Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 г. были проведены исследования, направленные на оптимизацию и отработку отдельных этапов технологической цепочки получения трансгенных кур с использованием трансформированных in vitro сперматогоний. Были получены следующие научные результаты. 1. Выделена и охарактеризована культура сперматогоний петуха и оптимизированы условия выделения и поддержания в культуре данного типа клеток. Изучена эффективность получения культуры сперматогоний петуха в зависимости от метода очистки сперматогоний от других типов клеток и типа используемого фидерного слоя. Установлено, что разделение клеток разных типов с учетом их различной способности к адгезии позволяет получать культуру сперматогоний, максимально очищенную от других типов клеток, в частности, от самой многочисленной популяции клеток Сертоли. Вместе с тем, единичные соматические клетки, оставшиеся в клеточной суспензии сперматогоний после отделения других типов клеток, при последующем культивировании используются в качестве фидерного слоя, на который прикрепляются сперматогонии. Культивирование сперматогоний на фидерных слоях или чашках, обработанных 0,2% желатином, в ростовой среде соответствующего состава позволяет получать колонии сперматогоний на 3-4 сутки. Наиболее оптимальным фидерным слоем для культивирования сперматогоний петуха является фидерный слой собственных клеток Сертоли. 2. Произведен дизайн и оптимизация системы редактирования для клеток кур. Выполнены оптимизация, дизайн и анализ эффективности работы инструментов редактирования генома - Cas9 и gRNA - в куриных клетках. Показана возможность использования для модификации генома кур Cas9, кодируемого кодон-оптимизированной для человека последовательностью. На основании сравнительного анализа эффективности функционирования РНК гидов, экспрессирующихся в куриных клетках с человеческого и куриного U6 промотора, было показано отсутствие достоверных различий в эффективности синтеза гидов с использованием данных промоторов, что говорит о возможности их применения для модификации генома кур. 3. Оптимизированы методические приемы доставки генных конструкций в сперматогонии петухов in vitro. Выполнен сравнительный анализ различных систем доставки генных конструкций в сперматогонии петухов: использование лентивирусных частиц, липофильная трансфекция и электропорация. Показано, что оптимальным методом генетической трансформации сперматогоний петухов in vitro с точки зрения эффективности и материальных затрат является электропорация. 4. Разработана схема стерилизации (выключения сперматогенеза) петухов. Определена оптимальная концентрация бусульфана для стерилизации петухов и экспериментально отработан хирургический доступ к семенникам для введения раствора бусульфана и донорских клеток. Установлено, что оптимальной для выключения сперматогенеза у петухов является концентрация бусульфана от 60 мг/кг до 80 мг/кг живой массы. Показано достоверное снижение количества сперматогенных клеток в семенных канальцах до 95 раз по сравнению с контролем до незначительной популяции сперматогенных клеток, представленной, в основном, клетками Сертоли (95%). 5. Разработана схема трансплантации донорских сперматогоний в семенники стерильных реципиентов и изучена результативность колонизации донорскими сперматогониями семенников петухов-реципиентов. Экспериментально отработан метод введения донорских клеток в семенники, включая подготовку донорских клеток для введения, оптимизирована доза донорских клеток для введения. Установлено, что оптимальной для введения в семенники петухов-реципиентов является концентрация донорских клеток от 2 млн. до 3 млн./семенник. При использовании данных концентраций показано сокращение периода восстановления сперматогенеза в 1,7 раз по сравнению с контролем. Эффективность проводимых манипуляций по трансплантации донорских сперматогоний в семенники стерильных петухов-реципиентов подтверждена экспериментально с использованием донорских клеток, меченных красителем Hoechst 33342. Показано наличие флуоресцирующих донорских клеток в семенных канальцах подопытных петухов. На основании комплекса разработанных и оптимизированных методов выполнено теоретическое моделирование технологии создания генетически модифицированных линий кур с использованием трансформированных донорских сперматогоний.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе выполнения НИР по проекту в 2017 году оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки получения трансгенных кур с использованием трансформированных in vitro примордиальных зародышевых клеток (ПЗК). Получены следующие научные результаты. 