Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В рамках проекта в 2016 году из ризосферы, листьев и стеблей картофеля нами выделены 35 бактериальных изолятов. Изоляты идентифицировали как представителей родов Bacillus, Lysinibacillus, Serratia, Pseudomonas, Enterobacter, Alcaligenes, Acinetobacter и Micrococcus. Нами проведен первичный скрининг изолятов по антагонистической активности в отношении разных микромицетов и бактерий из коллекции кафедры микробиологии КФУ: Alternaria alternate, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Escherichia coli, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae. Установлено, что изоляты MG8 и MG17 проявляли высокую антибактериальную и фунгицидную активность в отношении использованных тест-культур. При идентификации с помощью системы microflex MALDI BioTyper штаммы MG 8 и MG 17 отнесены к роду Bacillus. Генетический анализ по гомологии генов 16S рРНК позволил сделать следующие заключения: последовательность гена 16S рРНК штамма MG 8 на 99% гомологична соответствующим последовательностям генов Bacillus subtilis MML2411 и Bacillus subtilis GX S-21, последовательность гена 16S рРНК штамма MG17 на 98% гомологична соответствующей последовательности штамма Bacillus subtilis OTPB28. Таким образом, нами выделены 2 изолята, которые идентифицированы как штаммы B. subtilis MG 8 и B. subtilis MG 17. Оба изолята проявляли антагонистическую активность в отношении микромицетов: зона ингибирования роста грибов Doratomyces sр. составила для штаммов B. subtilis MG8 и MG17 19.4 мм и 20.8 мм, в случае Fusarium sp. для штаммов B. subtilis MG8 и MG17 – 17.3 мм и 16.8 мм, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной фунгицидной активности выделенных изолятов. Оба штамма проявляли антибактериальную активность в отношении бактерий Salmonella sp. Поскольку сальмонеллы являются возбудителями заболеваний птиц, полученные данные свидетельствуют о том, что выделенные изоляты могут рассматриваться как потенциальные пробиотики для использования в птицеводстве. Мы установили, что штаммы B. subtilis MG8 и MG17 способны к росту на селективной питательной среде PSM (phytase screening medium), содержащей нерастворимый фитат кальция в качестве единственного источника фосфора, что свидетельствует о фитатгидролизующей активности. Исследовали вирулентность, токсичность и токсигенность B. subtilis MG 8 и B. subtilis MG 17 с использованием белых мышей. Введение мышам культур живых бактерий, суспензии убитых бактерий и бесклеточной культуральной жидкости 3-х и 7-ми суточных культур показало отсутствие у исследуемых штаммов вирулентности, токсичности и токсигенности. Обследование внутренних органов и микробиологический анализ крови из сердца и селезенки через 30 суток после инфицирования не выявило патологий. Установили способность изолятов B. subtilis MG 8 и B. subtilis MG 17 расти на питательных средах, содержащих сою и кукурузную муку, которые являются компонентами кормов птицы. Максимальное накопление биомассы наблюдали на среде с содержанием сои: оптическая плотность культуры на 24 ч роста достигала 3.52+0.51 для изолята MG 8 и 3.64+0.40 для изолята MG 17, что сопоставимо с ростом бактерий на среде LB. На среде с кукурузной мукой рост бактерий был значительно ниже и составлял 0.73+0.05 и 0.72+0.25 опт.