекающем от сердца перфузате, которую определяли с помощью коммерческих энзиматических наборов фирмы "Biocon CK-Nac" «Analiticon Biotechnologies» (Lichtenfeis, Германия). Тотальную ишемию изолированного сердца проводили прекращением подачи перфузионного рствора на 45 минут и последующим возобновлением перфузии на 30 мин. Выделение изолированных кардиомиоцитов из сердца крысы проводили энзиматическим методом с применением коллагеназы в буфере Тироде (в мМ): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1 Na2HPO4, 1 MgCl2.6H2O, 10 глюкоза, 5 HEPES, 1,6 г/л БСА, коллагеназа тип II 335 U/мл (Worthington) и протеаза XIV 0,230 г/л (Sigma) в течение 15-25 минут до размягчения миокарда. Для стабилизации выделенные клетки инкубировали в течение 1 часа при температуре +28оС под протоком 5% СО2 в СО2-инкубаторе MCO-5AC (SANYO, Япония). Для моделирования аноксии клетки 20 минут инкубировали в модифицированном буфере Кребса (аноксическом буфере), содержащем (в мМ): 118 NaCl, 25 NaHCO3, 4.7 KCl, 1.2 MgSo4, 1.2 KH2PO4, 5 2-дезоксиглюкозы, рН 7,4. Для предотвращения доступа кислорода на поверхность суспензии наслаивали 5-6 капель минерального масла. Реоксигенацию кардиомиоцитов осуществляли в бескальциевом буфере Тироде в течение 30 минут. Выживаемость клеток оценивали по включению трипанового синего на микроскопе Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss Surgical GmbH, Германия). В инкубационной среде проводили определение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с применением наборов Fluitest LDH-L (Analytical biotechnologies AG, Германия) на спектрофотометре INFINITE 200М (Текан, Австрия). Контролем служили клетки, ресуспендированные на время равное аноксии (20 минут) в бескальциевом растворе Кребса, содержащем (в мМ): 118 NaCl, 25 NaHCO3, 11 глюкоза, 4,7 KCl, 1,2 MgSo4, 1,2 KH2PO4, рН 7,4, далее в течение 30 минут в бескальциевом буфере Тироде (нормоксия). Гибель клеток и выход ЛДГ при аноксии-реоксигенации вычисляли в процентах от нормоксии (инкубация с буфером Кребса). Исследование функционального состояние митохондрий миокарда крыс проводили после моделировании тотальной ишемии-реперфузии на изолированном перфузируемом сердце. Выделение митохондрий из ткани миокарда проводили методом дифференциального центрифугирования при +2°C - +4°C в растворе (мМ) 70 сахарозы, 210 манитола, 1 EGTA, 10 HEPES, 5 мг/мл БСА V фракции, pH 7,4, при 200-700g, далее для осаждения митохондрий при 12000g. Оценка параметров дыхания митохондрий проводилась по поглощению ими кислорода в герметичной термостатируемой камере при помощи Кларковского кислород-чувствительного электрода ДКТП-02.4 прибором pH-метр-иономер «Эксперт–001» (Москва, Россия) в насыщенном кислородом растворе, содержащим (мМ) 200 сахарозы, 10 Trizma base, 5 KH2PO4, 10 ЭГТА, 2,5 мг/мл БСА V фракции, pH 7.4, 25оC, в присутствии/отсутствии 200 нM АДФ. Измеряли скорость поглощения кислорода в присутствии НАДН-зависимых субстратов 3 мМ малата и 3 мМ пирувата или FAD-зависимое дыхание в присутствие 5 мМ сукцината, после добавления 200 нМ АДФ и когда синтез АТФ был завершен. Измерение трансмембранного потенциала (дельта фи) митохондрий проводили с использованием химического катионного флуоресцентного зонда этиловый эфир тетраметилродамина (TMRE, Molecular Probes) на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5301-PC (Шимадзу, Япония) в режиме реального времени при длинах волн возбуждения/излучения Ex=550/Em=575 нм соответственно. О величине трансмембранного потенциала митохондрий судили по падению интенсивности флюоресценции TMRE при добавлении 0,1 мкM FCCP. Состояние