КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-15-10103

НазваниеКлеточные и молекулярные механизмы развития аутоиммунных заболеваний

РуководительНевинский Георгий Александрович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Года выполнения при поддержке РНФ2016 - 2018

КонкурсКонкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словааутоиммунные заболевания, костный мозг и различные органы, пролиферация и дифференцировка стволовых клеток костного мозга, пролиферация лимфоцитов в различных органах, каталитически активные антитела (ДНКазы, протеазы, амилазы), системная красная волчанка, рассеянный склероз

Код ГРНТИ76.03.55, 76.03.31


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Исключительно важным является исследование ряда социально значимых аутоиммунных и других заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы и развитием аутоиммунных патологий. Ранее нами были впервые детально исследованы антитела (АТ) из крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) с нуклеазными, протеолитическими и другими активностями (абзимы). Нами обнаружены и детально изучены антитела-протеазы гидролизующие основной белок миелина (ОБМ) при рассеянном склерозе (РС), системной красной волчанке (СКВ) и шизофрении, патогенез которых (напрямую или в той или иной степени) связан с демиелинизацией оболочек нейронов (для обзора см. главы монографий и обзоры журналах: Невинский и др. 2000- 2014, Nevinsky et al., 2000-2015). Кроме того показано, что АТ из крови и ликвора костного мозга больных РС эффективно гидролизуют ДНК, а клетки, синтезирующие анти-ДНК АТ обнаружены в бляшках мозга и костном мозге (Parkhomenko et al., 2014; Doronin et al., 2015). Участие абзимов в патогенезе ряда АИЗ следует из большого числа публикаций (обзоры: Nevinsky et al., 2000-2015). Однако до сих пор не известны факторы, стимулирующие “начало” и механизмы последующего развития АИЗ. Некоторые наблюдения позволили предположить, что АИЗ могут быть следствием дефектов гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) (Ikehara et al., 1990). Нами было впервые показано, что IgGs крови неаутоиммунных CBA и BALB мышей и 2-3 месячных аутоиммунных MRL-lpr/lpr мышей (условно здоровых мышей) являются каталитически неактивными (Andryushkova et al., 2006, 2007, 2009). Cпонтанноe развитие СКВ у MRL-lpr/lpr мышей приводило к появлению АТ, гидролизующих ДНК, АТР и полисахариды с низкой каталитической активностью (начальная стадия заболевания). Значительное повышение этих активностей было связано с переходом мышей из предболезни в глубокой патологии, что коррелировало с дополнительными изменениями в дифференцировке и пролиферации ГСК костного мозга мышей (erythroid burst-forming, erythroid burst-forming granulocytic-macrophagic, early erythroid burst-forming, and granulocytic-erythroid-megacaryocytic-macrophagic colony units) и возрастанием пролиферации лимфоцитов в разных органах. Максимальная активность абзимов была обнаружена у здоровых MRL-lpr/lpr мышей, иммунизированных ДНК. При этом не было обнаружено изменения профиля дифференцировки ГСК, но наблюдалось резкое возрастание пролиферации лимфоцитов в различных органах (селезенка, тимус, лимфоузлы и др.) и мощное подавление клеточного апоптоза. Это указывало в пользу того, что развитие СКВ в первую очередь связано с изменением профиля дифференцировки стволовых клеток костного мозга, а у здоровых мышей заметных изменений профиля не происходило (Andryushkova et al., 2006, 2007, 2009). При исследовании АТ из крови пациентов с различными АИЗ нами было показано, что статистически достоверное появление абзимов обнаруживается на самых ранних стадиях различных патологий, когда изменение титров антител к специфическим антигенам различных заболеваний, например ДНК (СКВ, РС, и др.), основному белку миелина (РС, СКВ), тиреоглобулину и другим белкам, еще соответствует диапазону изменения титров этих АТ у здоровых доноров (главы нескольких монографий и обзоры журналах: Nevinsky et al., 2000-2015). Анализ развития СКВ у MRL-lpr/lpr мышей показал, что появление абзимов является наиболее ранним и статистически значимым маркером появления и развития СКВ, а дальнейшее значительное увеличение их активности коррелирует с дополнительными изменениями профиля дифференцировки стволовых клеток костного мозга, что ведет к увеличению концентрации белка в моче, анти-ДНК антител в крови, появлением типичной розовой бабочки и облысению