Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В ходе первого года работы над проектом была создана библиотека РНК-проводников ко всем функционально значимым локусам генома HBV. При подборе мишеней для РНК-проводников, ориентировались не только на ключевые элементы, кодирующие белки вируса (малый, средний и крупный S-белок, X-белок, C-белок, е-белок: области core, precore/pg, preS1, preS2/S, X) с учетом типичного эпигенетического состояния ккзДНК. Участки в областях EnhI, EnhII, преэнхансерного региона EnhI и BCP были выбраны с учетом карт связывания полимеразы II, областей связывания триметилированного варианта гистона Н3К4 и ацетилированной формы гистона Н3К27. Поскольку одной из самых распространенных форм эпигенетических модификаций, обнаруженной у пациентов с ХГВ, является метилирование по островкам CpG нуклетидной последовательности ккзДНК, включая островок I (три консервативных региона в сайте S-гена), островок II (регион EnhI и промотора гена X) и островок III (Sp1 промотер и первый кодон Р-гена), эти регионы также были использованы для подготовки библиотеки РНК-проводников. Указанные карты областей метилирования, регионов связывания гистонов и полимеразы позволяют определять участки локально релаксированные и, соответственно, доступные для действия нуклеаз, и участки с высокой степенью компактизации. Помимо этого, ряд РНК-проводников был подобран с целью создания «сложных» разрывов, т.е. пары двуцепочечных разрывов (ДЦР) в пределах 50-80 нт, которые менее эффективно репарируются по механизмам репарации ДЦР клетки. Всего синтезировано ПЦР-продуктов с РНК-проводниками: 15 для S.pyogenes, 6 для N.meningitidis, 4 для S.thermophilus и 3 негативных РНК-проводника для каждого из белков Cas9, которые не подходят ни к одному из областей генома ВГВ или генома человека. Получение ПЦР-продуктов, содержащих U6-промотор, выбранную последовательность РНК-проводника и шпильку для распознавания белком Cas9, индивидуального белка от каждого вида организмов (S.pyogenis, N.meningitidis и S.thermophilus), проводили с помощью мутагенной двухэтапной ПЦР. Поскольку выбранные РНК-проводники будут в дальнейшем использованы для получения лентивекторов и трансдукции в клетки, ПЦР продукты также содержали сайты для клонирования в плазмиду pLX-sgRNA (Addgene 50662) по сайтам BamHI и NheI. Проверка полученной библиотеки РНК-проводников была проведена при помощи электрофореза в геле по молекулярной массе, а также с помощью клонирования в Т-вектор и секвенирования вставки по Сэнгеру. Клетки HepG2-1.1merHBV и HepG2-1.5merHBV, содержащие вставку генома 1.1-HBV и 1.5-HBV под индуцибельным промотором и промотором дикого типа, соответственно, были трансфицированы плазмидами с геном S.p Cas9 (pLV-Cas9-T2A-GFP (Addgene 53190) и hCas9 (Addgene 41815)), N.m.Cas9 M-NMcas (Addgene 48670) и S.t. Cas9 M-ST1cas (Addgene 48672) с ПЦР-продуктами, кодирующими соответствующий РНК-проводник. Выделенная ДНК HBV использовалась для количественной ПЦР-детекции ДНК HBV в режиме реального времени с зондами TaqMan (набор АмплиСенс «HBV-монитор-FRT) и Т7Е1 анализа. Помимо этого, нам уже удалось клонировать два наиболее эффективных индивидуальных РНК-проводника в вектор pLX-sgRNA и провести накопление лентивирусных частиц в клетках HEK293T. Кроме того, плазмида pLV-Cas9-T2A-GFP также была упакована в лентивирусные частицы. Клетки HepG2-1.1mer_HBV были трансдуцированы плазмидой pLV-T2A-GFP и pLX-sgRNA с одним из индивидуальных РНК-проводников (вариант single-plex). Эффективность трансдукции оценивали визуально по свечению на зеленом канале (488 нм), FACS-анализа и ПЦР-анализа мРНК Cas9. Трансдукцию клеток проводили на 4-е сутки после активации цикла HBV с несколькими вариантами moi (множественность инфекции), выделение РНК и ДНК осуществляли через 3 суток. Проанализировали изменение цикла HBV в различных вариантах экспериментальных условий, направленных на увеличение доступности ккзДНК системам CRISPR/Cas9. Тем самым, в опытах по трансфекции выявлены наиболее эффективные РНК-проводники с соответствующими видами Cas9 белков. Была проанализирована динамика генерации уН2А.