Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За отчетный период первого года проекта (4,5 календарных месяца) разрабатывались методические направления исследований по оценке генетической изменчивости и структуры русских белых кур генофондной популяции ВНИИГРЖ. Данная популяция является идеальным материалом для проведения эффективной селекции, разработки методологии геномной селекции и создания линий кур, используемых в производстве эмбриональных вирусных вакцин. Новая популяция русских белых кур, характеризующаяся адаптационной способностью цыплят первых дней жизни к пониженным температурам, разводилась по линиям до 2002 года, а затем, в силу разных обстоятельств, до 2012 года поддерживалась методом панмиксии, в результате чего линейная структура породы была утрачена. Проектом решаются проблемы структуризации генофондной породы, и благодаря уникальным свойствам птицы создается линия яичных белоскорлупных кур с повышенным выходом экстраэмбриональной жидкости (ВЭЭЖ) для производства вирусных эмбриональных вакцин. Генетическое сходство с популяцией 2001 года проверяется в рамках проекта с помощью анализа результатов генотипирования на чипах Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip, которые уже генерированы фирмой GeneSeek к концу ноября 2016 года и находятся на стадии обработки первичных сырых данных. В селекционной части имелся задел для реализации проекта в виде оценки матерей кур опытной группы по ВЭЭЖ у их 12,5-суточных эмбрионов. Полученное и отобранное (в том числе по продуктивности матерей) потомство со 110-дневного возраста содержалось в индивидуальных клетках с индивидуальной оценкой продуктивности. Создание и пополнение компьютерной базы продуктивных признаков проводилось в течение всего времени опытов. В начале работ по проекту (август 2016 года) проведены отбор и формирование опытной группы из 160 голов кур и 24 голов петухов. Все отобранные петухи были проверены и отвечали требованиям к качеству спермы для искусственного осеменения. Кур оценивали по уровню яйценоскости (ежемесячно за весь период кладки), живой массе, возрасту снесения первого яйца, массе яйца в возрасте 30 недель, а также по ВЭЭЖ у их 12,5-суточных эмбрионов. Статистические расчеты проводились с помощью программ Sigma Plot 12, Gelstats™, Statistica Advanced, PLINK. В генетической части на первом этапе проводили взятие крови у птицы из вены крыла (с применением антикоагулянта ЭДТА). Образцы замораживали и хранили в холодильнике при -20 °С. ДНК выделяли по классической методике с использованием фенольно-детергентного метода. Это позволило дополнить большую коллекцию образцов ДНК нашей лаборатории. Определение качества ДНК проводилось с помощью прибора NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Образцы были отобраны для последующего генотипирования на чипах Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip. В результате проведенной работы по отбору образцов ДНК птицы, участвующей в селекционном опыте, составлен список из 184 образцов кур и петухов русской белой популяции ВНИИГРЖ. Для расширения возможностей сравнительного анализа и дальнейшего использования полученного при генотипировании материала для публикаций нами была взята «архивная» ДНК из коллекции образцов нашей лаборатории. Представляет большой интерес сравнение выборки существующей популяции с образцами 2001 года, взятых у кур из популяции с линейной структурой. Для оценки различий между популяциями была также использована «архивная» ДНК русской белой породы из хозяйства «Генофонд» ВНИТИП (образцы крови предоставлены в 2001 году). Таким образом, был сформирован список из 202 ДНК-образцов русской белой породы. В 2016 году были проведены расчеты генетической изменчивости «архивных» ДНК-фингерпринтов (ранее рассматривались другие сочетания материала) русской белой популяции ВНИТИП и линий 10 и 16 русской белой популяции ВНИИГРЖ. Планируется сравнить эти выводы с данными, которые будут получены при генотипировании по чиповой технологии с учетом десятков тысяч SNP-маркеров. Такая работа была необходима для оценки возможности экстраполяции результатов работы нашей лаборатории по генетическому разнообразию птицы, полученных методом ДНК-фингерпринтинга в 1996–2010 годах. При совпадении оценки изменчивости этими двумя методами появится возможность без проведения дополнительных исследований проследить динамику изменчивости в малочисленных популяциях за 5–20 лет. В целом полногеномная характеристика популяций и пород по множественным SNP-локусам составит в дальнейшем основу для разработки и осуществления геномной селекции с эффективным использованием потенциала отечественного генофонда в птицеводстве России. Одной из задач гранта является поиск ассоциаций с объёмом экстраэмбриональной жидкости 12,5-суточных эмбрионов, в том числе и по отдельным генам, имеющим полиморфизм по типу вставка–делеция (indel). В рамках гранта был проведен поиск возможных генов-кандидатов, связанных с селектируемым признаком. Предполагаем, что на выход жидкости развивающихся эмбрионов курицы