Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Целью проекта на первый год являлось выявление генов, связанных с устойчивостью льна к неблагоприятной кислотности почвы и фузариозному увяданию и определение механизмов их действия. На кислых почвах с pH ниже 5 алюминий (Al) переходит в почвенный раствор и становится высокотоксичным для растений. Мы секвенировали 16 транскриптомов устойчивых (Hermes и TMP1919) и восприимчивых (Лира и Оршанский) к Al сортов льна, выращенных в контрольных условиях и после 4, 12 и 24 часов воздействия Al. Для каждой секвенированной библиотеки кДНК получено от 44,9 до 63,3 млн. прочтений. На основе данных высокопроизводительного секвенирования идентифицированы гены с дифференциальной экспрессией при воздействии Al. Определены 50 генов со значительным повышением и 50 генов со значительным снижением экспрессии у устойчивых и восприимчивых сортов льна при воздействии Al. Большинство из 50 генов, для которых было характерно повышение экспрессии, вовлечены в трансмембранный транспорт как у восприимчивых, так и устойчивых сортов. В то же время, гены, кодирующие глутатион-S-трансферазы (GST) и UDP-гликозилтрансферазы (UGT), вошли в топ 50 генов с повышенной экспрессией только для устойчивых к алюминию сортов. Методом количественной ПЦР (кПЦР) проведен анализ экспрессии на расширенной выборке и выявлена основная тенденция – повышение уровня экспрессии генов, кодирующих UDP-гликозилтрансферазы и глутатион-S-трансферазы, при воздействии Al, особенно после 4 часов. Более того, у устойчивых к алюминию сортов повышение экспрессии было значительнее чем у восприимчивых. Мы полагаем, что защита от токсичного действия алюминия посредством антиоксидантной активности GST является вероятным механизмом ответа растений льна на данный стресс. Мы также считаем, что у растений льна UGT могут быть вовлечены в процессы модификации клеточной стенки и защиты от активных форм кислорода в ответ на стресс от действия алюминия. Для ряда генов, в том числе кодирующих UGT, выявлены полиморфизмы характерные только для устойчивых к алюминию сортов. Таким образом, GST и UGT играют важную роль в ответе растений льна на воздействие алюминия, вероятно, посредством детоксификации активных форм кислорода и модификации клеточной стенки. Нами также изучены изменения экспрессии микроРНК (миРНК) в растениях льна при воздействии алюминия. Проростки двух устойчивых (TMP1919 и Г1071/4_к) и двух восприимчивых (Лира и Г1071/4_о) к действию алюминия сортов подвергали воздействию Al в течение 4 и 24 часов. Из полученного материала подготовлены и секвенированы 12 библиотек малых РНК. Идентифицировано 97 миРНК из 18 консервативных семейств. Для miR319, miR390 и miR393 выявлены изменения уровня экспрессии, связанные с воздействием алюминия. Более того, для miR390 и miR393 изменения были разнонаправлены у устойчивых и восприимчивых к Al генотипов. Участие miR319, miR390 и miR393 в ответе на алюминий у растений льна показано впервые. Предсказанными мишенями для miR319 являются гены семейства TCP, для miR390 – TAS3 и GRF5, для miR393 – AFB2-кодирующие транскрипты. TCP, TAS3, GRF5 и AFB2 регулируют рост и развитие растений. Мы предполагаем, что miR319, miR390 и miR393 играют важную роль в ответе растений льна на Al посредством регуляции процессов роста. Дефицит фосфатов является еще одним фактором, который помимо Al ограничивает рост растений на кислых почвах. Нами выполнено высокопроизводительное секвенирование транскриптомов растений льна, выращенных при нормальных условиях (N), при дефиците фосфата (Р) и избытке питательных веществ (NPK). Проведена сборка транскриптомов, идентифицировано 34924, 33797 и 33698 уникальных транскриптов для N, P и NPK условий соответственно. Нормализация экспрессионных данных позволила нам идентифицировать гены льна с дифференциальной экспрессией в условиях дисбаланса питательных веществ. Для дальнейшего исследования методом кПЦР выбраны 15 генов и проведена оценка уровней их экспрессии на расширенной выборке из 31 растения льна. Существенные изменения уровня экспрессии выявлены для генов, кодирующих белки семейств WRKY и JAZ, в P и NPK условиях. Кроме того, изменения экспрессии генов