ед, соответственно. Оба штамма росли на средах с широким диапазоном рН. Оптимальными для штамма MG8 являлись рН 8-9, а для штамма MG17 – рН 7-8. Рост обоих штаммов не ингибировался при значениях рН 3-4 и рН 10-12, что свидетельствовало о способности этих штаммов адаптироваться к широкому диапазону рН среды. Мы установили, что инкубация спор выделенных бацилл в 50%-ной желчи не приводила к гибели бактерий. КОЕ/мл в опытных вариантах и контроле в случае MG8 составило 2.26х109 и 2.47х109, а в случае MG17 –1.95х109 и 2.18х109 , соответственно. Таким образом, из ризосферы картофеля нами выделены два новых штамма B. subtilis с высокой фунгицидной и антибактериальной активностью. Штаммы не обладали вирулентностью, токсичностью и токсигенностью, проявляли фитатгидролизующую активность, способность расти в широком диапазоне рН среды, а также на средах, содержащих соевый и кукурузный экстракты, устойчивы к 50% желчи. Проводили получение рекомбинантных штаммов Pichia pastoris, в геном которых интегрированы гены фитаз (Pantoea sp. 3.5.1 и B. ginsengihumi M2.11) и бациллярных протеиназ B.pumilus 3-19 для стабильной и эффективной экспрессии бактериальных ферментов, выделения и очистки бактериальных белков с целью применения их в качестве кормовой добавки для кур. Для этого использовали последовательности генов гистидиновой кислой фитазы Pantoea sp. 3.5.1 – agpP (AN KJ783401.1), бета-пропеллерной фитазы B. ginsengihumi M2.11 – phyC и субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus 3-19 (AN AY754946.2). Последовательности бактериальных генов были оптимизированы - исключали последовательности собственных сигнальных пептидов, к структурной области генов добавляли С-терминальный His-таг, позволяющий проводить очистку бактериальных ферментов непосредственно из культуральной жидкости дрожжей с помощью аффинной хроматографии. Для корректной экспрессии целевых белков в дрожжах проводили оптимизацию кодонов нуклеотидных последовательностей генов. Кодон-оптимизированные гены были синтезированы и клонированы в вектор pUC57 компанией Genscript (США). Получены плазмиды, несущие соответствующие гены бактериальных ферментов: pUC57-phyC (с геном фитазы B. ginsengihumi M2.11, pUC57-agpP (с геном фитазы Pantoea sp. 3.5.1) и pUC57-gseBp (с геном субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus 3-19). Проводили клонирование оптимизированных бактериальных генов в интегративные дрожжевые вектора pPINK-HC (высококопийный вектор) и pPINK-LC (низкокопийный вектор). Для секреции рекомбинантных белков в культуральную жидкость дрожжей при клонировании использовали нуклеотидную последовательность высокоэффективного сигнального пептида гена альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae. Таким образом, проводили трехступечатое лигирование вектора (pPINK-HC или pPINK-LC), последовательности сигнального пептида гена альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae (68 п.о.) и бактериального гена ( phyC/gseBp/agpP) и трансформировали полученными конструкциями E.coli DH5alpha. Для дальнейшей работы отобрали по 2 трансформанта каждого варианта. Корректность встраивания сигнального пептида и целевого гена подтвердили секвенированием. На следующем этапе мы проводили подготовку трансформирующей ДНК для интеграции в геном P. pastoris. Для этого выделяли полученные вектора из трансформантов в количестве 10 мкг и проводили рестрикцию плазмид по сайту SpeI, находящемуся в области гена TRP2, для получения интегрирующей конструкции. Проводили оптимизацию параметров электропорации P. pastoris. Показано, что эффективность электропорации повышалась в два раза, если при подготовке электрокомпетентных клеток дрожжей 1М сорбитолом первичный инокулят растили до оптической плотности ОД600 = 1, а вторичный до ОД600 = 1.5 (поздняя лог-фаза), а после проведения электропорации к клеткам добавляли 1 мл среды YPDS (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) и инкубировали 4 ч при 37°С. Трансформацию беспротеазного штамма P. pastoris PichiaPink4 проводили всеми отобранными конструкциями. После бело-розового скриннинга трансформантов, из отобранных белых колонии выделяли геномную ДНК и проводили