mPTP-поры оценивали по способности изолированных митохондрий накапливать и удерживать ионы Ca2+. Для этого в суспензии митохондрий в режиме реального времени исследовали динамику концентрации экстрамитохондриального кальция с использованием флуоресцентного Са2+-чувствительного зонда Calcium Green-5N (Molecular Probes) при длинах волн возбуждения/излучения Ex=506/Em=535 нм на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5301-PC (Шимадзу, Япония) при добавлении хлорида кальция потциями по 100 нМ. Исследование содержания АТФ проводили в ткани миокарда после окончания реперфузии, с помощью биолюминесцентного анализа наборами фирмы Sigma, США (FL-AA), на биолюминометре Lucy-2 (Anthos labtec instruments, Salzburg, Austria). Для оценки роли опиоидных рецепторов в формировании адаптационной устойчивости миокарда при ХННГ, антагонисты опиоидных рецепторов добавляли в перфузионный раствор, омывающий изолированное сердце или в суспензию изолированных кардиомиоцитов животных, предварительно подвергнутых хронической гипоксии. Антагонист всех типов опиоидных рецепторов налоксон использовали в концентрации 300 нМ/л; антагонист дельта-опиоидных рецепторов TIPP(пси) - 30 нМ/л; селективный антагонист дельта1-опиоидных рецепторов BNTX - 1 нМ/л; селективный антагонист дельта2-опиоидных рецепторов налтрибен - 1 нМ/л; антагонист мю-опиоидных рецепторов CTAP - 100 нМ/л; антагонист каппа-опиоидных рецепторов норбиналторфимин - 3 нМ/л. В исследовании на изолированном сердце выявлено, что кардиопротекторный, положительный инотропный эффекты, а так же снижение диастолической дисфункции миокарда при ишемии-реперфузии, наблюдаемые при хронической непрерывной нормобарической гипоксии, опосредуются через активацию кардиальных дельта2- и μ-опиоидных рецепторов. Опиоидные дельта1- и каппа-рецепторы по данным исследований на изолированном сердце не принимают опосредующего участия в кардиопротекторном действии ХННГ. Улучшение функционального состояния митохондрий миокарда (скорость дыхания, величина трансмембранного потенциала, содержание АТФ и устойчивость mPTP-поры к открытию) у крыс после адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии связано с активацией дельта2- и μ-опиоидных рецепторов. Не выявлено зависимости улучшения резистентности митохондрий миокарда крыс, адаптированных к ХННГ, к ишемии-реперфузии от дельта1- и каппа-опиоидных рецепторов. В экспериментах на изолированных кардиомицитах обнаружено, что кардиопротекторный (цитопротекторный и антинекротический эффекты), наблюдаемый при ХННГ опосредуются через активацию кардиальных дельта2- и μ-опиоидных рецепторов. Опиоидные дельта1- и каппа-рецепторы не принимают опосредующего участия в кардиопротекторном действии ХННГ по данным исследований на изолированных кардиомиоцитах. Раннее ГП моделировали, помещая крысу на 10 мин в герметичный сосуд объёмом 3,3 литра, где в течение 1 мин создавали воздушную среду, содержащую 8% О2, 0,9% СО2 и 91,1% N2, затем следовала реоксигенация, цикл повторялся 6 раз. Затем крыс нароктизировали хлоралозой (100 мг/кг), после чего моделировали коронароокклюзию (45 мин) и реперфузию (2 ч). Инфаркт-лимитирующий эффект ГП оценивали по соотношению зона инфаркта/область риска. В работе использовали следующие фармакологические препараты: налтрексон, 8-(p-сульфофенил)теофиллин, гексаметоний, L-NAME, S-метилтиомочевина, 7-нитроиндазол, глибенкламид, 5-гидроксидеканоат, HMR 1098, N-(2-меркаптопропионил) глицин, тролокс, темпол, 1,3-диметилтиомочевина. В ходе эти исследований было установлено, что вегетативная нервная система, опиоидные рецепторы, аденозиновые рецепторы не участвуют в реализации инфаркт-лимитирующего действия гипоксического прекондиционирования (ГП). В тоже время было показано, что в кардиопротекторном эффекте ГП важную роль играют активные формы кислорода, митохондриальные КАТФ-каналы, индуцибельная NO-синтаза.