Аннотация результатов, полученных в 2017 году
На данном этапе проекта были подробно изучены фотофизические и фотохимические свойства катионных, водорастворимых порфиринатов фосфора, способных к высокоэффективной генерации синглетного кислорода, что делает очень перспективным их использование в качестве фотосенсибилизаторов, а также новых препаратов для антимикробной ФДТ. Для выявления особенностей фотофизических свойств порфиринатов фосфора(V) были синтезированы две серии комплексов с тетрафенилпорфирином и моно-пиридил-трифенилпорфирином с различной природой аксиальных лигандов на фосфоре. Было установлено, что в полученных сериях соединений квантовый выход генерации синглетного кислорода изменяется от 0% до 100% в зависимости от природы аксиального лиганда. В тоже время квантовый выход флуоресценции изменяется незначительно. Фотосенсибилизирующая активность соединений в различных растворителях коррелирует с временами жизни синглетного кислорода, а природа заместителей в мезо-положении порфирина оказывает незначительное влияние на фотофизические параметры изучаемых соединений. Было установлено, что ключевым фактором оказывается природа аксиальных лигандов. Так, присутствие ароматических фрагментов в апикальной позиции к атому фосфора делает величину квантового выхода синглетного кислорода близкой к нулю, в то время как в присутствии алкоксильных аксиальных лигандов квантовый выход генерации синглетного кислорода практически количественный. Для объяснения полученных результатов была привлечена время-разрешенная адсорбционная спектроскопия и квантово-химические расчеты. Кинетические кривые релаксации возбужденного состояния, позволили установить пути релаксации возбужденных состояний и оценить квантовый выход триплетного состояния и его время жизни в рядах полученных соединений. Исходя из совокупности полученных данных, было установлено, что в случае соединений, содержащих ароматический аксиальный заместитель, координированный по атому фосфора, протекает дополнительный процесс переноса заряда, который и дезактивирует генерацию синглетного кислорода в этих типах комплексов. Квантово-химические расчеты подтвердили существование процесса переноса заряда в таких комплексах. Таким образом, на нескольких сериях порфиринатов фосфора P(V) было показано, что фотофизические свойства этих соединений в целом, а главным образом генерацию синглетного кислорода, можно тонко настраивать, изменяя природу аксиальных лигандов. Знание полученных закономерностей позволяет использовать этот тип соединений в качестве эффективных фотосенсибилизаторов как в водных, так и в органических средах. В работе также разработаны подходы к получению другого типа катионных водорастворимых порфиринов - -бензимидазолил-производных тетрафенилпорфирина, а также его металлокомплексов цинка(II), индия(III). С целью получения гибридных материалов на основе фталоцианинатов металлов и наночастиц диоксида церия на данном этапе были разработаны подходы к получению комплексов галлия и индия с фталоцианином А3B-типа, содержащего два [2’-(2’’-гидроксиэтокси)этокси] заместителя, благодаря которым возможно связывание с поверхностью НЧ. В результате подбора оптимальных условий целевые фталоцианинаты удалось получить с выходами 80-90%. Для полученных соединений были измерены основные фотофизические характеристики, из которых видно, что данные соединения обладают достаточно высокими квантовыми выходами триплетного состояния, что обуславливает перспективу их применения в качестве фотосенсибилизаторов. На предыдущих этапах проекта для предварительного тестирования поведения новых фотосенсибилизаторов на клеточном уровне нами разрабатывать модельные системы и соответствующие вещества-ловушки, которые могут «улавливать» синглетный кислород на поверхности бислойных липидных мембран (БЛМ). С помощью этого метода были изучены адсорбция и фотодиамические характеристики сульфированных фталоцианинов алюминия. На данном периоде проекта мы исследовали адсорбцию и фотодинамические свойства фотосенсибилизаторов родственного класса – тетрасульфопорфиринов. Так