Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В результате проведенных работ по подбору полимерных составов для приготовления полимерных матриксов с различными свойствами было выявлено, что наилучшими материалами с точки зрения эффективности клеточной адгезии являются поликапролактоновые, покрытые фибронектином подложки, диаметром около 2000 нм. В то же время, спидроиновые подложки немного проигрывают по первичной адгезии, достоинством последних является существенная эластичность и отсутствие необходимости в дополнительной обработке фибронектином. Подбраны оптимальные параметры изготовления матриксов методом электроспиннинга, такие как время, скорость инжекции полимерного раствора, амплитуда прикладываемого напряжения, расстояние между соплом и коллектором, ширина щели коллектора, что позволило получить необходимую линейную плотность нановолокон и их диаметр. В процессе исследования тестировались различные типы волоконных подложек, с точки зрения оптимальности культивирования сердечной ткани. Ключевым моментом при формировании слоя сердечных клеток является эффективность адгезии клеток к материалу подложки Полученные образцы тестировались высаживанием на них неонатальных крысиных кардиомиоцитов в соответствии со следующими условиями: - полученные образцы морфологически и функционально однородны, - полученные образцы способны к сокращению и проведению возбуждения. Критериями успешного выделения и культивирования служили индикаторы того, что большое количество клеток прикрепилось к нановолокнам, часть клеток демонстрирует сократительную активность. - Дальнейшая инкубация проходила при тех же условиях: +37°С, 5% СО2. - Смена среды проводилась один раз в два дня с предварительным промыванием клеток физраствором. - Контроль образования клеточного монослоя проводился под фазово-контрастным микроскопом при увеличении 20х, 40х и 60х. Способность клеточного слоя к проведению возбуждения определялась на установке оптического картирования состоящей из высокоскоростной камеры Andor iXon+ 888, сопряженной с флуоресцентным микроскопом Olympus MVX-10. Получены доказательства распространения волны возбуждения в образцах клеточной культуре, визуализированной с помощью флуоресцентного кальциевого красителя Fluo-4. В ходе выполнения этапа работы были получены образцы сердечной ткани на выровненных полимерных нановолокнах, обнаружена зависимость параметров проведения возбуждения от архитектуры волокон подложки. Таким образом было показано, что полученные образцы нановолокон пригодны для создания подложки с культуральной тканью. В нашем случае это кардиомиоциты с пейсмейкерной дифференцировкой. Эмбриональные фибробласты самцов и самок крысы Rattus norvegicus были репрограммированы к плюрипотентному состоянию с помощью трансдукции лентивирусными векторами, экспрессирующими гены Oct4, Sox2, Klf4, сMyc. Полученные в результате репрограммирования линии клеток экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния (щелочную фосфатазу, транскрипционные факторы NANOG и OCT4, поверхностный антиген SSEA1), ряд генов, характерных для плюрипотентных клеток крысы, а также демонстрировали деметилирование CpG-динуклеотидов в промоторных областях генов Oct4 и Nanog. Показана способность полученных клеточных линий дифференцироваться в производные трех зародышевых листков, что также подтверждает плюрипотентность полученных клеток. Четыре линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека (от здорового донора, от пациента с болезнью Альцгеймера с мутацией V717I в гене APP, от пациента со спинальной мышечной атрофией с делецией 7-ого и 8-ого экзонов в гене SMN1 и ИПСК с удлиненным трактом CAG повторов в гене HTT) были направленно дифференцированы в кардиомиоциты с помощью протоколов, основанных на активации сигнального пути WNT/β-катенин (с помощью CHIR99021) и его последующем ингибировании (ингибитором WNT IWP2) (Lian et al., 2013; Burridge et al., 2014). Использование данных протоколов приводило к появлению спонтанно сокращающихся участков на 8-14 дни направленной дифференцировки. Среди дифференцированных клеток были выявлены клетки, экспрессирующие саркомерные белки кардиомиоцитов: кардиальный тропонин Т, саркомерный альфа-актинин, миозин. Оценка эффективности направленной дифференцировки линий ИПСК показала, что наиболее высоким процентное содержание кардиомиоцитов было в тех протоколах, где дифференцировка ИПСК запускалась путем добавления 12 мкМ CHIR99021 на 48 ч. Таким образом, были получены линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы, а также были отработаны протоколы направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в кардиомиоциты.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В рамках выполнения работ по проекту было исследовано формирование электрической проводимости между возбудимыми сердечными тканями различного происхождения на макро- и микроуровнях. На макроуровне было изучено распространение возбуждения в двух областях культивируемых сердечных клеток, находящихся в прямом контакте. Волны возбуждения наблюдались и регистрировались оптически, с помощью флуоресцентных красителей. Для этого использовались неонатальные культуры крысиных кардиомиоцитов разных возрастов, а также культуры кардиомиоцитов крыс и культуры кардиомиоцитов HL-1. На микроуровне синхронизация отдельных клеток изучалась с использованием флуоресцентной микроскопии и чувствительными к кальцию красителями. На тканеинженерной модели из различных культур кардиомиоцитов на полимерном