мышей (Andryushkova et al., 2006, 2007, 2009). Однако вопросы о возможности различий и подобия в механизмах возникновения и развития различных АИЗ требуют дальнейших более детальных исследований. Известно, что после заражения вирусами сначала происходит наработка АТ против компонентов некоторых вирусов, которые могут иметь структурное сходство с компонентами крови и клеток человека (Keinan, 2005). Затем, вследствие мимикрии некоторых белков вирусов и человека, может произойти сбой иммунной системы, ведущий к наработке АТ против собственных компонентов организма человека и, как следствие, развитию АИЗ. Известно, что кровь здоровых людей и животных содержит в хорошо тестируемых количествах ауто-АТ против ДНК, различных белков и ферментов, которые, однако, не обладают каталитическими активностями (см. обзоры). Согласно нашим предварительным данным начало развития АИЗ может быть связано не только с указанной выше мимикрией, но и гомологией между некоторыми белками непосредственно человека. Например, при апоптозе клеток в кровь попадают ядерные белки, некоторые последовательности которых имеют гомологию с другими белками человека. В целом, исследование механизмов “запуска” и развития АИЗ представляется исключительно важным для поиска методов ранней диагностики и новых лекарственных средств против АИЗ. Конкретной задачей настоящего проекта является детальное исследование механизмов “запуска” и развития АИЗ у людей и животных с использованием крови и ликвора здоровых доноров, больных АИЗ, а также мышиных моделей СКВ и РС. Планируется анализ механизмов демиелинизации головного и костного мозга с помощью различных подходов. Будут исследованы профили дифференцировки стволовых клеток костного мозга и пролиферации лимфоцитов разных органов в случае мышиных моделей РС и СКВ в условиях спонтанного развития этих патологий, а также их активации при иммунизации мышей основным белком миелина, олигодендроцитным гликопротеином ОБМ (МОГ; стимулирует развитие РС) и ДНК. Параллельно на разных стадиях развития указанных АИЗ будет проведен анализ относительных активностей абзимов в гидролизе ОБМ, МОГ, ядерных гистонов, ДНК, олигосахаридов, АТР и сравнение их свойств с таковыми у классических ДНКаз, протеаз, амилаз. Анализ протеолитической активности АТ против гистонов имеет особеое значение. Гистоны и их пост-трансляционные модификации играют ключевую роль в ремоделировании хроматина и транскрипции генов. Кроме внутриядерных функций, гистоны могут быть вредными, когда они попадают в межклеточное пространство (Chen et al., Cell Death Dis. 2014). Введение экзогенных гистонов животным приводит к системным воспалительным и токсическим реакциям через активацию Toll-подобных рецепторов. Лечение животных с помощью анти-гистоных препаратов (например, нейтрализующие антитела, активированный протеин С, рекомбинантный тромбомодулин, и гепарин) защищает мышей от летальной эндотоксемии, сепсиса, ишемии реперфузионного повреждения, травм, панкреатита, перитонита, инсульта, коагуляции и тромбоза. Кроме того, гистоны и нуклеосомы в повышенной концентрации в сыворотке влияют на некоторые патофизиологические процессы и прогрессирование заболеваний, включая аутоиммунные патологии, воспалительные процессы и раковые заболевания. Таким образом, внеклеточные гистоны могут служить в качестве биомаркеров и новых терапевтических мишеней в ряде заболеваний человека. Будет выявлен тип протеолитической активности абзимов-протеаз. Кроме того, будут идентифицированы и сравнены сайты гидролиза ОБМ и гистонов АТ против этих белков. Будет изучена цитотоксичность изучаемых препаратов АТ крови больных и мышей с АИЗ. Детальное изучение механизмов индукции АИЗ, свойств и биологической роли абзимов при АИЗ, является, несомненно, чрезвычайно актуальной проблемой фундаментальной и практической медицины. Это, с одной стороны, позволит выяснить механизм индукции наработки клеток продуцирующих абзимы в ликворе и органах млекопитающих, а также оценить роль различных абзимов в патогенезе АИЗ, что отражает научную значимость и новизну полученных результатов. С другой стороны, полученные результаты позволят оценить возможность получения препаратов нового поколения для подавления изменения профилей дифференцировки стволовых клеток костного мозга, ингибирования пролиферации специфических лимфоцитов органов, а также поиска путей возвращения профилей дифференцировки к норме, что важно для лечения больных АИЗ.

