Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 г. были проведены исследования, направленные на оптимизацию и отработку отдельных этапов технологической цепочки создания криобанков зародышевых клеток разных видов сельскохозяйственной птицы. Были получены следующие научные результаты. 1. Оптимизированы и отработаны методических подходы по получению примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) разных видов сельскохозяйственной птицы. Изучена эффективность получения культуры ПЗК разных видов сельскохозяйственной птицы – кур, перепелов, гусей, уток, цесарок. Отработаны и оптимизированы методические подходы по дезагрегации эмбрионов птицы и очистке ПЗК от других типов клеток. Определен возраст эмбрионов, оптимальный для получения культуры ПЗК, в зависимости от вида птицы. Установлено, что эффективным методом дезагрегации эмбрионов кур с целью выделения эмбриональных клеток, в том числе ПЗК, является их ферментативная обработка с использованием 0,05% трипсина. Оптимальным возрастным периодом для получения культуры эмбриональных клеток, максимально обогащенной ПЗК, является возраст эмбрионов от 5 до 6 дней для кур, до 5 дней - для перепелов, от 6 до 7 дней - для цесарок, гусей и уток. Разделение клеток разных типов с учетом их различной способности к адгезии позволяет получать культуру ПЗК, максимально очищенную от других типов клеток. При этом, единичные эмбриональные фибробласты, оставшиеся в клеточной суспензии ПЗК после отделения других типов клеток, при последующем культивировании используются в качестве фидерного слоя, на который прикрепляются ПЗК. 2. Дана характеристика полученных примордиальных зародышевых клеток сельскохозяйственной птицы в зависимости от видовых особенностей. Изучены морфологические характеристики ПЗК, выделенных из эмбрионов разных видов сельскохозяйственной птицы - кур, перепелов, гусей, уток, цесарок. Данный тип клеток по своим характеристикам существенно отличался от других типов эмбриональных клеток. ПЗК характеризовались шарообразной формой, крупным ядром и узким ободком цитоплазмы. Их размер варьировал в диаметре от 7 до 19 мкм. При этом достоверных различий в размере клеток в зависимости от вида птицы выявлено не было. 3. Оптимизированы условия поддержания в культуре примордиальных зародышевых клеток разных видов сельскохозяйственной птицы при краткосрочном культивировании. Изучена эффективность поддержания в культуре ПЗК разных видов сельскохозяйственной птицы в зависимости от состава ростовой среды и типа используемого фидерного слоя. Установлено, что оптимальным фидерным слоем для культивирования ПЗК птиц являются первичные собственные эмбриональные фибробласты, остающиеся в суспензии ПЗК после их очистки от других типов клеток. При использовании ростовой среды соответствующего состава прикрепление ПЗК к фидерному слою наблюдается на 1-2 сутки культивирования с образованием колоний на 3-4 день. 4. Оптимизированы условия криоконсервации примордиальных зародышевых клеток сельскохозяйственной птицы разных видов. Изучена жизнеспособность ПЗК при использовании криозащитных сред различного состава. Показано, что оптимальной криозащитной средой для зародышевых клеток сельскохозяйственной птицы является среда, включающая 90% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и 10% криопротектора ДМСО. На основании использования предложенных методов и методических подходов по выделению, культивированию и криоконсервации ПЗК разных видов сельскохозяйственной птицы выполнено моделирование технологии создания криобанка зародышевых клеток для разных видов сельскохозяйственной птицы – кур, перепелов, уток, гусей, цесарок.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017 году были проведены исследования, направленные на оптимизацию и отработку отдельных этапов технологической цепочки создания криобанков сперматогенных клеток разных видов сельскохозяйственной птицы. Были получены следующие научные результаты. 1. Изучены особенности сперматогенеза самцов разных видов сельскохозяйственной птицы. Изучена динамика сперматогенеза у самцов сельскохозяйственной птицы – перепела, цесарки, утки, индюки, гусаки. Установлено, что оптимальным возрастом для получения культуры сперматогоний является возрастной период от 1 до 3 недель для перепелов, от 1 до 8 недель – для цесарей и от 1 недели до 3 месяцев - для селезней, индюков и гусаков. В данный возрастной период сперматогенные клетки в семенных канальцах семенников представлены, преимущественно, клетками Сертоли и сперматогониями. 