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 г исследована роль вегетативной нервной системы, β-адренорецепторов, аденозиновых рецепторов, опиоидных рецепторов, активных форм кислорода, КАТФ- каналов, NO-синтазы в механизме инфаркт-лимитирующего и антиаритмического эффектов адаптации к холоду. Работа выполнена на аутбредных конвенциональных крысах-самцах Вистар массой 250 – 320 г. Кардиопротекторный эффект адаптации к холоду и его механизмы исследованы на модели острой экспериментальной коронароокклюзии-реперфузии in vivo. Каждая экспериментальная группа включала 15 животных. Скрининг моделей адаптации к холоду по инфаркт-лимитирующему эффекту проводили по трем протоколам. Первые протокол включал содержание крыс в холодильной камере при +4оС по две в клетке в течении 28 дней. По второму протоколу животные подвергались воздействию температуры +4оС по 8 ч ежедневно в течение 4-х недель. Согласно третьему протоколу, крысы находились в холодильной камере при +4оС по 1,5 часа ежедневно в течение 28 дней. В группу сравнения включены животные массой 200 - 220 г, которые находились при температуре +24оС. Толерантность к холоду оценивали по динамике снижения ректальной температуры при охлаждении животных до -5оС в течение 6 ч. Моделирование острой коронароокклюзии-реперфузии in vivo проводили перевязкой левой нисходящей коронарной артерии на 45 минут с последующей 120 минутной реперфузией. Выявление зоны некроза и зоны риска проводили последовательным окрашиванием миокарда 5% перманганатом калия и 1%-ым раствором 2,3,5-трифенил тетразолия хлорида. Размер зоны инфаркта выражали в процентах от размера зоны гипоперфузии. Непрерывное содержание крыс при +4оС в течение 4 недель вызывало состояние адаптации к холоду, что подтверждалось повышением устойчивости крыс к острому охлаждению, двукратным увеличением массы бурого жира в сравнении с интактными животными, не вызывало выраженной стресс-реакции, не оказывало влияния на частоту возникновения ишемических и реперфузионных желудочковых аритмий. При моделировании коронароокклюзии и реперфузии был выявлен выраженный инфаркт-лимитирующий эффект адаптации к холоду (протокол непрерывного содержания, 4 недели +4оС), размер инфаркта (соотношение зона инфаркта/область риска) был ниже на 30%, чем у животных контрольной группы. У крыс, адаптированных к холоду (протокол непрерывного содержания, 4 недели +4оС), в покое и при моделировании коронароокклюзии-реперфузии наблюдали повышение артериального давления, умеренное увеличение массы левого желудочка, что свидетельствует о его гипертрофии. Приведенные данные позволяют говорить о том, что акклиматизация крыс к холоду (протокол непрерывного содержания, 4 недели +4оС) приводит к увеличению массы жировой ткани, росту систолического АД и умеренной гипертрофии миокарда. Ежедневное охлаждение крыс при +4оС по 8 ч или 1,5 часа в течение 4-х недель (протоколы 2 и 3) приводило к формированию адаптации к холоду, увеличению массы бурого жира, однако не характеризовались инфаркт-лимитирующим действием. Обнаружено, что содержание катехоламинов (определяемое по их стабильным мет-производным) в сыворотке крови крыс по окончании непрерывной адаптации к холоду (протокол непрерывного содержания, 4 недели +4оС) не имеет статистически значимых отличий от показателей интактных крыс. Возможно, катехоламины являются