Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Осуществлена фенотипическая оценка 510 образцов нута из коллекции ВИР. Основной состав изученной выборки – старые местные сорта из центров происхождения и первичного распространения нута (Передней Азии, Средиземноморья, Индийского субконтинента и Кавказа), поступившие в коллекцию с 1916 по 1988 гг. из 20 стран мира. В качестве внешней группы в исследование привлечены современные селекционные сорта: 8 российской и 3 украинской селекции. По итогам фенотипической оценки образцов на Кубанском филиале ВИР создана база данных в формате Excel. Анализ этой базы данных показал размах изменчивости изученных признаков, степень их варьирования и характер изменчивости в зависимости от района происхождения/произрастания. Географические закономерности в распределении генов культурных растений, установленные Н.И.Вавиловым (1927), нашли подтверждение в изученном нами генофонде местных сортов нута. Выявлены регионы, где нужно искать формы с определенными признаками или их сочетанием. По имеющимся в ВИРе данным оценки староместных образцов нута из центров происхождения культуры, осуществленных в исторической перспективе участниками данного проекта, было проанализировано их фенотипическое разнообразие. Результаты анализа показали, что по диапазону изменчивости изученных признаков и их взаимосвязи образцы из первичного (Турция) и вторичного (Эфиопия) центров различались. Меньшая степень варьирования и примитивность большинства признаков, а также меньшая семенная продуктивность у эфиопских местных сортов по сравнению с турецкими свидетельствует о большей селекционной продвинутости последних. Полезные признаки для селекции имеются в образцах из обоих центров происхождения и разнообразия нута. Выполнено секвенирование с 30‒ти кратным покрытием и проведена сборка геномов для 96 староместных сортов. Поиск вариантов и компьютерная обработка выполнены для всех староместных сортов и дополнительно для 134 геномов диких сортов C. reticulatum / C. echinospermum, а также для 44 геномов современных селекционных сортов из работы Varshney et al. 2013. Было идентифицировано 7.1М однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и 1.5М коротких инсерций/делеций (INDEL). Учитывая размер собранных и аннотированных последовательностей, составляющий часть размером ~350МБ от чернового генома, мы можем оценить количество SNP - 20 SNP/кб. Почти все SNP были полиморфными внутри диких сортов (6.8М, 96%) в отличие от культивируемых сортов (0.546М, 8%). Нуклеотидное разнообразие было самым высоким у диких сортов C. reticulatum и самым низким у культивируемых сортов C. arietinum, что согласуется с тем, что было обнаружено в предыдущих работах. Проведен экогеографический, фенотипический и геномный анализ 147 самых ранних образцов нута из Турции и Эфиопии. Они представляют собой центр происхождения нута и основную локализацию вторичного разнообразия. Генотипирование путем секвенирования идентифицировало 16,816 сегрегирующих однонуклеотидных полиморфизмов, большинство из них является общими для популяций, а часть - уникальными, что отражает дивергенцию популяций. Анализ GWAS выявил десятки интервалов генома и потенциальных генов-кандидатов, которые могут влиять на важные агрономические признаки. Генетическая наследуемость отвечает за большую часть вариабельности в большинстве фенотипов, которая в свою очередь отражает условия окружающей среды в местах сбора образцов. Большая часть ассоциированных однонуклеотидных полиморфизмов локализуются в одной хромосоме 4 и связаны с несколькими признаками. Мы предполагаем, что селекция и интрогрессия посредством спонтанной гибридизации между более и менее развитыми морфотипами могли привести к объединению генов, ответственных за улучшенные агрономические свойства, в геномные «агро острова», и к отношениям генотип-фенотип, напоминающих плейотропию. Кроме того, различные совместно адаптированные комплексы преобладают в контрастных окружениях. Для реконструкции сети цветения у нута с помощью математических моделей разработан алгоритм эволюционного моделирования. Получены гибриды F1 путем реципрокных скрещиваний двух культивируемых сортов нута - ICCV 10 и ICC 14778 и двух староместных сортов.