оказывают влияние гены, контролирующие рост и развитие эмбриона. Проведенный дисперсионный анализ основных количественных показателей по группам полиморфных вариантов в гене пролактина (-358 PRL, Chr2) показал, что вставка в гене пролактина у кур-матерей увеличивает ВЭЭЖ у зародышей – на 1,3 мл у матерей-гетерозигот и на 1,1 мл у матерей гомозигот, по сравнению с гомозиготами, имеющими делецию в гене пролактина (P<0.01). По уже полученным в декабре результатам генотипирования на чипах Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip в начале следующего года планируется проведение полногеномного поиска ассоциаций (GWAS) с признаком объёма экстраэмбриональной жидкости 12,5-суточных эмбрионов. Несомненную важность как для фундаментальной, так и для прикладной науки имеют исследования, нацеленные на разработку современных методов, соответствующих мировому уровню и используемых для углубленного изучения отечественного генофонда пород кур. В рамках международной коллаборации (п. 1.11 заявки на грант РНФ) совместно с американскими коллегами из Техасского университета A&M проводятся исследования по генетическому разнообразию глобального генофонда кур по локусам бета-дефензинов (пептидов иммунной системы). В 2016 году было изучено 35 пород и популяций, в том числе 25, обследуемых в рамках проекта по гранту РНФ: черный австралорп, черно-пестрый австралорп, бентамка ситцевая, брама палевая, брама светлая, итальянская куропатчатая (бурый леггорн), голубой кохинхин, чешская золотистая, фавероль, курчавая, нью-гемпшир, карликовый кохинхин, голландская белохохлая, род-айланд, китайская шелковая, султанка, суссекс, украинская ушанка, узбекская бойцовая, русская белая, аврора, амрок. Обнаружены специфические дупликации, аллели и SNP-сайты генов бета-дефензинов BD7 и BD6. Изучение встречаемости дупликации BD7 на всем спектре пород позволит оценить изменчивость этой области генома кур для дальнейшего поиска ассоциаций с признаками здоровья птицы. Объединение и использование традиционной селекции и геномных подходов к созданию структуры популяции является важным этапом для разработки методики эффективной селекции, включая подходы геномной селекции. Для этого на первом этапе, используя сформированную базу данных, проведено моделирование структуры популяции с помощью кластерного анализа методом k-средних. Проведен поиск оптимальных моделей кластеризации. Выбран вариант кластеризации, в основу которого были положены показатели происхождения: номер отца, номер матери и ее показатели продуктивности (масса яйца, ВЭЭЖ, отношение объема экстраэмбриональной жидкости к массе яйца), цвет пуха в суточном возрасте, возраст снесения первого яйца, живая масса, яйценоскость, масса яйца, ВЭЭЖ, отношение объема экстраэмбриональной жидкости к массе яйца, масса эмбриона. Данный вариант состоит из трех кластеров, отличающихся происхождением, цветом пуха и продуктивностью. После получения результатов генотипирования на чипах Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip и расчетов будет проведен сравнительный анализ структуры популяции и моделированных кластеров. Результатом этого анализа станут сформированные группы кур для дальнейшего разведения, в которых проведена оценка методических приемов формирования структуры и разработана методология геномной селекции. По тематике гранта сделаны четыре доклада на конференциях: • 1) 31 августа 2016 года, в рамках XXV Международной агропромышленной выставки-ярмарки «Агрорусь-2016», г. Санкт-Петербург, Международная научно-практическая конференция «Современные достижения в генетике и воспроизводстве сельскохозяйственных животных»: Дементьева Н.В., доклад на тему «Полиморфизм ДНК и генов в разведении генофондных популяций кур». URL: https://drive.google.com/file/d/0BzMskZpuV_J1OEl5V3hZdElQTTQ/view • 28 октября 2016 года, г. Санкт-Петербург, Международная научно-практическая конференция «Геномная селекция для сохранения и эффективного использования потенциала генетических ресурсов и создания высокопродуктивных стад». URL: http://vniigen.ru/conf2 o 2) Романов М.Н., Кудинов А.А., доклад на тему «Разработка методологии геномной селекции для сохранения и использования генетических ресурсов кур» o 3) Дементьева Н.В., доклад на тему «Селекция генофондных популяций кур с использованием геномных технологий» o 4) Станишевская О.И., доклад на тему «Методы сохранения и пути использования генофонда кур» По результатам исследований 2016 года на стадии подготовки к публикации находятся две статьи и методические рекомендации на темы: • «Исследования по изучению генетической изменчивости кур-несушек русской белой породы по делециям в гене пролактина и дофамина», • «Проблемы и перспективы сохранения генофондных популяций в России», • «Методические рекомендации по использованию геномной оценки для направленной селекции генофондной птицы». Подана для опубликования одна работа: • «Haplotype structure and copy number polymorphism of the beta-defensin7 genes in diverse chicken breeds» (подача в журнал Animal Genetics от 05.12.2016).