1. Оптимизированы условия, влияющие на выделение и поддержание в недифференцированной форме при краткосрочном культивировании ПЗК кур. Установлено, что результативным методом дезагрегации эмбрионов кур является их ферментативная обработка в 0,15% растворе трипсина. Включение в состав раствора трипсина ЭДТА повышает эффективность диссоциации эмбриональной ткани. Результативность получения максимально однородной культуры ПЗК кур зависит от метода их очистки от других типов клеток и используемого фидерного слоя. Разделение клеток по способности к адгезии позволило максимально очистить культуру ПЗК от остальных типов клеток, в частности от эмбриональных фибробластов (83%). Единичные эмбриональные фибробласты, оставшиеся после разделения клеток в клеточной суспензии, при последующем культивировании служили фидерным слоем, на который прикреплялись ПЗК. Показано, что первичные собственные эмбриональные фибробласты являлись оптимальным фидерным слоем для краткосрочного культивирования ПЗК по сравнению с использованием для этих целей клеток STO и культивируемых эмбриональных фибробластов кур. Культивирование ПЗК на фидерных слоях с использованием соответствующей ростовой среды, позволило получить колонии ПЗК на 4-5 сутки. 2. Разработан способ элиминации эндогенных ПЗК в эмбрионах-реципиентах. Установлено, что оптимальной дозой бусульфана для элиминации эндогенных ПЗК в эмбрионах кур является 100 мкг данного препарата в расчете на эмбрион. Использование бусульфана в указанной концентрации способствовало уменьшению диаметра гонад и снижению количества ПЗК в них по сравнению с контролем, соответственно, на 53 и 92 %. При введении в эмбрионы бусульфана в большей концентрации (до 250 мкг) отмечались нарушения в развитии эмбрионов, обусловливающие высокую эмбриональную смертность. 3. Оптимизирован способ введения донорских ПЗК в эмбрионы кур и изучена эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов. В серии экспериментов по введению донорских ПЗК в эмбрионы кур установлено, что высокая результативность колонизации донорскими клетками гонад эмбрионов достигается при введении донорского материала в количестве не менее 400 клеток в расчете на эмбрион. Оптимальной средой для разведения донорских клеток является среда ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы (4,5г/л). 4. Оптимизированы методические приемы доставки генетических конструкций в примордиальные зародышевые клетки кур in vitro Изучена эффективность генетической трансформации ПЗК кур с использованием лентивирусных частиц, липофильной трансфекции и электропорации. Показана эффективность лентивирусной трансфекции и электропорации. Установлено, что оптимальными параметрами электропорации для трансформации ПЗК кур являются 350 V и 100 мксек. Эффективный показатель MOI (multiplicity of infection) для трансдукции ПЗК лентивирусными частицами не превышает 2,5. Использование вируса в большой концентрации является токсичным для клеток. 5. Созданы клетки, несущие репортерные конструкции под эндогенными промотерно-энхансерными системами. Сконструирована конструкция на основе плазмиды LSL-Cas9-Rosa26TV посредством встраивания гена для негативной селекции DTA под контролем конститутивного PGK промотора и гена устойчивости к неомицину NeoR под конститутивным промотором CMV. Также в последовательность конструкции входил репортер EGFP, экспрессирующийся только под эндогенным контролем. Выполнен дизайн и клонирование гидов для таргетирования эндогенного локуса к ACTB (куриный бета-актин, ID: 396526) для конститутивной экспрессии репортера, EOMES (эомезодермин, ID: 428443) для ПЗК-специфичной экспрессии и OVA (овальбумин, ID: 396058) для тканеспецифичной экспрессии. В конструкцииию для таргетирования также были заклонированы участки гомологии (плечи) для гомологичной рекомбинации для генов ACTB, EOMES и OVA. На основании комплекса разработанных и оптимизированных методов выполнено теоретическое моделирование технологии получения трансгенных кур с использованием трансформированных донорских ПЗК.