триггерами, но не медиаторами инфаркт-лимитирующего действия холодовой адаптации. Исследование роли β-адренорецепторов в механизме инфаркт-лимитирующего действия адаптации к холоду показало, что введение крысам, адаптированным к холоду, ингибитора β-адренорецепторов бупранолола гидрохлорида перед моделированием коронароокклюзии увеличило размер инфаркта. Следовательно, активация β-адренорецепторов является медиатором инфаркт-лимитирующего действия адаптации к холоду. Исследование роли вегетативной нервной системы в механизме инфаркт-лимитирующего эффекта адаптации к холоду. Обнаружено, что введение блокатора периферических вегетативных ганглиев гексаметония хлорида крысам, адаптированным к холоду, внутривенно в дозе 10 мг/кг за 15 минут до коронароокклюзии приводит к увеличению размера инфаркта. Эти данные свидетельствуют об участии вегетативной нервной системы в инфаркт-лимитирующем действии адаптации к стрессу. Исследование роли аденозиновых рецепторов в механизме инфаркт-лимитирующего эффекта адаптации к холоду. Введение неселективного антагониста всех типов аденозиновых рецепторов 8-(p-сульфофенил)теофиллина внутривенно в дозе 7,5 мг/кг за 15 минут до коронароокклюзии не приводило к изменению размера инфаркта у крыс, адаптированных к холоду. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что аденозиновые рецепторы не участвуют в формировании инфаркт-лимитирующего действия адаптации к холоду. Исследование роли опиоидных рецепторов в механизме инфаркт-лимитирующего эффекта адаптации к холоду. Введение неселективного антагонист всех типов опиоидных рецепторов налтрексона гидрохлорида внутривенно в дозе 2 мг/кг за 15 минут до коронароокклюзии не повлияло на размер инфаркта у крыс, адаптированных к холоду. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что опиоидные рецепторы не участвуют в формировании инфаркт-лимитирующего действия адаптации к холоду. Для исследование роли активных форм кислорода в механизме инфаркт-лимитирующего эффекта адаптации к холоду за 20 минут до моделирования коронароокклюзии адаптированным к холоду крысам вводили гидрофильный тиоловый антиоксидант N-(2-меркаптопропионил)глицин (2-МПГ) внутривенно в дозе 20 мг/кг. Обнаружено, что такое фармакологическое воздействие не оказало значимого влияния на выраженность инфаркт-лимитирующего действия адаптации к холоду. Эти данные позволяют предполагать, что активные формы кислорода не являются медиаторами инфаркт-лимитирующего действия адаптации к холоду. Возможно эти соединения выполняют функцию триггеров холодовой акклиматизации. Исследование роли КАТФ-каналов в механизме инфаркт-лимитирующего эффекта адаптации к холоду. Введение крысам, адаптированным к холоду, блокатора всех типов КАТФ-каналов глибенкламида в дозе 0,3 мг/кг или блокатора митохондриальных КАТФ-каналов 5-гидроксидеканоата в дозе 5 мг/кг (внутривенно) статистически значимо увеличивало размер инфаркта при коронароокклюзии-реперфузии. Эти факты свидетельствуют об участии митохондриальных КАТФ-каналов в формировании инфаркт-лимитирующего эффекта адаптации к холоду. Исследование роли NO-синтазы в механизме инфаркт-лимитирующего эффекта адаптации к холоду. Неселективное ингибирование всех субтипов NO-синтазы внутривенным введением L-NAME в дозе 10 мг/кг за 10 минут до моделирования коронароокклюзии, так же как селективное ингибирование индуцибельной NO-синтазы (iNOS) S-метилтиомочевиной в дозе 3 мг/кг (внутрибрюшинно) приводило к увеличению размера инфаркта у адаптированных к холоду крыс; селективный ингибитор нейрональной NO-синтазы (nNOS) 7-нитроиндазол (50 мг/кг внутривенно) не влиял на размер