ПЦР-анализ, который подтвердил эффективность интеграции. Таким образом, на данном этапе реализации проекта нами получено шесть рекомбинантных штаммов P. pastoris (agpP-HC4 и agpP-LC5, phyC-HC5 и phyC-LC2, gseBp-HC4 и gseBp-LC4), в геном которых интегрировали гены гистидиновой кислой фитазы agpP, бета-пропеллерной фитазы phyC и субтилизиноподобной протеиназы gseBp под контролем индуцибельного промотора AOX1 и сигнального пептида альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017 году исследования были направлены на получение бактериальных белков, фитазы и протеиназы, для тестирования с целью повышения усвояемости корма сельскохозяйственной птицы. Для высокой продукции бактериальной фитазы нами получены рекомбинантные штаммы дрожжей, эффективно секретирующие гетерологичный белок в культуральную жидкость и использованы бациллярные штаммы с высокой продукцией гетерологичной бактериальной протеиназы. Мы оптимизировали условия выращивания рекомбинантных дрожжей P. pastoris и установили, что максимальный уровень накопления фитазной активности в КЖ наблюдался на 36 ч индукции, оптимальная концентрация индуктора (метанола) составила 0.5%. Для масштабирования процессов получения ферментов из рекомбинантных дрожжей и бактерий использовали биореактор. Разработаны условия культивирования штамма P.pastoris pPINK-HC-inul-agpP2 в биореакторе Biotron LiFlus SP30L. Ферментация была проведена в течение 72 ч при постоянной аэрации со скоростью 750 об/мин, температуре 30°C, скорости потока воздуха 10 л/мин, pH 6.0. и состояла из трех фаз. После прекращения ферментации OD культуры составила 126 единиц, активность фитазы – 199 Ед/мл. Таким образом, процесс масштабирования позволил получить 2х106 ед. фитазы. Для получения протеиназы проводили культивирование в биореакторе штамма-продуцента B. subtilis pCS9 с геном субтилизиноподобной протеиназы B.pumilus. Культивирование проводили в течении 24 ч при 37°С при постоянной аэрации со скоростью потока 10 л/мин при постоянном перемешивании 700 об/мин. К 24-му ч роста культуры активность фермента достигала максимума в 4.4 ед/мл, OD составляла 6 опт.ед. Ферментацию останавливали на 24 ч роста культуры. Клетки удаляли центрифугированием, уровень активности протеиназы в супернатанте составил 4.4 ед/мл. Очистку рекомбинантной фитазы проводили аффинной хроматографией на колонке с Ni-NTA сефарозой. Получили гомогенный препарат фитазы с выходом по активности 59.3% и степенью очистки 13.3. Молекулярная масса фитазы 90 кДа, молекулярная масса нативной фитазы 57 кДа. Мы обработали рекомбинантную фитазу эндогликозидазой EndoH (NewEnglandBiolabs), которая расщепляет гибридные цепи олигосахаридов. После обработки фермента на электрофорезе в 12.5% ПААГ наблюдали уменьшение молекулярной массы до 80 кДа, что указывало на гликозилирование фитазы. С помощью сервера NetNGlyC 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) в последовательности фитазы идентифицировали 6 потенциальных сайтов для N-гликозилирования: N55, N92, N106, N120, N234, N570. Итак, фитаза эффективно секретируется дрожжами в среду и претерпевает модификацию гликозилированием. Очистку субтилизиноподобной протеиназы проводили на колонке с карбоксиметил-целлюлозой и получили 15886 ед. активности фермента для использования в качестве кормовой добавки при кормлении птиц. Определяли свойства рекомбинантных гидролаз после культивирования в биореакторе и очистки. Гетерологичная фитаза проявляла максимальную активность при рН 3.0, нативный белок при рН 4.5. Фермент сохранял стабильность от рН 2.0 до рН 5.0, при инкубации фермента при рН выше рН 5.0 активность снижалась, наблюдали смещение рН-стабильности фермента в кислую сторону. У рекомбинантных дрожжей наблюдали увеличение