Ожидаемые результаты
Будут исследованы профили дифференцировки стволовых клеток костного мозга и пролиферации лимфоцитов в разных органов в случае мышиных моделей РС и СКВ в условиях спонтанного развития патологии, а также ее активации при иммунизации мышей различными антигенами. Параллельно на разных стадиях развития АИЗ будет проведен анализ веса мышей, протеинурии, относительных титров АТ против важных антигенов, активностей абзимов в гидролизе ОБМ, МОГ, ядерных гистонов, ДНК олигосахаридов, АТР и сравнение их свойств с таковыми в случае классических ферментов. В указанных выше экспериментах будут использованы модели: мышиная линия C57BL/6 – модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), модель человеческого РС; мышиная линия MRL-lpr/lpr – модель СКВ у людей: 1. Будет проведено детальное исследование (детали указаны выше) после иммунизации ЭАЭ C57BL/6 мышей основным белком миелина и олигодендроцитным гликопротеином ОБМ (МОГ) в сравнении с неаутоиммунной линией мышей CBA. 2. Будет проведено детальное исследование (детали указаны выше) после иммунизации ЭАЭ C57BL/6 мышей комплексом ДНК с метилированным бычьим сывороточным альбумином (м-БСА), моделирующим комплекс ДНК с гистонами в сравнении с MRL-lpr/lpr мышами и неаутоиммунной линией мышей CBA. Это необходимо для понимания различий в развитии АИЗ разного типа при иммунизации мышей антигеном, стимулирующим синтез анти-ДНК антител и абзимов. 3. Купризон-индуцированная демиелинизация является широко используемой экспериментальной моделью для изучения процессов де- и ремиелинизации центральной нервной системы. После обработки ЭАЭ и СКВ мышей купризоном будет проведено исследование демиелинизации мозга и сравнение профилей дифференцировки стволовых клеток костного мозга и пролиферации лимфоцитов, а также активности абзимов после обработки купризоном, при спонтанном развитии аутоиммунного энцефаломиелита, его стимуляции с помощью МОГ. Аналогичные исследования будут проведены в случае неаутоиммунной линии мышей CBA. 4. Как было указано выше, нами проведено исследование изменение профилей дифференцировки стволовых клеток костного мозга и пролиферации лимфоцитов в различных органах, а также активности абзимов после обработки мышей MRL-lpr/lpr (мышиная модель СКВ) с помощью комплекса ДНК с м-БСА. При этом изменение профиля дифференцировки коррелировало с наработкой абзимов, гидролизующих ДНК, АТР и полисахариды. MRL-lpr/lpr мыши будут иммунизированы с помощью МОГ и проведено полное сравнение изменения параметров указанных выше с таковыми для MRL-lpr/lpr мышей обработанных ДНК и ЭАЭ мышей иммунизированных с помощью ДНК и МОГ. Для сравнения аналогичные исследования будут проведены в случае неаутоиммунной линии мышей CBA. Эти данные позволят понять возможные различия или сходство в развитии АИЗ у мышей, предрасположенных к развитию различных АИЗ (СКВ и ЭАЭ) и не склонных к развитию АИЗ мышей, при их обработке одним и тем же антигеном – ДНК или МОГ. 5. Согласно нашим предварительным данным небольшая фракция АТ против ОБМ из крови больных РС и СКВ эффективно гидролизует не только ОБМ, но и гистоны ядер клеток человека и наоборот. Будет проведен детальный анализ расщепления абзимами из крови больных СКВ и РС против гистонов пяти гистонов (H1 +H2а+H2b+H3+H4), а также ОБМ. В литературе описана полиреактивность АТ в перекрестном связывании различных антигенов (см. обзоры). Будут определены и сравнены сайты расщепления абзимами против гистонов – ОБМ и, наоборот, с помощью MALDI TOF масс-спектрометрии для выявления природы пока еще пока неописанной в литературе возможности существования каталитической полиреактивности абзимов против разных белков. Такое исследование представляется важным для понимания возможной роли каталитической полиреактивности абзимов в развитии АИЗ. 6. Будут получены моноклональные АТ против ОБМ и против гистонов и проведен анализ их полиспецифичности в комплексообразовании, а также каталитической кросс-реактивности в гидролизе ОБМ и гистонов (и возможно других белков). 7. Согласно нашим предварительным данным моноклональные АТ, соответствующие крови больных СКВ, могут иметь в своем составе больше одного активного центра, например два или три, которые катализируют гидролиз ДНК и специфических белков в присутствии (металлопротеазы) или отсутствии (сериновые протеазы) ионов металлов. Будет проведен анализ ферментативных свойств гистон-гидролизующей активности препаратов IgG крови больных АИЗ и их сравнение со свойствами абзимов-протеаз при РС и СКВ, а также с каноническими протеазами. Будет проведен анализ наличия нескольких активных центров у моноклональных АТ с помощью различных физико-химических методов, установлены ДНК последовательности, кодирующие эти моноклональные АТ и белковые последовательности, гомологичные последовательностям классических протеаз, которые ответственны за разные ферментативные активности абзимов. 8. Нами показано, что удельные ферментативные активности АТ из ликвора больных РС в гидролизе ДНК, ОБМ и олигосахаридов примерно в 30-50 раз выше, чем из сыворотки крови этих больных (Parkhomenko et al., 2014; Doronin et al., 2015). В то же время АТ из сыворотки крови этих больных не гидролизуют АТР. Будет проведен поиск абзимов с другими возможными каталитическими активностями в ликворе и сыворотке крови этих больных. Высокие активности абзимов с ДНКазной, ОБМ-гидролизующей и амилазной активностями указывают в пользу того, что первичная дифференцировка и пролиферация стволовых клеток костного мозга, ведущие к наработке клеток, продуцирующих абзимы, происходит уже в ликворе больных РС (и возможно других АИЗ), а дополнительная додиференцировка - дополнительно в различных органах. Одной из задач этого исследования является установление типа клеток костного мозга, продуцирующих абзимы и анализ возможных путей подавления их пролиферации. 