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Основной целью проекта в 2017 отчетном году было продолжение изучения популяционной структуры и анализ геномной архитектуры русской белой породы, а также первый этап изучения геномных изменений у двух- и трехпородных гибридов. Объектом исследования была популяция русских белых кур, разводимая в генофондном хозяйстве Всероссийского НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных (ВНИИГРЖ) в течение 25 поколений с использованием индивидуального подбора. Отличительной особенностью птицы является устойчивость к пониженной температуре выращивания в раннем постнатальном периоде и белый цвет эмбрионального пуха. Проводилось сравнение с предковой популяцией ВНИИГРЖ (2001 год) и ВНИТИП (2001 год). С помощью высокотехнологичных методик сканирования генома было изучено 186 кур, и результаты генотипирования впоследствии подвергались различным типам анализа. Процесс сканирования, или генотипирования, был произведен с использованием чипа Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip. Несмотря на высокую компьютеризацию процесса, финальное качество расшифровки генотипов животных было различно, однако в пределах допустимой нормы. Качество определения генотипов образцов превышало 90 %, учитывая важность подготовки генотипических данных как необходимого технического этапа для последующего биоинформационного анализа. Ввиду различного полового состава животных выборки были удалены половые хромосомы с целью предотвращения искажения анализа. Анализ различия популяций русских белых кур производился с использованием метода многомерного шкалирования (MDS), отражающего пространственное распределение животных в зависимости от генетического сходства. Иными словами, чем дальше в пространстве располагались животные на графике, тем менее похожими они являлись. Все исследования проводились на группах кур современной и исторической популяции (2001 года). Историческая популяция была представлена 10 головами из популяциилинии ВНИТИП и 6 головами из популяциилинии ВНИИГРЖ. Современная популяция ВНИИГРЖ насчитывала 170 голов. Практическое значение анализа на уровне различных популяций заключалось в использовании его результатов для оценки и контроля изменчивости в породе. В ходе исследований было обнаружено, что наибольшее различие наблюдается между историческими группами птиц ВНИТИП и ВНИИГРЖ, а современная популяция показывает высокую изменчивость по сравнению с предковой. Полученные данные свидетельствуют об интенсивном развитии современной популяции и успешном селекционном процессе. Изменчивость, являясь источником селекционного прогресса, была более глубоко изучена в современной популяции. В ходе анализа выявлено четкое распределение животных на четыре подгруппы, и информация о принадлежности особей к подгруппам будет использована в будущей селекционной работе. В частности, было установлено, что ключевым фактором наблюдаемого распределения стало использование четырех основных петухов при выведении животных выборки. Более точная геномная характеристика выявленных групп была проведена с помощью изучения особенности групп по наличию и длине районов, где наблюдалось неравновесное сцепление SNP-маркеров (LD). Было выявлено, что группа максимального неравновесного сцепления – историческая популяция (2001 года). Несмотря на общее положение третьей группы современной популяции и предковой популяции 2001 года в пространстве, они отличались количеством мономорфных SNPs. С помощью линейной модели была оценена достоверность влияния группы, хромосомы, взаимодействия и SNP-интервала на LD. SNP-сканирование позволило оценить генетическое сходство особей и популяционную структуру русской белой породы кур. Понимание генетической структуры важно при панмиктическом разведении и отслеживании исторических изменений в молекулярной организации генома генофондной популяции с ограниченным поголовьем. В результате исследования выяснено, что одним из важных биоинформационных популяционных критериев для планирования селекционного процесса в популяциях является встречаемость и длина LD-районов. Для планирования селекционного процесса, а также для сохранения особо редких и малочисленных пород рекомендуется использовать SNP-сканирование и MDS-анализ на основе сравнения с референтной группой животных. Сегодня существует высокий спрос на селекционные решения, которые помогают увеличить выход экстраэмбриональной жидкости (ВЭЭЖ). Знание генетических механизмов, которые участвуют в формировании объема экстраэмбриональной жидкости, а также других признаков, характеризующих продуктивность и особенности популяции, составляет основную экономическую значимость в программах отбора. Один из подходов к получению таких знаний – это выявление ассоциаций между однонуклеотидными полиморфизмами, покрывающими весь геном с высокой