Х фокусов в ходе репликации HBV в культурах клеток, в том числе в ходе длительного (до 18 дней) пребывания клеток в культуре, действие малых химических молекул и факторов эпигенетического ремоделирования, а также факторов неспецифического повреждения генома клетки на динамику образования уН2А.Х фокусов и определение корреляций между числом уН2А.Х фокусов и параметрами жизненного цикла вируса HBV (общее число ДНК HBV, pgRNA/S-RNA, ккзДНК). Окрашивание по двойным меткам yH2A.X-53BP1, yH2A.X-RAD51, yH2A.X-DNA-PKcs, yH2A.X-HBcAg, yH2A.X-цитокератин с окрашиванием ядра красителем Hoechst33342. Состояние клеточного цикла определяли в динамике методом окрашивания на ДНК красителем DRAQ5 живых клеток с помощью проточной цитофлуориметрии (FACS-анализ). Жизнеспособность клеток определяли, во-первых, методом флуоресцентной микроскопии после двойного окрашивания красителями Hoechst3342 и пропидием йодидом, и, во-вторых, по процентной доле клеток, находящихся в фазе sub-G1. Профили экспрессии факторов DDR (факторов, ответственных за репарацию ДЦР, включая MRE11A, DNA-PKcs, RAD51) получали с помощью ПЦР-анализа с красителем SYBRGreen. Репарацию ДЦР, индукцию разрывов и фокусов yH2A.X, локализацию и ко-локализацию белков DDR (yH2A.X, 53BP1, RAD51, DNA-PKcs) – с помощью иммунофлуоресцентной и конфокальной микроскопии. Под действием разных условий были получены данные как по более, чем 100-кратному увеличению транскрипции HBV; увеличению пула ккзДНК под действием ДНМТ3А, так и, с другой стороны, снижению пула ккзДНК вплоть до 60%-80%. Первые результаты позволят использовать CRISPR/Cas9 системы в условиях, когда пул ккзДНК переходит в транскрипционно активную, доступную для действия нуклеаз форму. Вторые будут использованы для комбинированного действия напрямую на ккзДНК. С помощью анализа клеточного цикла, жизнеспособности и пролиферации клеток мы подтвердили, что указанные изменения не связаны с изменением состояния модельных клеток, но вызваны прямым действием на различные компоненты вирусного цикла.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе работы выявлены эффективные комбинации РНК-проводников с белками Cas9 от S.pyogenes и S.thermophilus, мишенью которых являются консервативные регионы ккзДНК ВГВ. Максимальные значения эффективности противовирусного действия для S.pyogenes Cas9 составляют 91-92%, S.thermophiles 93-94%. Дополнительно к этому, был завершен доскональный анализ РНК-проводников всех трех заявленных систем с мишенями ко всем консервативным участкам генома ВГВ и использован новый вид белка Cas9 от организма F.novicida, мишенью которого также является РНК. Результаты подтверждены на моделях трансдукции и нуклеофекции клеток, моделях хронической репликации ВГВ. Помимо этого, был проведен патентный поиск на заявленные 2 последовательности РНК-проводников для Cas9 S.pyogenes и 2 последовательности для Cas9 S.thermophiles, в ходе которых определена их патентоспособность по показателям «новизна» и «изобретательский уровень». Наиболее эффективные индивидуальные РНК-проводники и комбинации РНК-проводников были трансдуцированы и, в другой серии опытов, нуклеофицированы в клетки с одновременной обработкой малыми молекулами. Проведен анализ действия малых молекул на цикл ВГВ и эффективность действия систем CRISPR/Cas9. Методом NGS секвенирования изучено влияние малых молекул на исход репарации матриц