9. Нами показано, что на ранних стадиях АИЗ – в дебюте, репертуар абзимов обычно сравнительно узкий, но он сильно разрастается с прогрессированием заболевания, ведущим к генерации очень большого числа АТ с самыми разными каталитическими функциями и многообразием абзимов с одной и той же ферментативной функцией (см. обзоры). Двадцать два из 72 моноклональных АТ, соответствующих 72 индивидуальным колониям, выбранным случайным образом, эффективно гидролизовали ОБМ, демонстрируя различные оптимумы рН, зависимость от солей, сродство к субстрату и т. д. (Timofeeva et al., 2015). Четыре препарата имели активность протеаз серинового типа, три были тиоловыми протеазами, одиннадцать АТ - металлопротеиназами. Активность трех химерных моноклонов ингибировали PMSF и ЭДТА, два других ЭДТА и йодацетамид, а один - PMSF, ЭДТА, и йодацетамидом. 33 из 78 моноклональных АТ (42 %), не содержащие канонических ДНКаз, продемонстрировали самые разные ферментативные свойства в гидролизе ДНК (Botvinovskaya et al., 2013; Kostrikina et al. 2014). Учитывая это, представляется важным изучить различие и сходство в появлении ранних абзимов в дебюте спонтанного развития АИЗ у модельных ЭАЭ и СКВ мышей, а также после иммунизации их с помощью ДНК и МОГ. Затем необходимо сравнить титры АТ против ДНК и МОГ, а также активности абзимов, гидролизующих эти субстраты, на последующих стадиях развития АИЗ вплоть по глубокой патологии. Эти данные могут помочь понять особенности перехода от дебюта заболевания, когда у больных СКВ обнаруживаются только АТ с ДНКазной активностью, а у больных РС – только гидролизующие ОБМ, к последующим стадиям, когда кровь больных, как СКВ, так и РС содержит АТ, гидролизующие не только эти два субстрата, но большое число других белков, включая гистоны. 10. Тонкие механизмы узнавания антигенов, включая вклад специфических и неспецифических взаимодействий в узнавание антителами ДНК и белков пока не известны. С помощью разработанного нами метода последовательного усложнения структуры лиганда будет проведен детальный анализ механизмов узнавания АТ против ДНК и ОБМ (из сыворотки больных РС) как ДНК, так и ОБМ молекул. 11. С нашей точки зрения, обобщение совокупности полученных данных может помочь понять особенности и возможное различие в развитии не только СКВ и РС, но и выявить общие закономерности появления и углубления сбоев иммунной системы при различных АИЗ. Кроме того, будут получены данные о структуре различных вредных для человека абзимов, необходимые для конструирования их специфических ингибиторов. 12. Мы уже начали такую работу в сотрудничестве с группой А. Х. Веньяминовой (ИХБФМ) по поиску специфических ингибиторов абзимов, гидролизующих ОБМ. Впервые был найден 2'-фтор-содержащий РНК-аптамер с высоким сродством и специфичностью к анти-ОБМ антителам (Vorobjeva et al., Anal Chem. 2014). Был получен ковалентный конъюгат аптамера с Cа2+-регулируемым флуоресцирующим белком, который был использован для биолюминесцентного анализа АТ против ОБМ. Разработанная модель твердофазной микроанализа является простым, быстрым и высокочувствительным методом обнаружения специфических АТ против ОБМ, образующихся в крови больных РС. Возможно, что такого рода аптамеры можно в будущем будет использовать для ингибирования протеолитической активности анти-ОБМ антител. Научная значимость результатов работы состоит в абсолютно новом направлении исследования механизмов возникновения и развития АИЗ, основанном на анализе изменения профилей дифференцировки и пролиферации стволовых клеток костного мозга с использованием моделей аутоиммунных мышей, соответствующих РС и СКВ человека. Параллельно будет проанализировано, какие клетки ликвора костного мозга и различных органов синтезируют вредные для организма абзимы, стимулирующие развитие аутоиммунных процессов и АИЗ. Параллельно будет установлено, какие абзимы и с какими активностями есть в ликворе костного мозга и сыворотке крови больных РС, СКВ и СПИД, в чем их возможное сходство и различие и какая их биологическая роль в индукции, развитии и осложнениях анализируемых патологий. Будет сформулирована концепция роли дифференцировки стволовых клеток костного мозга и каталитических антител в патогенезе этих АИЗ. Исходя из выше изложенного, можно заключить, что аналогов нашей работы в литературе пока нет – данный проект соответствует мировому уровню исследований и носит пионерский характер. Общественная значимость работы заключается в том, что по результатам исследования будут получены данные о механизмах развития АИЗ, что исключительно важно для поиска новых лекарственных средств, подавляющих изменение профиля дифференцировки стволовых клеток костного мозга людей и возвращения его к норме. Эти данные будут основаны на проведенной оценке клинико-диагностической значимости относительной активности АТ для развития аутоиммунных реакций у людей и у модельных линий мышей. Кроме того, полученные результаты позволят создать базу для новых подходов к диагностике АИЗ на ранних стадиях их появления и научно-обоснованного поиска биопрепаратов и терапевтических средств, а также методов контроля развития болезни в каждом отдельном случае, что делает возможным их использование в практическом здравоохранении. Нами обнаружены отдельные случаи исчезновения аутоиммунных процессов у некоторых пациентов с АИЗ. Учитывая это, мы планируем в будущем провести анализ какие компоненты их крови ответственны за возвращение профиля дифференцировки стволовых клеток к норме.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