2. Оптимизированы и отработаны методических подходы по получению сперматогенных клеток, в том числе сперматогоний разных видов сельскохозяйственной птицы. Изучена эффективность получения культуры сперматогенных клеток самцов разных видов сельскохозяйственной птицы – перепелов, гусей, уток, цесарок, индюков. Отработаны и оптимизированы методические подходы по дезагрегации ткани семенника и очистке сперматогоний от других типов клеток. Показано, что эффективным методом дезагрегации семенников самцов сельскохозяйственной птицы с целью выделения сперматогенных клеток, в том числе сперматогоний, является их последовательная механическая и ферментативная обработка с использованием 0,25% трипсина и 0,1% раствора коллагеназы. Разделение клеток разных типов с учетом их различной способности к адгезии позволяет получать культуру сперматогоний, максимально очищенную от других типов клеток (до 85%). 3. Дана характеристика полученной культуры сперматогенных клеток самцов сельскохозяйственной птицы в зависимости от видовых особенностей. Изучены морфологические характеристики сперматогоний, выделенных из семенников самцов разных видов сельскохозяйственной птицы - перепелов, гусей, уток, цесарок, индеек. Данный тип клеток по своим характеристикам существенно отличался от других типов соматических клеток. Сперматогонии имели шарообразную форму. Их размер варьировал в диаметре от 12 до 21 мкм. При этом достоверных различий в размере клеток в зависимости от вида птицы выявлено не было. 4. Оптимизированы условия поддержания в культуре сперматогенных клеток разных видов сельскохозяйственной птицы при краткосрочном культивировании. Изучена эффективность поддержания в культуре сперматогенных клеток разных видов сельскохозяйственной птицы в зависимости от состава ростовой среды и типа используемого фидерного слоя. Установлено, что оптимальным фидерным слоем для культивирования сперматогоний птиц являются первичные собственные клетки Сертоли, остающиеся в суспензии сперматогоний после их очистки от других типов клеток. При использовании ростовой среды прикрепление сперматогоний к фидерному слою наблюдается на 2 сутки культивирования с образованием колоний на 4-8 дни. Добавление дополнительных ростовых факторов в состав культуральной среды при краткосрочном культивировании сперматогоний нежелательно, т.к. наблюдается интенсивный рост клеток Сертоли и фибробластов, которые быстро заполняют поверхность чашки и подавляют рост сперматогоний. 5. Оптимизированы условия криоконсервации сперматогенных клеток, в том числе сперматогоний самцов разных видов сельскохозяйственной птицы. Изучена жизнеспособность сперматогенных клеток при использовании криозащитных сред различного состава. Показано, что оптимальной криозащитной средой для сперматогенных клеток сельскохозяйственной птицы является среда, включающая 70% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 20 % среды ДМЕМ и 10% криопротектора ДМСО. На основании использования предложенных методов и методических подходов по выделению, культивированию и криоконсервации сперматогенных клеток разных видов сельскохозяйственной птицы выполнено моделирование технологии создания криобанка сперматогенных клеток для разных видов сельскохозяйственной птицы – перепелов, уток, гусей, цесарок, индюков.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках выполнения проекта в 2018 году оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки создания криобанка семени разных видов сельскохозяйственной птицы. Получены следующие научные результаты. Оптимизированы методические подходы по получению семени от разных видов сельскохозяйственной птицы. Применение специального станка для фиксации птицы позволило оптимизировать процесс взятия семени за счет возможности проведения необходимых манипуляций одним оператором и снижения стрессовых ситуаций для самцов. При использовании данного подхода не было установлено снижения качества получаемого семени. У большинства самцов отмечалось незначительное увеличение объема получаемого