семейства WRKY отличались в зависимости от устойчивости растений льна к дефициту фосфата. WRKY является одним из крупнейших семейств транскрипционных факторов растений и участвует в разнообразных биологических процессах, в том числе в ответе на биотический и абиотический стрессы. Белки семейства JAZ являются репрессорами фитогормонов жасмонатов, играющих важную роль в росте и развитии растения, а также устойчивости к стрессу. Полученные результаты указывают на вовлеченность белков семейств JAZ и WRKY в ответ на эдафический стресс у льна. Fusarium oxysporum sp. lini вызывает фузариозное увядание и является причиной более чем 20% снижения урожайности льна, а при эпифитотиях потери урожая могут достигать 100%. Нами секвенированы 16 транскриптомов двух восприимчивых (AP5 и ТОСТ) и двух устойчивых (Dakota и № 3896) к фузариозному увяданию сортов льна в контрольных условиях и после заражения Fusarium oxysporum. Получено от 45,7 до 55,7 млн. прочтений для каждого варианта опыта. На основе данных высокопроизводительного секвенирования определили гены льна, уровень экспрессии которых изменялся при заражении растений F. oxysporum. Выбрали 20 транскриптов для анализа на расширенной выборке методом кПЦР. Выявили изменение экспрессии после заражения F. oxysporum для генов, кодирующих гидролазы, UDP-гликозилтрансферазы, глутатион-S-трансферазы, транскрипционные факторы WRKY и белки, связанные с патогенезом (PR). Для ряда генов, в том числе кодирующих хитиназы, выявили полиморфизмы, характерные только для устойчивых сортов льна. Мы предполагаем, что защитным механизмом от F. oxysporum является активация экспрессии антиоксидантов и PR белков. По итогам работы в 2016 г. в журналах, индексируемых в WoS, Scopus или РИНЦ, опубликованы 4 статьи и 1 тезисы, а именно: 1 статья в журнале BMC Plant Biology, 1 статья в журнале Frontiers in Plant Science, 2 статьи в журнале Аграрный Вестник Юго-Востока, а также тезисы в журнале The FEBS Journal. Кроме того, 1 статья отправлена в журнал BioMed Research International и получила положительную рецензию. Представлены устные доклады «Высокопроизводительные методы секвенирования для молекулярной оценки реакции генотипов льна на стрессовые факторы среды» (Международный семинар «Современные технологии производства и выработки льна, обеспечивающие получение новых видов продукции пищевого и лечебно-профилактического назначения», Саратов, 24-26 февраля 2016 г.) и «Изменение экспрессии генов у растений льна в ответ на избыток и недостаток питательных веществ в почве» (XVI Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 14 апреля 2016 г.), а также постерные доклады «Дифференциальная экспрессия генов у растений льна при выращивании в условиях дисбаланса элементов питания» (Международный семинар «Современные технологии производства и выработки льна, обеспечивающие получение новых видов продукции пищевого и лечебно-профилактического назначения», Саратов, 24-26 февраля 2016 г.), «Transcriptomic analysis for flax plants under edaphic stress» и «Gene expression regulation in flax seedlings under aluminum stress» (Plant Biology Europe EPSO/FESPB 2016 Congress, Прага, Чехия, 26-30 июня 2016 г.), «Gene expression profiling of flax (Linum usitatissimum L.) under edaphic stress» (The Tenth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology, Новосибирск, 29 августа – 2 сентября 2016 г.) и «Expression of aluminum responsive microRNAs in resistant and susceptible flax (Linum usitatissimum L.) genotypes» (The 41st FEBS Congress «Molecular and Systems Biology for a Better Life», очная часть конференции отменена, 2016 г.).