К настоящему времени опубликованы только следующие данные. 1. Впервые показано, что спинномозговой ликвор больных рассеянным склерозом содержит абзимы, гидролизующие олигосахариды. Был получен непредсказуемый результат, свидетельствующий о том, что средняя удельная активность IgG с амилазной активностью из цереброспинальной жидкости примерно 30 раз выше, чем у антител из сывороток же пациентов с РС. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что олигосахарид-гидролизующая активность белков ликвора в основном обеспечивается активностью абзимов с амилазной активностью. Следует полагать, что эффективная дифференцировка и пролиферация лимфоцитов ликвора ведет к наработке клеток, синтезирующих абзимы с ДНКазной, ОБМ- и амилазной активностями уже непосредственно в костномозговом ликворе больных РС. Reference: Doronin VB, Parkhomenko TA, Castellazzi M, Cesnik E, Buneva VN, Granieri E, Nevinsky GA. Comparison of Antibodies with Amylase Activity from Cerebrospinal Fluid and Serum of Patients with Multiple Sclerosis. PLoS One. 2016 May 19;11(5):e0154688. doi: 10.1371/journal.pone.0154688. PMID: 27196086 2. Впервые проведен детальный анализ молекулярных механизмов узнавания ДНК анти-ДНК антителами. Метод последовательного усложнения структуры лиганда был использован для оценки относительного вклада каждого нуклеотидного звена различных одно- и двухцепочечных ДНК. Было показано, что минимальными лигандами лёгкой и тяжелой цепей анти-ДНК антител являются ортофосфат и различные моно рибо- и дезоксинуклеотиды. ДНК-связывающий участок, расположенный на тяжелой цепи имеет более высокое сродство к различным dNMP (Kd = 0.63–3.8 мкМ), чем сайт связывания, расположенный на легкой цепи (28–170 мкМ). Тяжелые и легкие цепи антител взаимодействуют с короткими олигонуклеотидами независимо, образуя относительно прочные контакты с 2–4 звеньями коротких гомо - и гетеро- олигонуклеотидов. Затем при дальнейшем увеличении длины происходит медленное увеличение сродства различных (pN)n олигонуклеотидов всего в 1,2–1,5 раз, а при n ≥8–9 все зависимости для всех d(pN)n (N= C, N, G или A) достигают плато, соответствующее величинам констант диссоциации ~3.2–20 нМ и ~200–460 нМ для тяжелых и легких цепей, соответственно. Узнавание рибоолигонуклеотидов (pN)n происходит аналогичным образом, но их сродство в зависимости от оснований 6–100 раз меньше, чем для d(pN)n. Переход от одно- к двухцепочечным ДНК и РНК приводит к лишь к небольшому увеличению их сродства к ДНК-связывающему сайту тяжелых цепей, в то время как легкие цепи демонстрируют одинаковое сродство к одно- к двухцепочечным ДНК и РНК. Протяженная ДНК взаимодействует одновременно с тяжелыми и легкими цепями антител и ее сродство примерно в 10 раз выше, чем к коротким олигонуклеотидам. Для описания узнавания ДНК и РНК специфическими антителами были использованы термодинамические модели, описывающие взаимодействие IgG, а также их легких и тяжелых цепей с ДНК и РНК. Reference: Andreev SL, Buneva VN, Nevinsky GA. How human IgGs against DNA recognize oligonucleotides and DNA. J Mol Recognit. 2016 Dec;29(12):596-610. doi: 10.1002/jmr.2559. PMID: 27558754 3. Впервые проведен анализ какие изменения гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (СККМ) мышей могут приводить к развитию аутоиммунных заболеваний. Было показано, что при спонтанном и MOG (пептид ОБМ мышей) -индуцированном развитии аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) у C57BL/6 мышей (модели рассеянного склероза у человека) происходит изменение профиля дифференцировки и уровня пролиферации СККМ, что ассоциировано с наработкой абзимов, гидролизующих основной белок миелина, MOG и ДНК. Купризон-зависимая демиелинизация центральной нервной системы C57BL/6 мышей приводит к значительному уменьшению размера мозолистого тела головного мозга по сравнению с необработанными мышами. При этом обработка мышей купризоном ведет к существенному снижению по сравнению со спонтанным и MOG -индуцированным развитием ЕАЕ титров анти-ДНК и анти- MOG антител, протеинурии, наработки абзимов, гидролизующих MOG, ОБМ и ДНК. Через 40 дней после иммунизации мышей купризоном изменение профиля дифференцировки уровня пролиферации СККМ очень незначительные по сравнению со спонтанным и MOG-индуцированным развитием ЕАЕ. Сделан вывод о том, что в отличие от демиелинизации, наблюдаемой при развитии РС у людей и животных, связанной с аутоиммунными процессами, купризон-зависимая демиелинизация с аутоиммунными процессами не связана. Reference: Nevinsky G.A. Autoimmune Processes in Multiple Sclerosis: Production of Harmful Catalytic Antibodies Associated with Significant Changes in the Hematopoietic Stem Cell Differentiation and ProliferationTrending Topics in Multiple Sclerosis. Alina Gonzalez-Quevedo editor. InTech, Rijeka, Croatia, 2016, pp. 99-148.