эякулята семени. Установлено, что оптимальным для получения семени с сохранением ее качества является сбор спермы у петухов и индюков 1 раз в 2 дня, у цесарей, селезней и гусаков - 1 раз в 3 дня. При более частом использовании самцов наблюдалось снижение качества получаемого семени, в частности, объема эякулята и концентрации спермиев до 58 и 42%, соответственно, в зависимости от вида. Показано влияние на качество нативного семени самцов птиц ряда биотических и абиотических факторов. Однофакторный дисперсионный анализ показал зависимость объема получаемого семени от индивидуальных особенностей самцов на уровне 33% (P<0,05) у петухов, 27% - у перепелов, 25% - у цесарей, 30% - у гусаков и 31% - у индюков. При этом достоверного влияния фактора индивидуальной особенности на pH среды спермы установлено не было. Показатели качества семени самцов сельскохозяйственной птицы также варьировали в зависимости от индивидуальных и видовых особенностей. Коэффициент вариации по содержанию подвижных сперматозоидов в эякуляте петухов, перепелов, цесарей, гусаков, селезней и индюков составил соответственно 25, 20, 27, 25, 18 и 23%. По доле живых сперматозоидов и частоте встречаемости анормальных спермиев данный показатель достигал соответственно 10, 12, 17, 15, 17, 19% и 18, 23, 20, 12, 17, 21%. Наибольшая часть нарушений морфологии спермиев отмечались в области жгутика независимо от вида птицы. Видовые и индивидуальные особенности самцов сельскохозяйственной птицы определяли и морфометрические показатели сперматозоидов. Наибольшая длина сперматозоидов отмечалась у петухов - 93±1,6 мкм. У перепелов, цесарей и индюков данный показатель был ниже соответственно на 8, 9 и 15%. Минимальное значение было установлено у селезней и гусаков - 69±0,3 и 71±0,4 мкм, соответственно. Наибольшая внутривидовая вариабельность данного показателя отмечалась у петухов и цесарей – 85,3 и 76,5%, соответственно. У индюков, гусаков и селезней разброс значений по длине спермиев был значительно меньше: коэффициент вариации не превышал 4,3%. Морфометрический анализ отдельных сегментов сперматозоидов – головки и хвоста – у разных видов птицы показал различия в процентном соотношении их размеров. У индюков, петухов и цесарей соотношение длин головки и хвоста спермиев было на уровне 15 и 75%. У гусаков, селезней и перепелов данные показатели составили 24 и 76%. Сравнительный анализ оценки качества спермы птиц с использованием ручного (стандартные методы) и автоматизированного (CASA-технологии) анализа проб показал, что применение пакета прикладных программ позволяет получать более точные результаты. Разница между оцениваемыми показателями при использовании данных подходов по оценке семени достигала в зависимости от видовых особенностей птицы: по концентрации спермиев в эякуляте – 8%, по общему числу спермиев в эякуляте – 5,0%, по доле анормальных спермиев – 4,2%, по проценту живых сперматозоидов - 2,3%. Качество семени птиц варьировало в зависимости от используемых сред для разбавления, хранения и криоконсервации спермиев. Оптимальные показатели были установлены при использовании среды для разбавления и хранения спермы сельскохозяйственных птиц, включающей глюкозу, фруктозу, трис, глутамат и фосфорнокислый натрий. Выживаемость спермиев при разбавлении данной средой при температуре 42°С составила у перепелов и цесарей – 160 минут, у петухов, гусаков и индюков - 208, 100 и 190 минут, соответственно, что было на 23-37% выше по сравнению с аналогичным показателем, установленным при использовании других сред. Использование данной среды, дополненной криопротектором, способствовало также лучшей сохранности подвижности спермиев после цикла замораживания-оттаивания. В данном случае у петухов разница по содержанию подвижных сперматозоидов в заморожено-оттаянном семени с аналогичным показателем, установленным для нативной спермы не превышала 40%. У перепелов, цесарей, гусаков, селезней и индюков данный показатель составил 43, 41, 30, 35 и 44%. При применении стандартной среды, включающей глюкозу, сахарозу, натрий углекислый, подвижность спермиев после криоконсервации по сравнению с параметрами свежеполученного семени снижалась у петухов на 62%, у перепелов, гусаков, цесарей, селезней и индюков – на 66, 47, 60, 55 и 60%, соответственно.