температурного оптимума фитазы с 37°С до до 50°С. Установлено повышение термостабильности рекомбинантной фитазы по сравнению с нативной: при 70°С фермент сохранял более 95% активности, нативный фермент терял более 50% активности при 50°С. Увеличение термостабильности связано с гликозилированием белка и является важным фактором в производстве пищевых добавок. Исследовали способность рекомбинантной фитазы к гидролизу фитата в составе природных субстратов (кукурузная, соевая мука), которые являются компонентами кормовых диет. Фитаза эффективно гидролизовала кукурузную муку, высвобождая 80 мкМ/мл свободных фосфатов. Гидролиз соевой муки осуществлялся на более низком уровне: при рН 5.0 фитаза высвобождала 10 мкМ/мл фосфатов, при рН 7.0 – 30 мкМ/мл. Изучали основные свойства протеиназы: температурный оптимум фермента составил 37°С, для практического использования важно, что ионы кальция в конечной концентрации 5 мМ увеличивали температурный оптимум фермента до 50°С. Протеиназа термостабильна в интервале от 0–50°С, рН-оптимум протеиназы составил рН 9.5, протеиназа сохраняла стабильность в интервале рН 7–10. Изучали влияние секретов желудочного-кишечного тракта на активность гидролаз. Более 90% фитазной активности сохранялось в присутствии желудочного сока кур (рН 3.0), тогда как в среде с поджелудочным и кишечным соком активность ингибировалась (10% от исходной). Бациллярная протеиназа в присутствии желудочного сока кур (рН 3) сохраняла до 60% активности. В присутствии поджелудочного и кишечного сока активность протеиназы сохранялась полностью. Активность протеиназы не подавлялась природными ингибиторами, такими как ингибитор трипсина, что позволит ей функционировать в ЖКТ кур. Исследовали токсичность гидролаз на 1-суточных цыплятах-бройлерах кросса КОББ 500. В 1-й группе (контрольной) цыплята получали только комбикорм. Цыплята 2-й группы получали комбикорм с добавлением протеазы в концентрации 100 ед/кг корма, 3-й группы – фитазу 1000 ед/кг корма. Наблюдения проводили на протяжении 10 суток, все цыплята оставались здоровыми, активными, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Вес цыплят в опытных группах сохранялся в норме. По истечению 10 суток для исследования влияния ферментов на внутренние органы, из каждой опытной группы отбирали по 3 цыпленка. .Во внутренних органах цыплят повреждений и патологических изменений не выявлено. Препараты бактериальных протеинзы и фитазы в заданных концентрациях являются безопасными и не обладают токсичностью по отношению. На основании полученных данных, можно сделать заключение о высоком биотехнологическом потенциале гетерологичных гидролаз в качестве кормовых добавок для птиц.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году исследования направлены на тестирование полученных пробиотиков и ферментных препаратов на курах. Научно-хозяйственный опыт с добавлением пробиотиков проводили в условиях фермерского хозяйства “Лачын” на цыплятах кросса Кобб-500 суточного возраста (90 голов). Контрольная группа (30 цыплят) получала полнорационный комбикорм и опытные группы 1 и 2 (по 30 голов) получали комбикорм с добавлением суспензии спор бактерий B. subtilis GM2 и B. subtilis GM5 в концентрации 1х107 КОЕ/г корма. Исследовали динамику роста цыплят. Первые 10 сут при кормлении цыплят комбикормом Стартер у группы 1 прирост живой массы выше относительно контрольной на 10.53%, у 2-й – на 5.84%. С 11 по 20 сут цыплята получали комбикорм Гроуэр, прирост живой массы цыплят 1 и 2 групп превышал значение контрольной в среднем на 11.22 и 22.93%. С 21 по 42 сут цыплята получали корбикорм Финишер. Прирост живой массы цыплят выше у опытных групп и превышал контроль на 3.16% и 12.05% соответственно. Во второй группе наблюдали снижение