 

Публикации

1. Андреев С.Л., Бунева В.Н., Невинский Г.А. How human IgGs against DNA recognize oligonucleotides and DNA J Mol Recognit, 29(12):596-610 (год публикации - 2016).

2. Доронин В.Б., Пархоменко Т.А., Кастеллази М., Кесник Е., Бунева В.Н., Граниери Е., Невинский Г.А. Comparison of Antibodies with Amylase Activity from Cerebrospinal Fluid and Serum of Patients with Multiple Sclerosis PLoS ONE, 11(5):e0154688 (год публикации - 2016).

3. Невинский Г.А. Autoimmune Processes in Multiple Sclerosis: Production of Harmful Catalytic Antibodies Associated with Significant Changes in the Hematopoietic Stem Cell Differentiation and ProliferationTrending Topics in Multiple Sclerosis Alina Gonzalez-Quevedo editor. InTech, Rijeka, Croatia, pp.99-148 (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Исключительно важным является исследование социально значимых аутоиммунных (системная красная волчанка (СКВ), рассеянный склероз (РС), аутоиммунный тиреоидит) и других заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы и развитием аутоиммунных патологий (АИП) – заболеваний, сопровождающихся аутоиммунными реакциями, таких как, вирусные гепатиты, клещевой энцефалит, ВИЧ-инфекция, шизофрения. Ранее нами впервые детально исследованы антитела-абзимы из крови пациентов с различными АИП с нуклеазными, протеолитическими и другими активностями. Нами показано, что антитела из крови и ликвора костного мозга больных рассеянным склерозом эффективно гидролизуют ДНК, а клетки, синтезирующие анти-ДНК АТ обнаружены в бляшках мозга и костном мозге. Участие абзимов в патогенезе ряда АИП следует из большого числа публикаций. Однако до сих пор неизвестны факторы, стимулирующие “начало” и механизмы последующего развития АИП. Некоторые наблюдения позволили предположить, что АИП могут быть следствием дефектов гемопоэтических стволовых клеток. В 2017 г. проведен анализ изменения дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (СККМ) мышей и наработке различных абзимов при спонтанном и ДНК-индуцированном развитии аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) у C57BL/6 мышей. Иммунизация ЕАЕ-мышей с помощью MOG (гликопротеин олигодендроцитов миелина) стимулирует продукцию абзимов с высокой не только MOG-гидролизующей, но и ДНКазной активностью. После иммунизации с помощью ДНК и MOG обнаружено различное изменение профилей дифференцировки стволовых клеток, уровня пролиферации лимфоцитов костного мозга и апоптоза клеток в разных органах мышей. Данные демонстрируют, что ДНК может оказывать антагонистическое действие на мышей C57BL/6 по сравнению с иммунизацией MOG. Обычно быстрый иммунный ответ после инъекции MOG у мышей сильно задерживается после иммунизации ДНК, что, вероятно, связано с задержкой перестройки иммунной системы после реакции на ДНК. Нами обнаружены и детально изучены антитела-протеазы, гидролизующие основной белок миелина (ОБМ) при рассеянном склерозе и системной красной волчанке, патогенез которых связан с демиелинизацией оболочек нейронов. Согласно нашим предварительным данным небольшая фракция АТ против ОБМ из крови больных РС и СКВ эффективно гидролизует не только ОБМ, но и гистоны – белки, образующие с ДНК нуклеосому, структурную единицу хромосомы человека и наоборот. В 2017 г. показано, что антитела против ОБМ гидролизуют не только ОБМ, но и гистоны, а антитела против гистонов – ОБМ. Как правило, АТ против какого-либо белка гидролизуют только этот белок. В литературе много примеров перекрестного связывания антител против какого-либо белка с другими белками, но пока нет примеров перекрестного гидролиза белков. Это первый пример перекрестной специфичности в катализе. С помощью метода МАЛДИ масс-спектрометрии в настоящее время проводится сравнение сайтов расщепления гистонов антителами против ОБМ и наоборот. При исследовании функционирования иммуноглобулинов чрезвычайно важно установить механизмы их узнавания субстратов – антигенов. В 2017 г. для установления механизма узнавания различных белковых антигенов антителами и для оценки относительного вклада каждого аминокислотного остатка (АК) 12-мерного LSRFSWGAEGQK олигопептида иммунодоминантной последовательности ОБМ, использован метод последовательного усложнения структуры лигандов. Показано, что минимальным лигандом легких цепей IgG является любая свободная аминокислота. Постепенный переход от Leu (L) к LSRFSWGAEGQK приводит к увеличению сродства более чем в 400 раз за счет аддитивных взаимодействий легкой цепи с шестью остатками АК специфического олигопептида LSRFSW, а затем сродство достигает плато. Оценен вклад шести различных АК в сродство специфического олигопептида. Интактный ОБМ взаимодействует как с легкими, так и с тяжелыми цепями IgG, демонстрируя в ~ 200 раз более высокое сродство, чем специфический олигопептид. Это первый пример количественного анализа механизма распознавания белков антителами. Взаимодействие IgG с ОБМ описано с помощью термодинамической модели. Полученные данные могут быть очень полезны для понимания того, как антитела против многих различных белков могут узнавать эти белки. Для исследования детального механизма взаимодействия антител с субстратами необходимо установить продукты катализируемой ими реакции. В 2017 г. впервые определены сайты расщепления гистонов H1, H2a, H2b, Н3 и Н4 анти-гистон антителами из крови ВИЧ-инфицированных больных с помощью MALDI масс-спектрометрии. В известных антигенных детерминантах гистонов идентифицированы участки сайтов гидролиза с различной степенью расщепления. Согласно кристаллической структуре нуклеосомы, все идентифицированные сайты расщепления гистонов важны для их сборки в нуклеосому, взаимодействии между собой и связывании с ДНК хроматина. Полученные данные позволяют сделать вывод, что абзимы, гидролизующие гистоны, могут быть важны для дальнейшего понимания неизвестных возможностей иммунных систем и биологических функций антител и абзимов. У млекопитающих есть ферменты – сериновые протеазы, металлопротеазы и ДНКазы, которые катализируют только одну химическую реакцию. В 2017 г. установлено, что, в отличие от канонических ферментов, одна из двадцати пяти моноклональных легквх цепей (NGTA3-про-ДНКаза), полученных с помощью фагового дисплея, продемонстрировала три различных ферментативных активности; она эффективно гидролизовала ОБМ (но не другие белки) и ДНК. Другие двадцать четыре легких цепи гидролизовали только ОБМ. Протеолитическая активность NGTA3-про-ДНКазы эффективно ингибировалась специфическими ингибиторами сериновых и металло-протеаз. Свойства двух протеазных активностей и ДНКазы моноклональной NGTA3-про-ДНКазы значительно отличаются от таковых для соответствующих канонических ферментов. Это первый пример абзимов с тремя ферментативными активностями: сериновой и металло-протеазы, а также ДНКазы. Информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту: https://www.intechopen.com/books/lupus/catalytic-antibodies-in-norm-and-systemic-lupus-erythematosus http://www.annexpublishers.co/articles/JNND/3302-Changes-in-Several-Disease-Parameters-Including-Abzymes-and-Hematopoietic-Progenitor-Colony-Formation-in-Brain-Inflammation-and-Demyelination.pdf http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jcmm.13289/full http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmr.2637/full http://www.molecbio.ru/?view=article&id=5331 http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2017/mb/c7mb00042a

 

Публикации

1. Аулова К.С., Топоркова Л.В., Лопатникова Ж.А., Альшевская А.А., Сенников С.В., Бунева В.Н., Будде Т., Меус С.Д., Орловская И.А., Попова Н.А., Невинский Г.А. Changes in haematopoietic progenitor colony differentiation and proliferation and the production of different abzymes in EAE mice treated with DNA Journal of Cellular and Molecular Medicine, 21:3795-3809 (год публикации - 2017).

