Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Картофель – одна из стратегических продовольственных культур в мире, в том числе и в России. Огромные, до половины собранного урожая семенного и товарного картофеля из-за бактериозов стали одной из наиболее критических проблем отечественного картофелеводства. Основной экономический ущерб картофелеводству наносят энтеробактерии Pectobacterium atrosepticum (Pa), P.carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) и Dickeya spp (Dsp), вызывающие «мокрые» или «мягкие» гнили растений. Одним из перспективных подходов биологического контроля патогенных бактерий в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве считается применение бактериофагов – вирусов бактерий, их естественных паразитов и регуляторов микробных популяций. В силу своей высокой специфичности и биобезопасности стратегия использования природных фагов, инфицирующих конкретные виды бактерий - привлекательный способ борьбы с фитопатогенами. Выполняемый проект исследует возможность применения композиций бактериофагов, инфицирующих пектолитические (мягкогнилостные) патогены картофеля, для предотвращения инфекции и развития бактериальных заболеваний при хранении картофеля. Важнейшим подготовительным этапом, выполненным в ходе первого года проекта, является создание охарактеризованной и систематизированной референтной коллекции пектолитических бактерий, отражающей разнообразие и географическую распространенность этих микроорганизмов. Коллекция, включающая 161 штамм, была охарактеризована микробиологическими и молекулярно-генетическими методами. Выявленные 104 штамма, относящиеся к родам Pectobacterium и Dickeya, распределяются на 17 групп RAPD и AFLP фингерпринтингом. Таксономическая принадлежность штаммов-представителей групп была подтверждена 16S рРНК-секвенированием. Часть генетических групп совпадает с таксономическими родами (D.solani, P.wasabie), при том, что представители генетически дивергентного подвида P.carotovorum subsp. carotovorum распределяются на 10 групп. Полученная систематизация позволит далее оценить существующие методы молекулярной диагностики Pectobacterium и Dickeya, и выбрать наиболее оптимальные с точки зрения специфичности. При перекрестном тестировании имеющихся в коллекции «МикроБиоФарм» бактериофагов Pa, Pcc и Dsp было выявлено наиболее интересное наблюдение – соответствие инфекционного диапазона фага и выявленных генетических групп штаммов. Это свойство отражает генетическое родство штаммов микроорганизмов и, предположительно, зависит от структуры поверхностного полисахарида бактерий, который служит первичным рецептором специфической адсорбции фага. Данное наблюдение позволило рационализировать дальнейшую селекцию бактериофагов и выделить около 30 новых фаговых изолятов, специфических к 8 из 17 групп Pectobacterium и Dickeya. Для дальнейшего детального изучения были выбраны 20 бактериофагов. Собранная коллекция охарактеризованных литических бактериофагов будет служить основой для создания полифаговых составов (коктейлей) против различных сочетаний штаммов патогенов, выявленных в конкретных биоценозах и тестирования на широком круге моделей. Для 9 геномов бактериальных штаммов, принадлежащих к разным генетическим группам, и 8 бактериофагов были приготовлены геномные библиотеки и проведено полногеномное секвенирование по методу MiSeq (Illumina). Анализ и аннотация показали, что при общем консерватизме основы (кора) бактериальных геномов выявляются определенные различия в генах, влияющих на патогенез, а также кодирующих белки метаболизма полисахаридов. Завершенные аннотации шести вирусов депонированы в NCBI Genbank (номера KX278418.1 (РР16), KY250035 (РР47), KY084243 (РР74), KX278419.1 (РР90), KY250034 (PP99), KY087898 (РР101). Эти бактериофаги, относящиеся к семействам Podoviridae и Myoviridae, по совокупности биологических и генетических свойств могут служить основой для конструирования фаговых препаратов биоконтроля.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Одним из перспективных подходов биологического контроля патогенных бактерий в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве считается применение бактериофагов – вирусов бактерий, их естественных паразитов и регуляторов микробных популяций. В силу своей высокой специфичности и биобезопасности стратегия использования природных фагов, инфицирующих конкретные виды бактерий - привлекательный способ борьбы с фитопатогенами. Ключевой задачей первых двух лет проведения проекта было создание разносторонне охарактеризованной референтной коллекции патогенов картофеля родов Pectobacterium и Dickeya, предназначенной для селекции специфических бактериофагов, мониторинга распространения патогенов, проверки и разработки методов молекулярной диагностики. В результате проверки более 300 изолятов было сформированно ядро коллекции, включающее 80 штаммов, подразделенных на 15 генетических групп. Штаммы, входящие в ядро, охарактеризованы по фитопатогенности, биохимическим и физиологическим параметрам, последовательностям MLST, чувствительности к имеющимся бактериофагам, а также генетическим фингерпринтингом RAPD, BOX-PCR, AFLP. Проверка показала, что 93% изолятов возбудителей мягких гнилей картофеля, выделенных в 2017 г в Центрально-Европейской части