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках выполнения проекта в 2018 году было выполнено экспериментальное моделирование технологии получения трансгенных кур с использованием трансформированных донорских клеток – примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) и сперматогоний. С применением методических подходов, разработанных и оптимизированных ранее на этапах выполнения проекта в 2016 и 2017 гг., была получена трансгенная птица с интегрированной рекомбинантной ДНК в половых клетках. Эффективность получения такой птицы варьировала в зависимости от типа вводимых донорских клеток. Получение трансгенной птицы с использованием в качестве донорского генетического материала ПЗК включало следующие этапы: (1) выделение ПЗК из 6-дневных эмбрионов кур; (2) трансформация выделенной культуры ПЗК посредством введения репортерного гена ZsGreen; (3) обработка эмбрионов-реципиентов на 24 часу инкубации бусульфаном в концентрации 100 мкг/эмбрион с целью элиминации собственных ПЗК; (4) введение в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов-реципиентов трансформированных ПЗК в количестве 1000 клеток/эмбрион; (6) инкубация эмбрионов-реципиентов; (7) получение молодняка птицы. После введения донорских клеток в эмбрионы было получено 29 цыплят. Наличие флуоресцирующих клеток в репродуктивных органах (яичники, семенники) было установлено у 6 из 10 исследованных особей в возрасте 1,5-2 месяцев. Процент трансформированных половых клеток достигал 32%. По достижении половозрелости наличие рекомбинантной ДНК в половых клетках было подтверждено у 12 особей: 4 петухов и 8 кур. Для получения трансгенной птицы с использованием в качестве генетического материала сперматогоний были проведены следующие этапы: (1) выделение сперматогоний из семенников 5-недельных петушков; (2) трансформация полученной культуры сперматогоний посредством введения репортерного гена ZsGreen; (3) выключение сперматогенеза у петухов-реципиентов посредством введения в семенники бусульфана в концентрации 80 мг/семенник; (4) введение трансформированных сперматогоний в концентрации 1 млн. в семенники стерильных петухов-реципиентов; (5) получение спермы от петухов-реципиентов и оценка ее качественных и количественных показателей через 1, 2, 3 ,4 и 5 месяцев после введения донорских клеток для анализа эффективности восстановления сперматогенеза и результативности трансформации. Наличие рекомбинантной ДНК было установлено у 6 из 9 самцов-реципиентов. Птица, полученная после введения донорских ПЗК и сперматогоний, была использована для получения трансгенного потомства с целью оценки возможности ее использования в качестве исходной родительской формы для создания линий трансгенных особей с заданными признаками. Было использовано: (1) 8 кур и 4 петуха, полученные посредством трансплантации трансформированных in vitro примордиальных зародышевых клеток; (2) 4 петуха с трансплантированными трансформированными in vitro донорскими сперматогониями. От каждой курицы было получено по 15-20 цыплят, которые были исследованы на наличие рекомбинантного гена методом ПЦР. Процент полученных трансгенных цыплят варьировал от 0 до 15,8% и составил в среднем 5,4±1,9%. У 3 кур трансгенных особей в полученном потомстве выявлено не было, что может быть связано с недостаточной выборкой. Петухов предварительно оценивали по качеству семени. У трансгенных петухов по сравнению с нетрансгенными самцами отмечалось снижение качества семени. Наиболее выраженные изменения отмечались у петухов с трансплантированными донорскими сперматогониями. В данном случае объем эякулята и концентрация сперматозоидов были снижены на 38 и 29%, соответственно. У трансгенных петухов также отмечалось увеличение доли сперматозоидов с анормальной морфологией. Разница с данным показателем, установленным для нетрансгенных петухов, достигала 22%. Наибольший процент нарушений отмечался в области жгутика. Снижение у трансгенных петухов качественных и количественных показателей семени обуславливало и его более низкую оплодотворяющую способность: процент оплодотворенных яиц и полученных цыплят был соответственно на 6 и 10% ниже аналогичных показателей, установленных для нетрансгенной птицы. Доля трансгенных цыплят, полученных от трансгенных петухов, варьировала от 0 до 11,1 %. Полученные трансгенные цыплята были использованы для оценки наличия и исследования характера экспрессии интегрированного репортерного гена в отдельных органах и тканях. Экспрессия рекомбинантного белка была установлена, преимущественно, в клетках печени, мышцах, кишечнике, селезенке, репродуктивных органах (семенники, яичники). Полученные результаты подтверждают перспективность использования ПЗК и сперматогоний в качестве донорского генетического материала для получения трансгенной птицы с интегрированной рекомбинантной ДНК в половых клетках с целью последующего их использования в качестве исходных родительских форм для создания трансгенных линий кур с заданными признаками. Предлагаемые методы получения трансгенной птицы с использованием трансформированных ПЗК или сперматогоний могут быть использованы и для геномного редактирования сельскохозяйственной птицы с целью выключения экспрессии отдельных генов или внесения новых генов.