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Основными стрессовыми факторами, ограничивающими выращивание растений льна и снижающими урожайность, являются фузариозное увядание, вызываемое грибом F. oxysporum, и неблагоприятная кислотность почвы. Для создания адаптивных сортов необходимо определение молекулярных механизмов устойчивости льна к фузариозному увяданию и неблагоприятной кислотности почвы, а также идентификация генов устойчивости для последующей разработки системы молекулярных маркеров с целью геномной селекции льна, устойчивого к эдафическим стрессам. Нами секвенированы транскриптомы устойчивых к фузариозному увяданию растений льна из BC2F5 популяций, полученных от скрещиваний №3896 × АР5 (рекуррентный родитель АР5) и Dakota × АР5 (рекуррентный родитель АР5) в контрольных условиях и при заражении F. oxysporum в двукратной повторности. Для каждой популяции получили около 50 млн. прочтений для каждого из условий. Дальнейший анализ производили как для данных секвенирования транскриптомов устойчивых (Dakota и №3896) и восприимчивых (АР5 и ТОСТ) сортов и линий, полученных в 2016 году, так и для результатов секвенирования BC2F5 популяций (Dakota х АР5 и №3896 х АР5), полученных в 2017 году. По данным Gene Ontology анализа в устойчивых генотипах льна при заражении грибом экспрессия генов, участвующих в ответе на биотические и абиотические стрессы, повышалась значительнее, чем в неустойчивых. У устойчивых генотипов льна 100 генов с наибольшим повышением экспрессии были связаны с активностью НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ, оксидоредуктаз, комплексом I дыхательной цепи. У восприимчивых генотипов 100 генов с наибольшим повышением экспрессии были вовлечены в другие процессы, в основном связанные с трансляцией. Для идентификации потенциальных генов устойчивости льна к F. oxysporum проведен поиск транскриптов со значительным изменением экспрессии при заражении грибом у устойчивых генотипов (устойчивые сорт, линия и популяции BC2F5), но с незначительными изменениями или их отсутствием у восприимчивых генотипов. В результате выявлено повышение экспрессии генов, кодирующих UDP-гликозилтрансферазу, бета-1,3-глюканазу, белок SRG1, АТФ-азы, транскрипционные факторы MYB, дегидрины и ряд других белков. Мы предполагаем, что идентифицированные гены со специфической индукцией экспрессии в ответ на заражение F. oxysporum в устойчивых генотипах льна являются перспективными потенциальными генами, которые могут определять устойчивость растений льна к фузариозному увяданию. Предложен подход, основанный на кПЦР, для выявления генотипов льна с индукцией экспрессии гена бета-1,3-глюканазы в ответ на заражение грибом, которые могут обладать повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию. Для идентификации ДНК-полиморфизмов, ассоциированных с устойчивостью к фузариозному увяданию, проведен анализ устойчивого (Dakota) и неустойчивого (AP5) сортов льна, а также полученных от их скрещивания F2 гибридов и устойчивой BC2F5 популяции методом секвенирования библиотек с уменьшенной сложностью генома (genome complexity reduction). Для 192 образцов получили более 190 млн. прочтений длиной 80 нуклеотидов. Выявили ДНК-полиморфизмы, ассоциированные с устойчивостью льна к F. oxysporum. Таким образом, выполненная работа приближает нас к идентификации основных генов, определяющих устойчивость растений льна к фузариозному увяданию. Помимо патогенов серьезное ограничение для возделывания льна представляет неоптимальная кислотность почвы. Нами получены данные о повышении экспрессии гена, кодирующего катионно-протонный обменник CAX3, у устойчивых сортов льна при воздействии ионов Al3+ при повышенной кислотности. Можно предположить, что этот Ca2+/H+-обменник задействован в ответе на изучаемый стресс посредством внутриклеточной регуляции с участием ионов Ca2+. Для изучения ответа растений льна на другие связанные с неоптимальной кислотностью почвы стрессы, а именно пониженную кислотность и дефицит цинка, приводящие к «физиологическому угнетению», выбраны сорта с различной устойчивостью к данному стрессу – устойчивый сорт Norlin и неустойчивый Могилевский. Выращено около 200 растений в 4 вариантах опыта: на питательной среде с различной кислотностью (pH 5,5 – контроль, pH 7,5 – стресс) и содержанием цинка (оптимальное и уменьшенное в 1000 раз). 