ккзДНК после внесения нуклеолитических разрывов системами CRISPR/Cas9. Наиболее перспективные и безопасные соединения-модуляторы путей репарации 3-aza (утвержденный FDA препарат против ВИЧ) и L755,507 (агонист β3-адренергических рецепторов) были изучены после трансдукции систем CRISPR/Cas9, а также в опытах с нуклеофекцией клеток гепатомы HepG2-1.1merHBV и HepG2-1.5merHBV. С помощью ИФА анализов на пролиферацию и жизнеспособность показано отсутствие токсических эффектов на модели использованных клеток, продемонстрировано усиление анти-ВГВ эффектов CRISPR/Cas9 при действии малых молекул; Изучено влияние малых молекул и белка Ad4E1B на исходы расщепления ккзДНК CRISPR/Cas9 системами с помощью NGS секвенирования участков нуклеолитических разрывов в ккзДНК. Выявлено, что модуляция путей репарации слабо влияет на конечные значения уровней ккзДНК, однако приводит к гипермутации оставшихся матриц ккзДНК (в некоторых случаях в десятки раз, с 0,8% частоты варианта мутантов до 31%) и резкому падению транскрипции ВГВ; Определена роль путей репарации ДЦР в жизненном цикле ВГВ. С помощью ДНК-повреждающих агентов, индуцирующих образование уН2АХ, выявлено, что формирование уН2АХ стимулирует репликацию ВГВ. С помощью нокдаунов, мутаций и малых молекул показано, что блокирование отдельных компонентов путей NHEJ/HR и предотвращение фосфорилирования Н2АХ подавляет цикл ВГВ, как было продемонстрировано методом ПЦР, FACS-анализа, иммуноцитохимии и количественного подсчета секретируемого HBsAg. Было изучено влияние HNF1, HNF4A2 и HBx, а также мутантных форм НВх белка (HBxNESM, HBxmut) на анти-ВГВ эффекты CRISPR/Cas9. Все факторы усиливали противовирусное действие, однако если для HNF1 и HNF4A2 было довольно слабым (от 1,3 до 2,5 раз) и зависело от наличия вблизи сайта РНК-проводника участка связывания фактора, НВх белок и его мутантные формы увеличивали противовирусную активность в 2-40 раз. При совместном использовании эффективность CRISPR/Cas9 достигала 99,97%. НВх – трансактиватор ВГВ, который может активировать онкогены, связываться с про- и антиапоптотическими факторами, в цитоплазме вызывать образование активных форм кислорода и двуцепочечные разрывы в геноме. Использование мутантных форм НВх белка и созданные нами конструкты гибридных форм белка Cas9-linker-HBx позволят если не устранить, то минимизировать возможные побочные эффекты, усилив при этом эффективность действия CRISPR/Cas9 на ккзДНК, включая высококонденсированные, гетерохроматизированные формы ккзДНК, которые не узнаются или не расщепляются классическими вариантами CRISPR/Cas9 систем. Кроме того, в опытах с метилированной ккзДНК было продемонстрировано, что (1) НВх белки могут усиливать транскрипцию подобных криптических форм ккзДНК; (2) CRISPR/Cas9 системы не проявляют противовирусной активности на этих формах ккзДНК; (3) НВх белки переводят метилированную ккзДНК в транскрипционно активную форму и позволяют CRISPR/Cas9 системам эффективно действовать на ВГВ. Помимо этого, мы провели серию экспериментов по специфической транзиентной активации экспрессии представителей семейства AID/APOBEC, для которых описано специфическое и нетоксическое действие на ВГВ, в том числе на деградацию ккзДНК, а также на ряд других вирусных инфекций. В опытах по активации APOBEC3A, APOBEС3В, совместной активации АРОВЕС3А/АРОВЕС3В и активации AID и APOBEC3G, активация экспрессии каждого фактора подавляла транскрипцию вируса. Для APOBEC3A было выявлено значительное снижение уровней ккзДНК (на 60%), а также методом 3D-PCR подтверждено наличие участков дезаминирования в оставшихся матрицах ккзДНК. Методом оценки длины комет продемонстрировано, что транзиентная активация АРОВЕС-дезаминаз не оказывает генотоксического эффекта.