матриксе было показано формирование электрической проводимости между возбудимыми сердечными тканями различного происхождения на макро- и микроуровнях. По результатам проделанного эксперимента можно сделать вывод, что синхронное возбуждение развивается в сердечных клетках разного происхождения при физическом контакте. Таким образом, было показано, что имплантированные лоскутки сердечной ткани могут функционально объединяться с тканью реципиента. Была отработана методика повышения процентного содержания пейсмейкерных клеток при направленной дифференцировке линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в кардиомиоциты. Показано, что при кардиальной дифференцировке ИПСК человека методом последовательной активации и ингибирования WNT пути популяция кардиомиоцитов представлена в основном сократительными кардиомиоцитами (TnT+, Nkx2.5+), доля пейсмейкерных клеток (TnT+, Nkx2.5-), составляет 0.5%. Путем оптимизации протокола кардиальной дифференцировки ИПСК с помощью ростового фактора BMP4 достигнута незначительная доля повышения пейсмейкерных кардиомиоцитов в популяции до 14%. Получены первые модели из полимерных нановолокон (производимых на электроспиннинговой установке), заселённые культурой кардиомиоцитов и пейсмейкерных клеток. Кардиомиоциты культивировали на подложках из PLA в течении 30 дней с сохранением жизнеспособности. В ходе работы исследовали выживаемость кардиальных клеток крысы после введения в миокард. Трансплантацию проводили методом интрамиокардиальных инъекций суспензии клеток, находящихся в культуральной среде или в плазме крови, богатой тромбоцитами и фибриногеном. Клетки были модифицированы геном фермента люциферазы с помощью трансдукции лентивирусами. Динамику приживления трансплантированных клеток в миокарде оценивали по интенсивности люминесценции в белковых экстрактах миокарда в нескольких временных точках после трансплантации (0-14 дней). Было показано, что кардиальные клетки успешно трансплантировались и выживали в периинфарктной зоне в первые 48 часов, однако интеграции их в миокард не происходила. Клетки, инъецированные в культуральной среде, сохранялись в миокарде в течение 5 суток, а в тромбиновом геле – 10 суток после трансплантации. Было показано положительное влияние тромбинового геля на адаптацию клеток после трансплантации, что, вероятно, способствовало пролонгированию периода персистенции трансплантированных клеток в миокарде. Использование тромбинового геля при трансплантации может быть полезным для долгоживущих клеток, таких как кардиомиоциты, в частности, для повышения эффективности трансплантации тканеинженерного биологического водителя ритма. Репортерная система, экспрессирующая люциферазу, может быть эффективна для in vitro и in vivo мониторинга судьбы клеток как на биотехнологических этапах культивирования и сборки тканеинженерного биопейсмейкера, так и после трансплантации в сердце. В дальнейшем разработанный методический подход будет использован нами при in vivo исследовании функционирования тканеинженерных биопейсмейкеров у экспериментальных животных. Был проведен эксперимент по изучению выживаемости фибробластов сердца при культивировании на подложках из поликапролактона, полученных методом ЭСФ, после трансплантации в миокард лабораторного животного (мини-свиньи). Готовые матриксы заселялись клетками, выделенными методом механического измельчения и ферментативного гидролиза из фрагментов предсердий мини-свиней. Эксперименты проводили на 2 группах животных: первой группе в миокард трансплантировали образцы матриксов, заселенные культурой фибробластов сердца, второй группе – имплантировали матриксы без клеток. Через 7 суток после операции животных выводили из эксперимента и забирали участки миокарда с трансплантированным/имплантированным материалом. Состояние миокарда подопытного животного оценивали с помощью стандартного гистологического исследования, а также иммунофлюоресцентного окрашивания криосрезов сердца для выявления развития воспаления в зоне имплантации. По результатам работы было обнаружено, что созданные матриксы из полилактидных нановолокон обладают хорошей биосовместимостью и не влияют на жизнеспособность клеток при использовании в качестве подложки для культивирования. Полученные результаты помогут разработке новых типов полимерных подложек и применению их для изучения биофизических и электрофизиологических свойств кардиальных клеточных культур, что позволит расширить возможности регенеративной медицины и может стать стандартом развития аутогенной биологической терапии.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В данной работе в качестве поисков рабочих подходов к созданию оптического биологического водителя ритма изучалась эффективность различных способов подсадки и интеграции светочувствительной линии кардиомиоцитов ChR2-HL-1 в монослой неонатальных кардиомиоцитов крысы. Для исследования были выбраны два подхода к сокультивированию: интеграция в монослой изолированных клеток и кластеров линии Ch2-HL-1 в различной концентрации. Эффективность полученного таким образом модельного водителя ритма оценивалась следующими способами: методом оптического картирования производилась регистрация волн возбуждения, инициированных оптической стимуляцией, воздействующей исключительно на клетки линии Ch2-HL-1; методами иммуноцитохимического анализа производилась характеристика морфологии полученной со-культуры и оценивалась степень интеграции подсаживаемых структур в монослой. В ходе проведенных исследований было