16 кДНК-библиотек секвенированы на платформе Illumina и для каждого образца получено от 30 до 40 млн. прочтений длиной 80 нуклеотидов. При pH 7,5 у растений льна происходило повышение экспрессии генов, вовлеченных в ответ на стрессовые воздействия, и понижалась экспрессия генов, связанных с биогенезом клеточной стенки. При недостатке цинка подобные изменения также имели место, но лишь у устойчивых к изучаемым стрессам генотипов. Кроме того, у устойчивого сорта Norlin в условиях дефицита цинка повышалась экспрессия генов, участвующих в фотосинтезе, а у неустойчивого (Могилевский) – понижалась. При неоптимальной кислотности уровень мРНК участвующих в фотосинтезе генов повышался во всех исследованных образцах, однако у устойчивого генотипа изменения были значительнее. Мы предполагаем, что более эффективная регуляция процессов фотосинтеза при неоптимальной кислотности, особенно при дефиците цинка, может определять устойчивость растений льна к этим стрессам. По итогам работы в 2017 г. в журналах, индексируемых в Web of Science Core Collection, опубликованы или приняты в печать 3 статьи и 1 тезисы, а именно: статьи в журналах BMC Plant Biology, BioMed Research International и Молекулярная биология, а также тезисы в журнале Acta Naturae. На конференциях представлен 1 приглашенный и 3 стендовых доклада.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основными стрессовыми факторами, препятствующими получению высоких урожаев льняного семени и снижающими качество продукции, являются гриб Fusarium oxysporum sp. lini, неблагоприятная кислотность почвы и дисбаланс элементов питания. Создание сортов, устойчивых к стрессовым воздействиям, необходимо для получения стабильно высоких урожаев высококачественной продукции, повышения рентабельности льноводства и обеспечения продовольственной безопасности нашей страны. Для достижения этой цели требуется определение молекулярных механизмов ответа льна на наиболее вредоносные стрессы, идентификация генов, ассоциированных с устойчивостью, а также разработка молекулярных маркеров для геномной селекции льна. Для решения поставленных задач использовали сорта и линии льна из уникальной коллекции Всероссийского научно-исследовательского института льна (ВНИИЛ), контрастные по устойчивости к заражению F. oxysporum, повышенной кислотности почвы и высокой концентрации ионов алюминия, пониженной кислотности почвы, недостатку цинка, фосфатов, а также дисбалансу питательных элементов. Нами проведен анализ данных секвенирования транскриптомов растений льна с различной устойчивостью к эдафическим стрессам. Выполнено сравнение сборок транскриптома, полученных с использованием генома льна в качестве референса и de novo. Сборки, в которых использовался геном льна, не продемонстрировали преимуществ по сравнению с de novo сборками. Это может быть обусловлено тем, что в лучшей на сегодняшний день сборке генома льна сорта Bethune до хромосом не представлено около 15% генома и ее использование в качестве референса при сборке транскриптома приводит к потере части транскриптов. Показано, что использование транскриптомных сборок, полученных для объединенных данных секвенирования нескольких сортов льна, может приводить к ложноположительным результатам при поиске генов с дифференциальной экспрессией. Установлено, что, несмотря на генетические различия между сортами, использование сборки транскриптома, полученной для одного из устойчивых сортов, в качестве референса для картирования прочтений всех изучаемых сортов достаточно эффективно для количественного определения экспрессии генов и позволяет не потерять данные об экспрессии генов устойчивости в случае ее низкого уровня или отсутствия у восприимчивых генотипов. Для поиска различий в изменении экспрессии генов при стрессовых воздействиях между устойчивыми и чувствительными генотипами (при изучении нескольких сортов и линий для каждой группы устойчивости) и выявления генов, потенциально вовлеченных в устойчивость, разработали алгоритм, который учитывает изменения экспрессии генов в чувствительной и устойчивой группах, согласованность изменений внутри каждой группы и различия между группами. Это позволило идентифицировать транскрипты с различиями в изменении экспрессии между группами устойчивых и чувствительных генотипов и определить потенциальные гены устойчивости к эдафическим стрессам. С использованием разработанных подходов для обработки данных секвенирования транскриптомов проведен анализ изменений экспрессии генов у растений льна при различных эдафических стрессах. Показано, что в ответ льна на неблагоприятные воздействия среды вовлечены