России, относятся к группам патогенов, входящим в ядро коллекции. В NCBI GenBank были депонированы 15 аннотированных геномов штаммов, секвенированных в течение 2016-2017 годов, 12 из которых - представители различных генетических групп коллекции. С учетом изменений в таксономическом распределении Pectobacterium и Dickeya, предложенных в 2016-2017 гг, 1 штамм относится к Pectobacterium parmentieri, 1 - P. atrosepticum, 2 - Dickeya solani, 2 - P. carotovorum subsp. brasiliense, 1 - P. carotovorum subsp. carotovorum, еще 5 штаммов относятся к устойчивой на территории России популяции штаммов вида P. carotovorum, по данным сравнительной геномики представляющей собой новый геномовид. Три штамма представляют энтеробактерии рода Lelliottia sp., устойчиво ассоциированные с патогенезом мягкой гнили, обладающие некоторой пектолитической активностью и чувствительные к бактериофагам, специфическим к Pectobacterium и Dickeya. Анализ геномов штаммов Lelliottia выявил наличие генов, которые могут служить причиной ложноположительных сигналов при ПЦР-идентификации пектобактерий. Также эти штаммы могут быть использованы в качестве технологических непатогенных хозяев при культивировании бактериофагов. На основании референтной коллекции был сформирован набор из 15 охарактеризованных штаммов – представителей разных таксонов и генетических групп, составляющих суммарную обогатительную культуру для поиска и селекции бактериофагов. В результате 10 сеансов выделения бактериофагов из проб окружающей среды (патогенный материал картофеля на свалках, вода из водоемов близ полей с очагами проявления черной ножки, моечная вода с пунктов сортировки картофеля, сточные воды) были получены 34 изолята литических бактериофагов. После проверки биологических свойств для дальнейшего углубленного исследования были выбраны 12 бактериофагов. Особый интерес представляют фаги с аномально широким инфекционным спектром. Суммарный спектр действия in vitro 20 бактериофагов, имеющихся в коллекции, покрывает 80% генетических групп и 75% исследованных штаммов. Для тестирования биозащитных свойств был скомпонован экспериментальный фаговый препарат (коктейль), представляющий собой смесь стерильных очищенных лизатов фагов PP16, PP35, PP74, РР81, PP101 в концентрации 108 бое/мл по каждому компоненту. Этот состав полностью охарактеризованных литических фагов должен обеспечивать защиту от ок.70% вариантов штаммов пектолитических патогенов, представленных в коллекции. Ломтики картофеля искусственно инфицировались комплексной смесью бактерий (патогенных и сопутствующих), входящем в состав мягкой гнили картофеля. Далее по накоплению размягченной в процессе инфекции при 28оС растительной ткани отслеживали защитное действие. Фаговый препарат приводит к 30-45% сокращению гнилостного поражения. Аналогичные эксперименты были проведены на целых клубнях картофеля условиях, эмулирующих картофелехранилище и последующее хранение в торговых сетях. Обработка фаговым препаратом эффективно минимизирует и локализует мацерацию тканей, сохраняя товарный вид клубней. Для выяснения роли поверхностных полисахаридов бактерий Pectobacterium и Dickeya в специфичности действия бактериофагов в геномах бактериофагов были выявлены гены, кодирующие хвостовые шипы с предполагаемой полисахарид-деацетилазной (РР47, РР74, РР81, PP90, РР99, РР101) и деполимеразной (РР16, РР35) активностью. Гены были клонированы в плазмидный вектор и получены рекомбинантные белки. Белки хвостовых шипов проявляют активность in vitro, что позволяет исследовать молекулярные механизмы селективной адсорбции фагов и ферментативной модификации/ деградации бактериальных полисахаридов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В последний год выполнения проекта завершено создание иерархической референтной коллекции штаммов Pectobacterium и Dickeya. Ядро коллекции составляют 68 штаммов, включающие представителей групп штаммов, определенных на основании генетического фингерпринтинга и наиболее важные штаммы, не входящие в группы. Всего коллекция содержит около 180 охарактеризованных изолятов, включая представителей атипичных таксонов, ассоциированных с патогенезом мягкой гнили растений (Pseudomonas, Xanthomonas, Stenotrophomonas, Enterobacteria, Lelliottia, Morganella, Pantoea). Полученная коллекция является наиболее полной коллекцией пектолитических патогенов картофеля в России. На основе коллекции сформирован набор из 16 полностью охарактеризованных штаммов - представителей разных таксонов и генетических групп, который составляет обогатительную культуру для поиска и селекции бактериофагов. В результате из проб окружающей среды (патогенный материал картофеля на свалках, вода из водоемов близ полей с очагами проявления черной ножки, сточные воды) был получен 31 изолят литических бактериофагов. В настоящее время сформирована панель из 52 бактериофагов, для 25 из которых известны полностью или частично секвенированные геномы. Суммарный спектр действия in vitro бактериофагов, имеющихся в коллекции, покрывает все штаммы ядра коллекции и более 90% всех штаммов коллекции, идентифицированных как Pectobacterium и Dickeya. Проведен полевой опыт, продемонстрировавший, что включение даже одного бактериофага широкого спектра действия (РР16) к стандартному препарату для обработки посадочного