показано, что наиболее эффективным методом является кластерный способ подсадки клеток в первичную культуру: 100% образцов с кластерами, подсаженных спустя 6 ч. культивации монослоя, проявляли стабильную генерацию волн возбуждения на физиологически значимых частотах внешней стимуляции, по сравнению с 88% для образцов с подсаженными изолированными клетками на значениях частот, ниже физиологических. Для повышения приживаемости пейсмекерных клеток при трансплантации в сердце посредством инъекций был разработан особый вид полимерных дискретных подложек, именуемый в дальнейшем микроподложками. Микроподложки представляют из себя фрагменты отдельных полимерных волокон, материалами для их производства могут служить любые биосовместимые полимеры, из которых можно получать волокна методом электроспиннинга. В частности, в ходе данной работы были получены микроподложки из полилактида с добавлением коллагена. Такие материалы были выбраны ввиду того, что оба этих полимера являются биоразлагаемыми и биосовместимыми, а коллаген делает волокна адгезивными для клеток. В ходе работы было показано, что кардиомиоциты прикрепляются к микроподложкам и сохраняют жизнеспособность и функциональную активность при культивировании в суспензионном состоянии. Микроподложки могут ускорять взаимодействие подсаженных клеток и таргетной культуры при сокультивировании кардиомиоцитов на микроподложках с другими клетками (культура неонатальных кардиомиоцитов). Для увеличения доли пейсмейкерных кардиомиоцитов человека в клеточной культуре был разработан подход, заключающийся в активации ключевых генов SHOX2 и TBX5 с помощью системы CRISPR/Cas9-Synergistic Activation Mediator (SAM) в процессе кардиальной дифференцировки ИПСК. В экспериментальных операциях исследовали выживаемость и функциональную активность кардиомиоцитов человека при интрамиокардиальной трансплантации и в составе подкожных матригельных трансплантатов в организме иммунодефицитных мышей. Популяция кардиомиоцитов была получена в результате направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и содержала не более 5% пейсмейкерных клеток. Кардиомиоциты человека выявлялись в организме иммунодефицитных мышей в течение как минимум 35 дней после трансплантации и не вызывали эктопической электрической активности миокарда. Функциональную активность дифференцированных кардиомиоцитов человека в составе подкожных матригельных трансплантатов оценивали методом оптического картирования токов ионов кальция на 2-28 день после формирования. Было показано, что при подкожном введении в составе матригельного трансплантата кардиомиоциты выживают как минимум четыре недели, причем их количество достоверно не меняется в образцах от 2 до 28 дней исследования. Также было показана возможность выживания клеток и сохранение способности к спонтанной осциляции ионов кальция в кардиомиоцитах в составе подкожного матригельного трансплантата. Таким образом, подкожный матригельный трансплантат может быть удобной системой для исследования функциональных особенностей трансплантированных кардиомиоцитов in vivo. Также в данной работе оценивалась эффективность и безопасность методики трансплантации кардиомиоцитов, полученных путем направленной дифференцировки ИПСК человека, в сердце крупных лабораторных животных (мини-свиней). В эксперименте исследовали две группы животных: первой группе в свободную стенку левого желудочка производили инъекцию кардиомиоцитов, содержащихся в матригеле, второй группе – инъекцию физиологического раствора. Для снижения реакции отторжения после трансплантации ксеногенной культуры клеток до операции и в течение всего срока наблюдения животным производили иммуносупрессию комбинацией циклоспорина А и преднизолона. В течение периода послеоперационного наблюдения ежедневно проводилась запись электрокардиограммы с целью выявления эктопических событий. Через 5 дней после трансплантации клеток животных выводили из эксперимента и забирали участки миокарда с трансплантированным материалом для гистологического и иммуноцитохимического анализа. В ходе работы было показано, что трансплантированные кардиомиоциты сохраняются в сердце экспериментальных животных в течение 5 дней, однако проявления эктопической электрофизиологической активности в месте введения клеток обнаружено не было. Полученные данные указывают на необходимость проведения дополнительных экспериментальных работ с ужесточением иммуносупрессии, увеличением времени нахождения клеток в миокарде, увеличением процентного содержания пейсмейкерных клеток в используемой культуре. Данный метод может быть в дальнейшем полезен для повышения эффективности трансплантации тканеинженерного биологического водителя ритма. В эксперименте по исследованию способности использующихся в данной работе тканеинженерных конструкций к индукции экспрессии активационных молекул лимфоцитов в аллогенной системе мононуклеарных клеток in vitro было показано, что используемые конструкции не вызывают повышения экспрессии активационных маркеров CD28 и CD152 на CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах человека. Таким образом, полученные нами результаты могут свидетельствовать об отсутствии реакции иммунного ответа на трансплантацию полилактидных нановолоконных подложек и аллогенных КМ, полученных из ИПСК человека, и полученный в ходе работы тканеинженерный биологический кардиостимулятор после дальнейшего усовершенствования и дополнительных экспериментальных исследований может быть рекомендован к применению в клинической практике.