плотностью, и изучаемыми признаками. В работе были использованы материал зоотехнического учета продуктивности, собранный на популяции ВНИИГРЖ, данные о происхождении и база генотипов, включающая 57000 SNP-маркеров по каждой особи. Изученные признаки: цвет пуха, масса птицы в 330 дней, возраст снесения первого яйца, яйценоскость, масса яйца, объем амниотической жидкости, соотношение объема эсктраэмбриональной жидкости к массе яйца. Были обнаружены достоверные связи некоторых SNPs с исследуемыми фенотипическими признаками. Подтверждением возможности наличия ассоциации являлась локализация их вблизи генов-кандидатов на хромосоме курицы, а также онтология с генами других животных и человека. Например, гены, играющие роль в развитии пола, были связаны с возрастом снесения первого яйца, а гены, регулирующие обмен кальция с массой яйца. Обнаружены достоверные ассоциации с цветом пуха и объемом амниотической жидкости. Возможные гены-кандидаты по признаку ВЭЭЖ находились на 2-й и 12-й хромосомах, по признаку белый пух – на 2-й и 4-й хромосомах. Выявленные ассоциации представляют собой высокоценную фундаментальную информацию для дальнейшего поиска генов, влияющих на продуктивность и фенотипические особенности сельскохозяйственной птицы. Вторым направлением исследования, разрабатываемым в ходе реализации проекта, стали межпородные гибридные формы генофондных и промышленных пород кур. Генофондная птица является носителем фенотипических особенностей, таких как приспособленность к местным условиям, устойчивость к заболеваниям, уникальные продуктивные и декоративные признаки. Задача популяционного анализа заключается в правильном подборе схемы селекции для достижения максимального эффекта, что подразумевает получение материальной или эстетической продукции от объекта селекции. На этапе работы, который связан с созданием кроссов на основе генофондных пород, получены двухпородные и трехпородные гибриды. Оценка их мясной продуктивности проведена прижизненно с помощью переносного ультразвукового сканера. Было установлено, что метод УЗИ позволяет не только прижизненно оценивать степень развития грудной мускулатуры, но и оценивать форму груди, равномерность развития мышц, что очень важно для перерабатывающей промышленности. Несмотря на очевидные превосходство отдельных гибридов по мясной продуктивности, генотипирование выведенных животных позволило рассчитать уровень инбридинга, неравновесия по сцеплению, количества и длины гомозиготных районов (ROH – Runs of Homozygosity), что необходимо для анализа генетического разнообразия внутри пород. Полученные внутри- и межпородные данные охарактеризовали генетическое разнообразие в комплексе с объективной оценкой состояния малочисленных популяций. Было обнаружено, что изменчивость гибридной птицы зависела от исходных пород. Результаты расчетов доказали преимущество трехпородного сочетания, с максимальным генетическим расстоянием, – корниш × (брама светлая × суссекс). Мясная продуктивность гибридов при анатомической разделке тушек показала превосходство этого же сочетания. Проведенная в этом году работа определила стратегию исследования, что будет использовано для дальнейшей разработки методологии полногеномной оценки малочисленных популяций кур. Изучено 12 пород и популяций комбинированного типа продуктивности. Предложены возможные варианты практического использования лучших свойств генофондных пород для расширения потребительского рынка и создания альтернативных отечественных кроссов. Публикации в СМИ: https://spbvedomosti.ru/news/obshchestvo/chuzhoe_plemya_na_nbsp_rossiyskom_naseste/ http://www.1tvspb.ru/event/Kurinij_kollekcionarium_Peterburgskie_uchenie_sohranyayut_genofond_otechestvennih_sel_skohozyajstvennih_ptic/ http://47channel.ru/event/U_oblastnih_fermerov_v_blizhajshem_buduschem_poyavyatsya_otechestvennie_visokoproduktivnie_kuri/

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основной целью проекта в 2018 отчетном году было продолжение изучения популяционной структуры и анализ геномной архитектуры некоторых пород, а также продолжение изучения геномных изменений у гибридной птицы. Генофондная птица является носителем фенотипических особенностей, таких как приспособленность к местным условиям, устойчивость к заболеваниям, уникальные продуктивные и декоративные признаки. Задача популяционного анализа заключается в правильном подборе схемы селекции для достижения максимального эффекта, что подразумевает получение материальной или эстетической продукции от объекта селекции. На этапе работы, который связан с созданием кроссов на основе генофондных пород, были получены двухпородные и трехпородные гибриды. В ходе работы в 2018 году была проведена оценка скорости роста гибридов путем взвешивания их каждую неделю до возраста 63 дня, а также осуществлен поиск геномных ассоциаций у породных гибридов (4 группы