материала на порядок снижает осеменённость клубней собранного урожая. Другим выраженным эффектом, для объяснения которого на данный момент не имеется исчерпывающего объяснения, было значительное повышение всхожести обработанных фагом клубней. В результате полевого опыта продемонстрировано более чем 5-кратное увеличение урожайности с кв. метра поля в случае обработки семенного материала препаратом бактериофага. Столь значительный эффект нельзя считать статистически стабильным. Однако очевидно, что обработка растений бактериофагами приводит к положительным результатам не только в случае защиты клубней картофеля от мягкой гнили при хранении собранного урожая, но и при обработке семенных клубней для защиты растения во время вегетации. В 2018 году проведен мониторинг патогенов картофеля родов Pectobacterium и Dickeyа, циркулирующих в текущем сельскохозяйственном сезоне. В течение года пектолитические изоляты, выделенные в 7 субъектах Европейской части РФ, были исследованы по унифицированной схеме, включающей биохимическую характеристику, генетический фингерпринтинг и определение чувствительности к бактериофагам. Выявленные пектолитические бактерии таксономически относятся к 5 видам/подвидам/геномовидам: P. carotovorum subsp. brasiliense (Pcb, 4 изолята), P. carotovorum subsp. carotovorum (Pcc, 7 изолятов), P. carotovorum gsp. maceratum (Pcm), 13 изолятов), P. polaris (Ppo, 5 изолятов), P. parmentieri (Ppa, 4 изолята). Бактерий P. atrosepticum и Dickeya spp., в 2014-2016 гг составлявших заметную часть возбудителей мягкой гнили картофеля в РФ, обнаружено не было. Главным выводом в контексте данного проекта служит принадлежность выявленных пектолитических патогенов к 6 ранее систематизированным по генетическому фингерпринтингу и фагочувствительности группам. Единственный не присутствующий в имеющейся коллекции вид, выявленный трёх пробах, P. polaris, был идентифицирован как новый вид пектобактерий лишь в 2017 году и, по-видимому, был занесен в Россию через импортируемый семенной картофель. Изолированная чистая культура P. polaris F171 была введена в качестве типового штамма в состав накопительной культуры для выделения бактериофагов, и специфические к этому патогену бактериофаги были выделены в кратчайшие сроки. На основе результатов мониторинга был скомпонован состав бактериофагов, универсально инфекционный по отношению ко всем актуальным патогенам. Для бактериофагов, входящих в препарат, были проведены эксперименты по оптимизации условий культивирования в жидкой среде, сравнение биологических параметров инфекции при унифицированных условиях, подбор множественности стартовой инфекции, обеспечивающей наиболее равномерную по урожайности продукцию фаговых частиц, опробованы различные методы очистки бактериофагов. В состав экспериментального коктейля входят 5 бактериофагов (PP47, PP101, Q21, Q25, Q50) в концентрации 1010 бое/мл по каждому компоненту. В течение сезона хранения товарного картофеля (зима 2018-2019) препарат хранится при 4оС и добавляется в разведении 1:100 или 1:1000 (конечная концентрация вирусных частиц 108 или 107 бое/мл по каждому бактериофагу) в системы поддержания влажности в хранилище и в моечную воду при обработке товарного картофеля в процессе расфасовке для отправки в торговые сети. Эффективность действия препарата будет оцениваться по количеству возникающих гнилостных поражений во время хранения на складе, в котором производится обработка фагами, и в контрольном складе, где в системы поддержания влажности и мойки картофеля препарат бактериофагов не добавляется. Для выяснения роли поверхностных полисахаридов бактерий Pectobacterium и Dickeya в специфичности действия бактериофагов в геномах бактериофагов были выделены и очищены в препаративных количествах О- полисахариды штаммов D. solani F012, P. parmenieri F148, P. carotovorum subsp. brasiliense F152 и P. carotovorum subsp. carotovorum F160. С помощью ЯМР для этих полисахаридов были определены структуры, не имеющие аналогов среди других представителей Enterobacteriales. В геномах бактериофагов, инфицирующих эти штаммы, были определены гены, кодирующие белки хвостовых шипов, предположительно ответственных за связывание и ферементативную деградацию или модификацию полисахаридов (PP35 ORF 156, PP74 ORF44, PP99 ORF51 и PP101 ORF80). Гены были клонированы в плазмидный вектор и получены рекомбинантные белки. Показано, что белки хвостовых шипов проявляют ферментативную активность in vitro. Для полисахарида D. solani процесс ферментативного гидролиза полисахарида белком PP35 gp 156 экспериментально подтвержден с помощью масс-спектрометрии. Идентичный по составу полисахарид и аналогичный механизм его деградации рекомбинантным PP35 gp 156 были обнаружены в штамме Lelliottia F154, непатогенного почвенного комменсала. Таким образом, объяснена способность бактериофага РР35 одинаково эффективно инфицировать бактерии, представляющие собой эволюционно отдаленных представителей отряда Enterobacteriales. Идентификация альтернативного непатогенного хозяина позволяет высказывать предположения об экологическом распространении бактериофагов патогена с недавним эволюционным происхождением, а также использовать этот штамм для препаративного культивирования бактериофага РР35 в целях создания фагового препарата.