инфаркта у крыс, адаптированных к холоду. Полученные результаты свидетельствуют о зависимости инфаркт-лимитирующего действия адаптации к холоду от активации индуцибельного пула NO-синтазы. Следует отметить, что не один из примененных нами ингибиторов/блокаторов исследуемых рецепторов и ферментов не оказывал инфаркт-лимитирующего действия в используемой дозировке. В нашей работе обнаружено повышение содержания трийодтиронина в сыворотке крови крыс после их адаптации к холоду в течении 4 недель. Изменения уровня тироксина мы не наблюдали. Полученные результаты позволяют предполагать участие тиреоидных гормонов в процессе акклиматизации крыс к холоду. Исследование роли протеинкиназы С, тирозинкиназы, ERK1/2-киназы, PI3-киназы в механизме кардиопротекторного действия хронической непрерывной нормобарической гипоксии (ХННГ) проведено в экспериментах на изолированных кардиомиоцитах крыс, адаптированных к ХННГ. Хроническую непрерывную нормобарическую гипоксию (ХННГ) проводили путем непрерывного содержания крыс 21 день в герметичной камере при уровне кислорода 12%. Выделение изолированных кардиомиоцитов из сердца крысы проводили энзиматическим методом с применением коллагеназы (Worthington, 335 U/мл) в бескальциевом буфере Тироде. Для моделирования аноксии клетки 20 минут инкубировали в модифицированном буфере Кребса, содержащем 5мМ 2-дезоксиглюкозы. Реоксигенацию кардиомиоцитов осуществляли в бескальциевом буфере Тироде в течение 30 минут. Выживаемость клеток оценивали по включению трипанового синего. В инкубационной среде определяли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Обнаружен выраженный цитопротекторный эффект адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии, который выражался в снижении гибели изолированных кардиомиоцитов при аноксии-реоксигенации и уменьшении выхода лактатдегидрогеназы в инкубационную среду. Инкубация изолированных кардиомиоцитов крыс группы «ХННГ» с генистеином приводила к увеличению гибели клеток при аноксииреоксигенации, а выброс ЛДГ оказался выше, чем у животных группы «ХННГ» без блокады тирозинкиназ на 25% и был сопоставим с этим показателем неадаптированных крыс. Эти данные свидетельствует о важной роли тирозинкиназ в защитном эффекте ХННГ. При добавлении ингибитора PI3-киназы вортманнина мы не обнаружили какого-либо влияния на гибель клеток и выход ЛДГ при аноксии-реоксигенации кардиомиоцитов крыс, подвергнутых хронической непрерывной нормобарической гипоксии. После добавления в среду инкубации изолированных кардиомиоцитов перед моделированием аноксии ингибитора ПКС хелеритрина цитопротекторное действие ХННГ не проявлялось, гибель клеток и выброс ЛДГ оказались сопоставимы с показателем группы неадаптированных крыс. Эти результаты свидетельствуют о значимой роли ПКС в реализации цитопротекторного действия ХННГ. Ингибирование ERK1/2-киназы предупреждало проявление цитопротекторного действия ХННГ. Исследование инфаркт-лимитирующего действия дистантного посткондиционирования (ДП) проведено на модели острой коронароокклюзии-реперфузии in vivo и показало статистически значимое снижение размера инфаркта при применении ДП. Снижение размера инфаркта при этом воздействии составило 40%. Инфаркт-лимитирующее действие ДП не проявлялось при ингибировании опиоидных рецепторов налтрексоном. При внутривенном введении ингибитора NO-синтазы L-NAME инфаркт-лимитирующее действие ДП не наблюдали, размер инфаркта оказался сопоставим с этим показателем контрольной группы. Эти результаты свидетельствуют о зависимости инфаркт-лимитирующего действия ДП от активации опиоидных рецепторов и повышения активности NO-синтазы.