коэффициента конверсии корма на 4.85% относительно контроля. Сохранность поголовья птиц всех групп составляла 100%, заболеваний при осмотре ветеринара не обнаружено. Среднесуточный привес у цыплят 1 и 2 опытных групп составлял 52.30 и 56.31 г и был выше контроля (49.69 г) на 5.25% и 13.32% соответственно. Добавление спор бактерий B. subtilis GM2 и GM5 в комбикорм бройлеров приводило к улучшению потребления и усвояемости корма, что ведет к снижению себестоимости конечного продукта. Эффект обусловлен пробиотическими свойствами бактерий, включая поддержание полезной микрофлоры, улучшение пищеварения и повышение активности синтеза кишечных ферментов. Ветеринарно-санитарная экспертиза и микроскопирование тушек и внутренних органов цыплят не выявили патологоанатомических изменений. Мясо цыплят-бройлеров, получавших пробиотик, по органолептическим, физико-химическим и бактериоскопическим характеристикам соответствовало ГОСТу для свежего доброкачественного мяса. Микробиологический анализ кишечника цыплят-бройлеров контрольной и опытных групп показал, что применение пробиотиков приводило к увеличению количества молочнокислых бактерий в 48-66 раз. При этом общее микробное число бактерий было на относительно одинаковом уровне. Из содержимого тонкого кишечника и слепой кишки цыплят идентифицированы бактерии, относящиеся к семействам Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae и Clostridiaceae. Изоляты из тонкого кишечника представлены родами Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas и Enterococcus, из слепой кишки - родами Enterococcus, Filifactor, Clostridium и Bacillus. Микробиологический анализ не выявил негативных изменений в микрофлоре ЖКТ, установлен позитивный эффект в виде повышения общего содержания молочнокислых бактерий на фоне пробиотиков. Для анализа структуры микробиоты кишечника цыплят провели секвенирование генов 16S рРНК. Анализ микробиома выявил представителей 15 филумов, среди них доминировали представители 4 фил: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes и Actinobacteria. Метагеномный анализ выявил изменения в структуре микробиоты слепой кишки в процессе роста и развития птиц. На 10 сут в слепой кишке возрастала доля бактерий филы Firmicutes на 15% в контрольной группе и – на 11% в опытной группе по сравнению с образцами 1-сут цыплят. Доля представителей филы Proteobacteria снижалась: в 20 и 28 раз в контрольной и опытной группе. Возрастает доля филы Bacteroidetes. На 42 сут в микробиоте слепой кишки цыплят представлены филумы, среди которых в обоих группах доминировали филы: Firmicutes – 59.3 и 71.0%, Bacteroidetes 24.7 и 18.2% и Proteobacteria 3.8 и 3.5%. Кроме основных филумов в слепой кишке идентифицированы представители фил Actinobacteria, Cyanobacteria, Deferribacteres, Synergistetes, Tenericutes и Verrucomicrobia. В процессе роста цыплят состав микробиоты слепой кишки претерпевает изменения в отношении качественного состава бактерий. В филе Firmicutes доминировали представители Lactobaccilaceae и Clostridiales, соотношение которых изменялось с возрастом цыплят: доля Lactobaccilaceae снижалась, а доля Clostridiales возрастала. Порядок Clostridiales представлен семействами Lachnospiraceae, Ruminococcaceae и Veillonellaceae. На 1 сут в кишечнике цыплят количество представителей этих семейств было на незначительном уровне. На 10 сут доминировали бактерии семейства Lachnospiraceae и Ruminococcaceae. В контроле основным семейством филума Firmicutes на 10 и 42 сут являлось сем. Ruminococcaceae: доля этой группы в слепой кишке контрольной группы цыплят достигала 30.9% и 42.2%, соответственно. Добавление пробиотика приводило к увеличению доли этой важной и полезной группы бактерий: в опытной группе цыплят