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Исследована степень полиморфизма и выполнен популяционно-генетический анализ староместных сoтов из коллекции ВИР, 985 образцов диких видов C.reticulatum и C.echinospermum и 56 культурных сортов C.arietinum. Показано, что наименьшее число полиморфных локусов обнаружено у культурных сортов C.arietinum, наибольшее у диких форм C.reticulatum. Среди образцов C.reticulatum достоверно выделяется 8 популяций, а образцы C.echinospermum распределились по 4 популяциям. Современные коммерческие сорта образуют одну группу, близкую популяциям C.reticulatum. Для всех староместных сортов, образцов диких видов и культурных сортов востановлены агроклиматические данные в местах сбора. Выявлены достоверные различия между популяциями C.reticulatum и C.echinospermum по агроклиматическим показателям. Анализ влияния экологии на генетическую дифференциацию образцов показал, что высотный градиент сильнее скоррелирован с частотами аллелей, характеризующими популяцию, нежели чем географическое расстояние. Рекомбинантные популяции растений F2 от скрещиваний 26 генотипов дикого типа (20 C.reticulatum и 6 C.echinospermum) с культурным образцом ICCV96029 были самопылены и полученные растения F3 фенотипированы в 2017 году на Кубанской опытной станции ВИР по устойчивости к аскохитозу и другим признакам. Повторное фенотипирование 510 образцов нута из коллекции ВИР проведено для определения вклада генотипической и средовой составляющих в фенотипическую изменчивость изученного фрагмента коллекции ВИР. По результатам оценки составлена оценочная база данных. На данном этапе выявлены признаки, не подверженные влиянию среды (высота растений и высота прикрепления нижнего боба, линейные параметры боба), а признаки продуктивности связаны в основном с условиями года, причем в 2016 и 2017 гг. задействованы разные системы адаптации, и по продуктивности выделяются совершенно разные образцы. Поражаемость образцов аскохитозом на естественном инфекционном фоне достоверно различалась по годам изучения. В 2016 г. она составляла в среднем 3,9 балла по изученной выборке, в 2017 – 4,7 балла. Следующим этапом будет выявление стабильно в течение двух лет наименее поражаемых образцов с целью изучения их как источников устойчивости к заболеванию. В наименьшей степени поражались образцы из Германии, Молдавии, Украины и России, представленные преимущественно селекционными сортами. Максимально поражались местные сорта из Пакистана, Марокко и Бирмы. На инфекционном фоне степень поражаемости аскохитозом в целом по массиву возрастала от фазы цветения к фазе созревания. Селекционные сорта поражались в значительно меньшей степени как в фазе цветения, так и в фазе созревания. Поражаемость селекционных сортов оставалась стабильной по фазам, у местных сортов она возрастала от цветения к созреванию. Фактом, требующим дальнейшего осмысления, является то, что, не смотря на более высокую степень поражаемости образцов аскохитозом в 2017 г., в целом параметры продуктивности растений были выше. Это предполагает дальнейший анализ в контексте климатических данных года. По фенотипическим данным, полученным в Сирии вблизи Алеппо, для староместных сортов из коллекции ВИР, собранных в Турции и Эфиопии были построены нелинейные регрессионные зависимости времени цветения от известных климатических данных. Сравнение моделей показало статистическую значимость различий между староместными сортами, собранными в Турции и Эфиопии. Зависимость времени цветения для образцов староместных сортов, собранных в Турции от среднегодовой температуры и отсутствие таковой староместных сортов, собранных в Эфиопии может являться следствием того, что в Эфиопии среднегодовые температуры относительно постоянны и способность реагировать на их изменения была утрачена. Проведен полногеномный анализ ассоциаций (для данных с импутацией и без) 144 староместных сортов Вавиловской коллекции, собранных в Турции и Эфиопии с фенотипическими данными, полученными в 2016 и 2017 годах на Кубанской опытной станции ВИР. Анализ GWAS выявил большое количество интервалов генома и потенциальных генов-кандидатов, которые могут влиять на важные агрономические признаки. Большинство наблюдаемых значимых мутаций находятся на 4 хромосоме генома нута, треть от всех значимых мутаций связана с несколькими фенотипическими признаками.