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Одним из ключевых научных результатов в этом году стало создание рибонуклеопротеиновых комплексов систем CRISPR/Cas9, состоящих из белка Cas9 от организма S.pyogenes или S.thermophilus, которые образуют комплекс с РНК-проводником, полученным с помощью in vitro транскрипции, и доставляются в культуры клеток или инфицированным мышам. Рибонуклеопротеиновые комплексы St CRISPR/Cas9 (St3, St4, St10, St4+St10, St3+St4+St10) полностью элиминировали транскрипты вируса и разрушали до 99% всех форм генома, включая ккзДНК, в инфицированных клетках в экспериментах in vitro уже на 3 сутки после трансфекции. В данном случае речь идет не просто о снижении вирусной нагрузки до минимальных значений, как в наших экспериментах с продукцией St CRISPR/Cas9 в составке экспрессирующих плазмид (снижение до 99%), а о полном исчезновении транскриптов вируса уже на 3 сутки после введения системы. Комплексы St10 позволили элиминировать свыше 70% инфекции HBV, исходя из результатов вирусной нагрузке в сыворотке крови и внутрипеченочному содержанию всех форм геномов HBV, уже к первым-вторым суткам после инъекции мышам. Сконструированные системы St CRISRP/Cas9 St3, St4 и St10 направлены к ключевым, высококонсервативным областям ккзДНК HBV, и позволяют добиться разрушения до 99% ккзДНК HBV и полностью удалить все транскрипты вируса (прегеномную РНК и S-РНК) через несколько дней после введения в клетки. Одним из основных препятствий на пути использования систем CRISPR/Cas9 в клинической практике является возможность внецелевого действия нуклеаз. С помощью прямого сравнения классической системы Sp CRISPR/Cas9 и впервые описанной ортологичной системы St CRISPR/Cas9 в наших работах было продемонстрировано, что SpCas9 вызывает образование частых внецелевых разрывов в геноме, тогда как при использовании StCas9 внецелевое разрезание не детектируется, и эту систему можно рассматривать как безопасный и эффективный инструмент для создания противовирусных препаратов на основе CRISPR/Cas9. Низкая внецелевая активность системы St CRISPR/Cas9 связана не только с длинным мотивом РАМ, необходимым для разрезания мишени, но и с особенными свойствами StCas9 белка. Классический SpCas9 игнорирует до 5-6 несовпадений нуклеотидов между РНК-проводником и ДНК-мишенью, что существенно расширяет спектр возможных внецелевых мишеней в геноме человека. Напротив, активность StCas9 практически полностью блокируется при более, чем одном неспаренном нуклеотиде. Следующим крупным достижением стало создание подхода по активации внутриклеточных факторов иммунного ответа, а именно дезаминаз семейства АРОВЕС/AID. Ранее в нескольких крупных работах было показано, что дезаминазы АРОВЕС3А и АРОВЕС3В могут привлекаться к ккзДНК HBV, вызывать масштабное дезаминирование вирусного генома и деградацию ккзДНК, при этом не действуя на геном человека. Главное препятствие на пути клинического использования АРОВЕС-дезаминаз для лечения вирусных инфекций является их активация. Активировать АРОВЕС-дезаминазы удается только с помощью сверхвысоких доз интерферона или потенциально опасных цитокинов, участвующих в пути TNF-alpha, либо используя генетически видоизмененные Т-клетки. Воспользовавшись недавно созданным инструментом активации транскрипции внутриклеточных факторов dCas9-p300 и dCas9-VP64 нам удалось добиться активации АРОВЕС/AID дезаминаз в 6-3500 раз, что значительно превышает результаты по использованию цитокинов. В результате, всего за 24-48 часов активации факторов удается добиться значительного подавления инфекции HBV и деградации до 80-90% пула ккзДНК HBV. Всесторонний анализ нежелательных явлений активации АРОВЕС/AID дезаминаз подтвердил безопасность подхода для факторов АРОВЕС3А и АРОВЕС3В.