представленность этих бактерий достигала 33.52% (10 сут) и 54.7% (42 сут) соответственно, что выше контроля на 8.5% и 29% соответственно. Фила Proteobacteria представлена в микробиоте цыплят 5 классами: Alphaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Deltaproteobacteria и Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria. На первые сутки в контрольной и в опытной группе доминировал класс Gammaproteobacteria (43.7 и 45.5% соответственно). На 10 сут доля этого класса снижалась в обеих группах до 1.4 и 0.6%. На 42 сут доля представителей этого класса составляла 0.1% и 2.4% в контрольной и опытной группах, соответственно. Доля семейства Enterobacteriaceae в кишечнике 1-сут цыплят была на одинаковом уровне (43.8 и 45.8% в контроле и опыте). В кишечнике 10-сут и 42-сут цыплят доля энтеробактерий значительно снижалась и составляла 1.4% и 0.6% (на 10сутки), 0.1 и 2.4% (на 42 сутки). Применение пробиотиков в составе кормов приводило к снижению в слепой кишке содержания условно-патогенных протеобактерий класса Epsilonproteobacteria. В класс Epsilonproteobacteria входят бактерии семейств Campylobacteriaceae и Helicobacteriaceae, к которым относятся некоторые патогены птиц и человека. В опытной группе снижалась доля Campylobacteriaceae (с 0.5% до 0.002%) и доля Helicobacteriaceae (с 1.8% до 0.2%). Также применение пробиотика приводило к снижению доли бактерий семейств Staphylococcaceae и Pasteurellaceae. Доля актинобактерий сем. Bifidobacteriaceae в слепой кишке изменялась в процессе роста: у суточных цыплят их доля составляла 0.002% и 0.01% в контроле и опыте. К 10 сут доля бифидобактерий возрастала до 5.6% и 6.9% соответственно, а затем к 42 сут снова снижалась до 0.9% и 0.05%. По-видимому, колонизация кишечника молодых цыплят бифидобактериями важна для формирования оптимальной микробиоты и иммунитета. Применение пробиотиков приводило к эффективной колонизации кишечника цыплят бактериями этой важной группы. Таким образом, применение пробиотика на основе штамма B.subtilis GM5 приводило к увеличению живой массы птицы, снижению коэффициента конверсии корма и позитивно влияло на формирование кишечной микробиоты цыплят-бройлеров. Изучали влияние кормовой добавки на основе бактериальных гидролаз на продуктивность, переваримость и усвояемость питательных веществ и ветеринарно-санитарную оценку мяса и продуктов убоя цыплят-бройлеров породы Хабборд до 36-дневного возраста. Сформировали контрольные и опытные группы цыплят по 30 голов в каждой. 1 группа – контрольная, 2 дополнительно к рациону получала протеазу (10 ед/кг корма), 3 группа – фитазу (1000 ед/кг корма). Условия содержания птицы соответствовали принятым зоогигиеническим параметрам. Гематологические и биохимические исследования крови из подкрыльцовой вены проводили в 5-, 20- и 35-сут возрасте цыплят. Использовали гепаринизированную, стабилизированную Трилоном Б и цельную кровь. По результатам гематологического (содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и гематокрит) и биохимического (общий белок, мочевина, креатинин, общий кальций, неорганический фосфор, АсТ и АлТ) анализа крови цыплят показатели варьировали, свидетельствуя о положительном влиянии кормовых добавок (фитаза 1000ед/кг и протеиназа 10 ед/кг корма) на обменные процессы птиц и оставались в пределах физиологической нормы. Для изучения влияния добавления в корма протеазы и фитазы на переваримость и использование питательных веществ кормосмеси проводили балансовый опыт. Использование ферментных препаратов способствовало увеличению утилизации азота и фосфора в организме цыплят-бройлеров, а также увеличению интенсивности роста птицы. Применение бактериальной фитазы в концентрации 1000 ед/кг и бактериальной протеиназы в концентрации 