транскрипционные факторы: повышение экспрессии MYB выявлено при заражении F. oxysporum, изменение экспрессии WRKY – при недостатке фосфатов, дисбалансе элементов питания и высокой концентрации ионов алюминия, а повышение экспрессии генов, кодирующих Agamous-like MADS-box protein, показано при высокой концентрации ионов алюминия и заражении F. oxysporum. Изменения экспрессии генов, кодирующих ионные транспортеры, наблюдались при повышенной кислотности почвы и высокой концентрации ионов алюминия, а также пониженной кислотности и дефиците цинка: в случае недостатка цинка и пониженной кислотности повышалась экспрессия генов ZIP1, ZIP10, NRAMP5, YSL3, а при воздействии ионов алюминия у устойчивых сортов льна повышалась экспрессия гена CAX3. Установлено, что гены, участвующие в биогенезе клеточной стенки, и гены, связанные с метаболизмом активных форм кислорода, включая антиоксиданты, также вовлечены в ответ растений льна на эдафические стрессы, в том числе недостаток цинка, высокую концентрацию ионов алюминия, заражение F. oxysporum. Изменения экспрессии генов, кодирующих MLP-like protein, бета-1,3-глюканазу и UDP-гликозилтрансферазы, наблюдались при большинстве изученных стрессов, однако более значимое повышение экспрессии этих генов было характерно преимущественно для устойчивых генотипов. Таким образом, нами обнаружен ряд генов, вовлечённых в ответ растений льна на несколько эдафических стрессов, а механизмы устойчивости к неблагоприятным воздействиям, вероятно, ассоциированы с модификациями клеточной стенки, изменениями работы ионных транспортеров и транскрипционных факторов, а также повышением экспрессии генов, участвующих в метаболизме активных форм кислорода. Важной задачей проекта была разработка методик оценки устойчивости растений льна к неоптимальной кислотности почвы для четкого разделения генотипов на устойчивые и чувствительные. Это необходимо для изучения коллекций сортов и линий льна на устойчивость к неоптимальной кислотности и при анализе гибридных популяций, в том числе F2 гибридов, когда требуется точная оценка устойчивости индивидуальных генотипов. Нами подобраны условия для выращивания растений льна на провокационных фонах в ящиках, которые четко дифференцируют генотипы на устойчивые и чувствительные к пониженной и повышенной кислотности почвы. Для поиска ДНК-полиморфизмов, ассоциированных с устойчивостью растений льна к заражению F. oxysporum, повышенной и пониженной кислотности почвы проведен анализ F2 гибридов, полученных от скрещивания устойчивых и восприимчивых сортов и линий льна и охарактеризованных по устойчивости к этим стрессам. Проведено секвенирование ДНК-библиотек с уменьшенной сложностью генома с использованием подхода Genotyping-by-Sequencing (GBS). Корреляционный анализ позволил идентифицировать ДНК-полиморфизмы, ассоциированные с устойчивостью к фузариозному увяданию, повышенной и пониженной кислотности почвы, которые могут использоваться в качестве молекулярных маркеров устойчивости генотипов льна к эдафическим стрессам. С использованием GBS-подхода также проведен поиск полиморфизмов для 192 сортов и линий льна, различающихся по устойчивости к различным эдафическим стрессам, а также контрастных по жирнокислотному составу масла и содержанию лигнанов в семени. Для каждого сорта и линии идентифицированы уникальные наборы полиморфизмов, и получены генетические паспорта, которые помогут защитить права селекционеров и осуществлять контроль сортовой чистоты. Кроме того, данные о полиморфизме этих сортов и линий, различающихся по устойчивости к фузариозному увяданию, неоптимальной кислотности и другим важным характеристикам, заложили основу для идентификации полиморфизмов, ассоциированных с хозяйственно ценными признаками льна. Полученные результаты необходимы для развития геномной селекции льна и создания сортов, обладающих комплексной устойчивостью к эдафическим стрессам. По итогам работы в 2018 г. опубликованы или приняты в печать 3 статьи в журналах, индексируемых в Web of Science Core Collection и входящих в первый квартиль (Q1): BMC Plant Biology, Frontiers in Genetics и BioMed Research International. Результаты проекта были представлены на 4 конференциях.