двухпородных гибридов) с помощью программы EMMAX, а полученные данные сопоставлены с локализацией известных QTL. GWAS анализ не выявил однонуклеотидных замен с высоким уровнем достоверности ассоциированных с живой массой гибридов в разные периоды жизни. Как потенциально значимые определены замены rs16254739, rs16249817, расположенные на хромосоме 3, а также rs14267733 на 20 хромосоме. Эти замены не затронули гены, но рядом оказались расположены ген CHRM3, который кодирует мускариновый холинергический рецептор 3, ген CRIM1 (кодирует трансмембранный BMP-регулятор, богатый цистеином 1), а также ген TP53INP2, который кодирует белок, активирующий транскирцию в некоторых генах. Описанные гены не оказывают непосредственного влияния на живую массу, но задействуют процессы формирования нервной системы, а также участвуют в клеточном делении. Замены, с потенциальным влиянием на живую массу, были обнаружены у цыплят в возрасте до 42 дней. Были продолжены работы по изучению популяционного разнообразия генофондных пород. Важным показателем, описывающим историю создания той или иной популяции, служит ее эффективная численность. Благодаря этому показателю можно предположить, какое число особей действительно оказало влияние на формирование породы. Наибольшую эффективную численность по данным полногеномного анализа, имели популяции, которые были сходными по фенотипу и при групповом содержании могли частично перемешиваться. Породы с невысокой эффективной численностью популяции как 25, так и 3200 поколений назад, вероятно, происходили от ограниченного числа предков, или же подвергались сильному селекционному давлению в ряде поколений. Породы, полученные недавно, путем гибридизации нескольких пород, а также при «освежении крови» породы из другой чистопородной популяции имели высокую эффективную численность 25 поколений назад. Продолжена работа по оценке генетической гетерогенности пород и популяций на основании расчетов уровней инбридинга (F), гетерозиготности (Н), неравновесия по сцеплению (LD), и уровня ROH (Runs of Homozygosity). Изученные в этом году породы показали незначительный разброс в уровне инбридинга. Отмечен высокий инбридинг и низкая гетерозиготность в породах с малой численностью. Выявлены высокие значения генетического сходства в популяции чешских золотистых кур, которая обладает значительной численностью в генофондном хозяйстве. Вероятно, в этой группе произошло снижение числа производителей, которые оказали вляние на формирование популяции. Показатель LD (неравновесия по сцеплению) оказался высоким в гамбургской породе и у бентамки. Небольшая численность групп птицы этих пород, а также сниженные показатели воспроизводства говорят о возможном нарастании инбридинга в следующих поколениях. Показатель ROH значительно колебался у изученных пород и популяций. Неравномерность количества гомозиготных районов у особей в популяции говорит о возможном появлении в ней спонтанных гибридов или «следов» «прилития крови» из неродственных групп той же породы. Проведены обобщающие результаты сравнения пород, популяций и субпопуляций. С помощью программы ADMIXTURE расчитаны данные об изменчивости SNP-маркеров в популяциях генофондной коллекции ВНИИГРЖ. При разбивке общего массива на 17 предковых групп (K=17), была обнаружена их оптимальная градация в изучаемых породах. В отдельные кластеры выделились породы: русская белая 2001, кохинхин голубой, фавероль, гамбургская серебристо-пятнистая карликовая, карликовый кохинхин, юрловская голосистая, пушкинская, загорская лососевая, плимутрок, павловская, китайская шелковая, брама светлая, брама палевая, итальянская куропатчатая, первомайская. Родственные следы общего происхождения популяций можно разделить на несколько групп. Группа черно-пестрого австралорпа включает родственные породы: черно-пестрый австралорп, пушкинская, аврора, ленинградская золотисто-серая, ленинградская ситцевая. Группа итальянской куропатчатой породы включает: итальянскую куропатчатую, чешскую золотистую (сходную с ней по окраске и, возможно, по происхождению), ленинградскую золотисто-серую, для которой итальянская куропатчатая одна из исходных пород. Группа плимутрока включает почти идентичные группы полосатого плимутрока и амрокса.Группа павловской включает идентичные породы павловская и султанка. Группа суссекса идентична группе первомайской породы. Можно отметить высокую изменчивость и наличие примесей различных пород в популяциях курчавой птицы, голошеей, полтавской глинистой. Проведенное полногеномное исследование носит как фундаментальный, так и практический характер. Оно представляет полную ревизию пород биоресурсной коллекции ВНИИРГЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (Пушкин, Санкт-Петербург). Некоторые популяции, представленные в этой коллекции являются уникальными, что подтверждает полногеномный анализ.