10 ед/кг корма повышали переваримость протеина, жира, клетчатки и сухого вещества, добавление фитазы в концентрации 1000ед/кг корма приводило к увеличению коэффициента переваримости фосфора (40.5% против 29.3% в контроле), добавление бактериальной протеиназы в концентрации 10 ед/кг корма приводило к увеличению усвояемости азота в составе кормов (56.4% против 53.3% в контроле). После убоя проводили отбор проб селезенки, печени, сердца и скелетной мускулатуры и их гистологическое исследование. Гистологическая оценка проб показала, что фитаза и протеиназа в заданной концентрации не вызывают патологических изменений в паренхиматозных органах цыплят-бройлеров. Мясо цыплят-бройлеров, получавших с кормом бактериальные фитазу и протеиназу по органолептическим, физико-химическим и бактериоскопическим характеристикам соответствовало ГОСТу для свежего доброкачественного мяса. По аналогичной схеме проводили исследования по влиянию кормовых добавок на основе бактериальных ферментов для молодняка кур-несушек породы «Хайсекс Браун» до 18-недельного возраста. Гематологические и биохимические исследования крови в 30-, 60- и 90-сут возрасте молодняка кур-несушек по всем показателям не выходили за рамки физиологической нормы, кальций-фосфорное соотношение выше 1 и повышается на 90-сут к периоду яйцекладки до 2.7. В балансовом опыте применение в качестве добавки бактериальной фитазы в концентрации 1000 ед/кг корма приводило к увеличению коэффициента переваримости фосфора для молодняка кур-несушек: 64% против 36% в контроле, применение бактериальной протеиназы в концентрации 10 ед/кг корма приводило к увеличению усвояемости азота в составе кормов для молодняка кур-несушек: 74.5% против 69% в контроле. Применение ферментов в первую неделю для молодняка кур-несушек привело к увеличению коэффициента переваримости кальция, необходимого для формирования костей молодняка: 50% против 40% в контроле, по-видимому, вследствие активности фитазы и протеиназы, поскольку соединения фитиновой кислоты способны адсорбировать и переводить в трудно растворимое состояние ионы Са и другие соединения, включая белки, аминокислоты, пептиды и др. В целом, переваримость протеина, клетчатки и жира растет в присутствии добавок. При проведении гистологических исследований печени, селезенки, миокарда патологических изменений не обнаружили, фитаза и протеаза не вызывали патологических изменений во внутренних органах молодняка кур-несушек до 18-недельного возраста. Оценивали влияние кормовых добавок на основе бактериальных гидролаз на продуктивность, переваримость, усвояемость питательных веществ и яичную продуктивность кур-несушек породы «Хайсекс Браун» в возрасте 21 неделя. Все исследования проводили на 10, 20 и 30 сут эксперимента. Анализ гематологических и биохимических показателей крови кур-несушек, динамика их роста, ветеринарно-санитарный контроль, сохранность стада, результаты балансового опыта, а также гистологические исследования показали, что препараты не вызывают патологических изменений. Введение в состав комбикормов бактериальной фитазы оказало положительное влияние на яйценоскость кур-несушек и толщину скорлупы яиц в пределе 5%. Изучали влияние кормовых добавок в рационе кур-несушек на физиологию развития эмбриона. Морфометрические исследования проводили ежедневно с 8 по 19 сут инкубации и показали, что ферментные препараты не оказывали отрицательного влияния на развитие эмбрионов. На основании полученных экспериментальных данных и их апробации мы можем рекомендовать для повышения продуктивности птицы вводить в рацион бактериальную фитазу в концентрации 1000 ед/кг и бактериальную протеиназу в концентрации 10 ед/кг корма, пробиотики на основе спор Bacillus subtilis GM5 - 1х107 КОЕ/г корма.