2. Баранова С.В., Дмитренок П.С., Иванисенко Н.В., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Antibodies to H2a and H2b histones from the sera of HIV-infected patients catalyze site-specific degradation of these histones Molecular Biosystems, 13:1090–1101 (год публикации - 2017).

3. Белов С., Бунева В.Н., Невинский Г.А. How human IgGs against myelin basic protein (MBP) recognize oligopeptides and MBP Journal of Molecular Recognition, - (год публикации - 2017).

4. Бунева В.Н., Невинский Г.А. Исключительное многообразие каталитических антител с различными активностями в крови пациентов с аутоиммунными и вирусными заболеваниями Молекулярная биология, 51:969–984 (год публикации - 2017).

5. Доронин В.Б., Кораблев А., Топоркова Л.Б., Аулова К.С., Бунева В.Н., Будде Е., Меус С.Г., Орловская И,А., Попова Н.А., Невинский Г.А. Changes in Several Disease Parameters Including Abzymes and Hematopoietic Progenitor Colony Formation in Brain Inflammation and Demyelination Journal of Neurology and Neurological Disorders, - (год публикации - 2017).

6. Невинский Г.А. Catalytic Antibodies in Norm and Systemic Lupus Erythematosus Lupus.Rijeka,Croatia: InTech, p. 41–101 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Нами показано, что иммунизация C57BL/6 мышей, расположенных к развитию аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ – модель рассеянного склероза человека) с помощью основного белка миелина (ОБМ), мышиного пептида MOG (фрагмента мышиного ОБМ), ДНК в комплексе с метилированным бычьим сывороточным альбумином, моделирующим ядерные гистоны (ДНК-мет-БСА) и комплексом ДНК с гистонами приводит к изменению профиля дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (СККМ) мышей и активации пролиферации лимфоцитов в различных органах. Изменение профиля дифференцировки СККМ ведет к развитию ЕАЕ, ассоциированному с возрастанием протеинурии и наработкой антител-абзимов, гидролизующих ОБМ, MOG, ДНК и гистонов (Н1, Н2а, Н2в, Н3 и Н4). Эти абзимы исключительно вредны для здоровья людей. Абзимы с ДНКазной активностью проникают через внешнюю и ядерную мембрану клеток, гидролизуют ДНК хроматина и индуцируют клеточный апоптоз. Это приводит к увеличению концентрации в крови комплексов гистонов с ДНК, которые являются основным антигеном, стимулирующим развитие системной красной волчанки (СКВ) и некоторых других аутоиммунных заболеваний. Гистоны и их пост-трансляционные модификации играют ключевую роль в ремоделировании хроматина и транскрипции генов. Кроме внутриядерных функций, гистоны очень токсичны, когда они попадают в межклеточное пространство. Введение экзогенных гистонов животным приводит к системным воспалительным и токсическим реакциям через активацию Toll-подобных рецепторов. АТ, гидролизующие ОБМ, которые обнаружены у больных СКВ, рассеянным склерозом (РС) и ВИЧ-инфицированных больных, также опасны для человека. Гидролиз абзимами ОБМ, который является основным компонентом белково-липидной оболочки аксонов, приводит к нарушению проведения нервных импульсов и развитию РС. Считается, что после заражения людей вирусами сначала происходит наработка АТ против компонентов некоторых вирусов, которые могут иметь структурное сходство с компонентами крови и клеток человека. Затем, вследствие мимикрии некоторых белков вирусов и человека, может произойти сбой иммунной системы, ведущий к наработке АТ против собственных компонентов организма человека и, как следствие, развитию АИЗ. Антитела против ядерных гистонов обнаруживаются и в крови здоровых доноров. При этом, абзимы против ОБМ гидролизуют гистоны и наоборот. На данном этапе проведен анализ сайтов расщепления белков и показано, что гидролиз ОБМ с помощью анти-ОБМ-IgG происходит в четырех кластерах (22 сайта гидролиза), соответствующих четырем известным антигенным детерминантам ОБМ. Анти-H1 абзимы гидролизуют ОБМ только в одном кластере (11 сайтов гидролиза), который лишь частично перекрывается одним из четырех кластеров ОБМ. Анти-H1-антитела гидролизуют H1 по пяти сайтам одного из его кластеров, расположенного в С-конце белка. Анти-ОБМ IgG расщепляют H1 гистон в двух кластерах, содержащих 17 сайтов расщепления на С- и N-концах гистона. Абзимы анти-H1 и анти-MBP являются первыми примерами АТ, обладающими не только кросс-комплексообразованием, но и перекрестной каталитической реактивностью. Существование перекрестной ферментативной реактивности абзимов против гистонов и MBP представляет большую опасность для человека. Следовательно, начало развития АИЗ может быть связано не только с указанной выше мимикрией, но и гомологией между некоторыми белками непосредственно человека, включая ОБМ и гистоны. В самом начале различных АИЗ обычно обнаруживаются абзимы против какого-либо одного характерного антигена для каждого конкретного заболевания, например при СКВ против ДНК, а РС – ОБМ, аутоиммунного тиреоидита – тиреоглобулина. Однако с развитием АИЗ происходит резкое расширение репертуара абзимов, которые гидролизуют самые разные ДНК, РНК, белки, олигосахариды, липиды и т.д. Нами показано, что антитела, гидролизующие ДНК, АТР и белки являются самыми ранними и статистически значимыми маркерами АИЗ у экспериментальных мышей и людей. Абзимы обнаруживаются уже на стадии пред-заболевания, когда нет никаких видимых маркеров СКВ, РС или других АИЗ, а изменения протеинурии, титров аутоантител соответствуют типичным диапазонам этих показателей для здоровых особей. На примере MRL-lpr/lpr (модель СКВ) и C57BL/6 мышей (модель РС) было показано, что в процессе развития этих патологий происходит одинаковое изменение профиля дифференцировки СККМ. Сделано предположение, что развитие многих других АИЗ также связано с изменением профиля дифференцировки СККМ. 2. Впервые проведено сравнение возможного различия в эффективности IgG в защите здоровых доноров, пациентов с СКВ и РС от окислительного стресса путем окисления абзимами вредных для человека соединений за счет АТ-зависимой пероксидазной (в присутствии H2O2) и оксидоредуктазной (в отсутствие H2O2) активностей. Впервые проведен анализ субстратной специфичности этих препаратов антител в окислении субстратов – токсических соединений различной природы. Средняя активность антител больных СКВ с пероксидазной активностью для большинства субстратов статистически выше по сравнению с абзимами здоровых людей. Данные демонстрируют также тенденцию к увеличению пероксидазной и оксидоредуктазной активностей абзимов из крови пациентов с РС по сравнению со здоровыми донорами, но в меньшей степени, чем при СКВ. Показано, что развитие СКВ и РС приводит к увеличению пероксидазной и оксидоредуктазной активностей IgG по отношению к большинству классических субстратов. Таким образом, абзимы могут служить дополнительным фактором детоксикации активных форм кислорода, защищающими пациентов с СКВ и РС от некоторых вредных соединений, несколько лучше, чем здоровых людей. Информационные ресурсы в сети Интернет (URL-адреса), посвященные проекту: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/jcmm.13850 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jmr.2703 https://www.intechopen.com/books/trace-elements-human-health-and-environment/minor-and-trace-elements-in-whole-blood-tissues-proteins-and-immunoglobulins-of-mammals https://www.dovepress.com/bispecific-antibodies-design-therapy-perspectives-peer-reviewed-article-DDDT