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведен полногеномный анализ ассоциаций 407 староместных сортов Вавиловской коллекции, собранных в 33 странах с фенотипическими данными, полученными в 2016 году на Кубанской опытной станции ВИР и с биоклиматическими данными с мест сбора образцов. Также, был проведен анализ ассоциаций между SNP и 8 биоклиматическими ковариатами. Анализы выявили большое количество интервалов генома и потенциальных генов-кандидатов, которые могут влиять на важные агрономические признаки. Большинство наблюдаемых значимых мутаций находятся на 8 хромосоме генома нута. 12 SNP значимо ассоциированы с несколькими фенотипическими признаками и/или биоклиматическими факторами (признаками, ковариатами). Окультуривание и последующая селeкция привели к стократной эрозии генетического разнообразия в современных сортах нута. Соответствующее уменьшение изменчивости признаков создают потребность и возможность выявления и использования генетического потенциала диких видов для улучшения сельскохозяйственных культур. Мы проанализировали сегрегацию признаков в серии гибридных популяций от скрещивания диких видов на культивируемые сорта, чтобы выявить генетические основы признаков одомашнивания. Два вида дикого нута, C. reticulatum и C. echinospermum были скрещены с элитным, рано цветущим сортом C. arietinum ICCV96029. KASP генотипирование родителей F2 с использованием FT-сцепленного молекулярного маркера позволило отобрать 284 семейства F3 с пониженной фенологической вариацией: 255 семейств F3 C. arietinum x C. reticulatum (AR), полученных от 17 разных диких родителей, и 29 семейств F3 C. arietinum x C. echinospermum (AE) от 3 диких родителей. Эти 284 линии были генотипированы по методу генотипирования путем секвенирования и фенотипированы по агрономическим признакам. 50 QTL ассоциированных с 11 признаками были обнаружены в скрещиваниях AR и 35 QTLs с 10 признаками в комбинированных данных. Используя иерархическую кластеризацию для объединения признаков в шесть скоррелированных групп и технику множественного картирования на основе смешанных моделей, были идентифицированы четыре плейотропных локуса. Байесовский анализ дополнительно идентифицировал четыре взаимосвязи между признаками, контролирующими продолжительность вегетативного роста и созревания семян, для которых лежащие в основе плейотропные гены были картированы. Знание генетической основы признаков, сегрегирующей в гибридных популяциях между дикими и культурными формами, облегчит улучшение нута путем объединения генетической и фенотипической изменчивости на платформе количественной генетики. Нелинейные регрессионные модели времени цветения в зависимости от климатических факторов были построены для диких сортов нута, собранных в 21 области Турции. Был предложен подход, в котором аналитический вид управляющей функции вместе с регрессионными коэффициентами и набор предикторов определяются автоматически, путем стохастической минимизации отклонения решения модели от данных. Таким образом, более широкий круг нелинейных зависимостей между фенотипом и факторами может быть исследован. В предложенном подходе биогеографический анализ состоит в рассмотрении управляющих функций климатических факторов и коэффициентов регрессионной модели. При этом, используя модели для отдельных групп растений, объединенных общим местом сбора либо генотипом, было проведено сравнение влияния климатических факторов на фенотип, т. к. различие оценок между группами может указывать разницу в адаптивности групп к изменениям данного фактора. Эффекты длины дня и температуры на время цветения зависят от области. Мы также смогли продемонстрировать, что некоторые переменные среды по-разному влияют на время цветения генотипов с различными комбинациями аллелей в пяти из шести полиморфных позициях. Например, различные комбинации аллелей в SNP1 по-разному реагирует на изменение длины дня. Это важная особенность, которая может быть использована на практике. Анализ моделей показал, что взаимодействия климатических факторов с местами сбора объясняют 14.7% дисперсии времени цветения, а взаимодействия с генотипом – около 17.2%. Было показано, что взаимодействия климатических факторов с местами сбора растений значимы для 15 из 21 места сбора. Все генотипы взаимодействуют с температурой и длиной дня, кроме того, SNP3 взаимодействует с относительной влажностью и SNP4 – с количеством осадков. Для 4 из 6 SNP обнаружена сильная корреляции между частотами аллелей в 15 популяциях и среднегодовым количеством осадков в областях сбора растений, причем в популяциях с наибольшим количеством осадках аллели трех из этих 4 SNP фиксированы. Результаты работы были представлены на конференции BGRS-2018 и приняты к опубликованию в журналe BMC Genomics (Kozlov et al., 2018) и журнале Генетика (Козлов и др., 2019). Разработана математическая модель, описывающая динамику экспрессии основных генов, контролирующих переход к цветению в нуте. С помощью этой модели реконструирована генная сеть времени цветения у сорта нута ICCV 96029. Показано, что генная сеть цветения в ICCV 96029 в целом соответствует сети, охарактеризованной в Arabidopsis thaliana. Показано, что модель не применима к сорту нута CDC Frontier, в результате чего выдвинута гипотеза о том, что генная сеть, реконструированная по данным для ICCV 96029, значительно возмущена в CDC Frontier. В результате моделирования для ICCV 96029 сделано предположение об аддитивности активирующих вкладов от пяти паралогов гена FT в передаче сигнала о переходе к цветению. Показано, что различные регуляторные свойства белка AP1 в регуляции генов TFL1a и TFL1c, связанные с возможной различной кинетикой ассоциации с их промоторами, могут быть ответственны за различие в экспрессии этих генов в ICCV 96029. Результаты работы были представлены на конференции BGRS-2018 и опубликованы в журналe Frontiers in Genetics (Gursky et al., 2018) и приняты к опубликованию в журнале Биофизика (Гурский и др., 2019). Время цветения - важный агрономический признак, поскольку он определяет, когда происходит переход от вегетативного роста к репродукции. Во многих крупных районах производства нута сезон, благоприятный для его выращивания чрезвычайно короткий, и засуха или морозы начинаются раньше, чем наступает созревание. Таким образом, раннее зацветание является критически необходимым для этой культуры. В отличие от культивируемых сортов, дикие формы нута нуждаются в яровизации и длинном световом дне. Для использования диких форм как источника изменчивости для улучшения современных сортов нута важно расшифровать взаимодействия генов, ответственных за раннее зацветание. Мы вырастили четыре генотипа культурного нута C. arietinum и четыре генотипа дикого нута C. reticulatum и C. echinospermum. Были собраны следующие типы образцов: листья до зацветания, листья после зацветания и бутоны на начальных стадиях их формирования. Образцы культурного нута собирали при двух условиях выращивания растений– с предварительной яровизацией и без нее. Т.к. дикий нут без яровизации не зацветал, для генотипов C. reticulatum и C. echinospermum собирали образцы с предварительной яровизацией. Для каждого типа образцов было собрано не менее 3-х независимых биологических повторностей. В итоге было отобрано 144 образца, содержащих достаточное количество и качество материала для выделения РНК, приготовлены библиотеки кДНК и выполнено секвенирование библиотек по методу Illumina. У сельскохозяйственных культур растений избыток вредных мутаций приводит к снижению урожайности, поэтому вопрос об уровне накопленных вредных мутаций в популяциях растений, в частности нута, имеет первостепенное значение для улучшения культур. Мы разработали и апробировали на млекопитающих (в виду доступности хорошей аннотации вредных и нейтральных мутаций на момент выполнения работы) новый метод классификации мутаций на вредные и нейтральные, который использует технику Переноса знаний (Transfer learning) (TL) (Plekhanova et al., 2018), позволяющую строить предсказательные модели одновременно на совокупности целевого набора данных (например выбороках нейтральных и вредных мутаций млекопитающих или растений) и вспомогательного, большего размера и близкого по смыслу к целевому (например, такой же выборки мутаций человека. Убедившись в хорошей предсказательной силе нашего метода, мы попытались адаптировать этот метод к аналогичной задаче на растениях. В качестве вспомогательной выборки была использована только что опубликованная база аннотированных и верифицированных миссенс-мутаций для Arabidopsis thaliana (Kono et al., 2017), в качестве целевых ‒ набор вредных и нейтральных мутаций у риса (Orýza sativa), гороха (Pisum sativum). По результатам тестирования нескольких классификаторов в сочетании с техникой ТЛ и без был выбран показавший наибольшую точнось классификатор Случайный лес, который затем использовали для предсказаний вредных мутаций в геномах староместных сортов нута. Анализ частот разных типов мутаций показал, что разработанный метод достаточно точно классифицирует миссенс-мутации нута на вредные и нейтральные. Результаты работы были представлены на конференции BGRS-2018 и опубликованы в журналах Evolutionary Applications (PLekhanova et al., 2018) и Frontiers in Plant Science (Kovalev et al., 2018).