 

Публикации

1. - Сибирские ученые приблизились к пониманию механизмов рассеянного склероза Наука в Сибири, - (год публикации - ).

2. Аулова К. С., Клюшникова Ю. Сибирские ученые приблизились к пониманию механизмов рассеянного склероза Наука в Сибири, - (год публикации - 2019).

3. Аулова К.С., Невинский Г.А. Образование аутоантител и каталитически активных антител у мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом Сборник научных трудов V Международной конференции «ПОСТГЕНОМ’2018»: В поисках моделей персонализированной медицины. Казань, Россия (29.10.2018 – 2.11.2018), С. 310 (год публикации - 2018).

4. Аулова К.С., Топоркова Л.Б., Лопатникова Ж.А., Альшевская А.А., Седых С.Е., Бунева В.Н., Будде Т., Меус С.Г., Попова Н.А., Орловская И.А., Невинский Г.А. Changes in cell differentiation and proliferation lead to production of abzymes in EAE mice treated with DNA-Histone complexes Journal of Cellular and Molecular Medicine, 22(12): 5816-5832 (год публикации - 2018).

5. Баранова С.В., Дмитренок П.С., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Autoantibodies in HIV-infected patients: cross site-specific hydrolysis of H1 histone and myelin basic protein BioFactors, - (год публикации - 2018).

6. Баранова С.В., Дмитренок П.С., Зубкова А.Д., Иванисенко Н.В., Одинцова Е.С., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Antibodies against H3 and H4 histones from the sera of HIV-infected patients catalyze site-specific degradation of these histones Journal of Molecular Recognition, 31(7):e2703 (год публикации - 2018).

7. Баранова С.В., Иванисенко Н.В., Невинский Г.А. Сайт-специфическое расщепление гистонов человека иммуноглобулинами крови ВИЧ-инфицированных больных Тезисы выступлений участников Второй Школы молодых ученых MolMod-2018. Компьютерное моделирование структуры и динамики биомолекул. Новосибирск, 28–30 апреля 2018 г., С. 8-9 (год публикации - 2018).

8. Заксас Т.П., Невинский Г.А. Minor and trace elements in whole blood, tissues, proteins and immunoglobulins of mammals Trace Elements Human Health and Environment, Rijeka, Croatia: InTechOpen, P. 11-43 (год публикации - 2018).

9. Невинский Г.А. Mechanisms of autoimmune diseases development Vestnik of the Far East Branch of RAS, 6S (202), P. 125-128 (год публикации - 2018).

10. Седых С.Е., Принц В.В., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Bispecific antibodies: design, therapy, perspectives Drug Design, Development and Therapy, 12:195-208 (год публикации - 2018).