как свойства данных молекул могут варьироваться изменением кислотности среды было подробно изучено влияние рН и ионной силы раствора на их адсорбцию на БЛМ и фотодинамические свойства. Это очень важно, для дальнейшего применения этих сенсибилизаторов, учитывая различие в кислотности среды здоровых и опухолевых клеток. Прежде всего, было показано, что в нейтральной среде тетра-сульфопорфирин адсорбируется на поверхности БЛМ в виде четырехзарядного аниона. При уменьшении рН адсорбция тетрасульфопорфирина подавляется, что может быть связано как с протонированием внутрициклических атомов азота и уменьшении сродства порфирина к липидной мембране, так и с агрегацией молекул в растворе. С помощью спектральных методов было доказано, что при низких значениях рН происходит последовательное образование агрегатов, не способных встраиваться в БЛМ. Зависимость скорости разрушения di-4-ANEPPS на поверхности мембраны при ее освещении от концентрации тетрасульфопорфирина в растворе была нелинейной. Аналогичная зависимость наблюдалась ранее и в случае четырежды сульфированного фталоцианина, хотя в случае фталоцианинов с меньшим числом сульфогрупп эта зависимость стремилась к насыщению, что объяснялось тушением синглетного кислорода молекулами фталоцианина в мембране. Существенное отличие тетрасульфопорфирина от изученного нами ранее сульфированного фталоцианина состоит в том, что в последнем случае наблюдалось эффективное тушение синглетного кислорода молекулами ловушки на поверхности мембраны, а в случае с порфирина такого тушения не было замечено. Возможно, это вызвано тем, что положение молекул тетрасульфопорфирина на поверхности мембраны отличается от положения молекул сульфированного фталоцианина. На данном этапе также впервые были изучены адсорбция и фотодинамическая активность двух катионных бензоимидазопорфиринов (свободное основание и комплекс цинка). Адсорбция этих порфиринов на БЛМ приводила к появлению положительного скачка потенциала на границе мембраны. При этом было показано, что свободный порфирин вызывает больший по величине скачок потенциала, чем комплекс цинка. Фотодинамическую активность порфиринов определяли по скорости разрушения адсорбированных на БЛМ молекул ловушки (di-4-ANEPPS), соответсвенно по скорости исчезновения дипольного потенциала, создаваемого этими молекулами на границе мембраны, при освещении в присутствии порфиринов. Освещение проводили с помощью полупроводниковых лазеров зеленого (532 нм) или фиолетового (405 нм) диапазона света. Фотодинамическая активность при освещении фиолетовым лазером оказалась эффективнее. Фотоэффекты наблюдались при адсорбции di-4-ANEPPS либо с той же (цис) стороны, где были молекулы порфирина, либо с противоположной (транс) стороны. При сравнении скоростей разрушения di-4-ANEPPS при освещении свободного порфирина и порфирината цинка установлена большая эффективность первого. Это может быть вызвано как различием констант адсорбции этих соединений, так и влиянием эффекта тяжелого атома на фотофизические характеристики сенсибилизатора в целом. В развитие наших работ, особый интерес представляет исследование влияния CeO2 на генерацию синглетного кислорода в водной среде. На данном этапе проекта нами были проведены эксперименты по получению водорастворимого органо-неорганического гибридного материала на основе фталоцианина и нанокристаллического диоксида церия путем стабилизации наночастиц диоксида церия в водном золе фталоцианиновым комплексом. Для этого готовили золь нанокристаллического диоксида церия методом термогидролиза исходя из (NH4)2Ce(NO3)6. Из результатов просвечивающей электронной микроскопии следует, что золь состоит из частиц размером около 2 нм. Для получения гибридного материала синтезировали растворимый в воде комплекс скандия с тетра-15-краун-5-фталоцианином [Sc(CR4Pc)OAc]. Изучение процессов образования гибридных материалов изучали методами динамического светорассеяния с использованием гелий-неонового лазера с λ = 632,8 нм и электронной спектроскопией поглощения. Для решения поставленной задачи получения гибридного материала использовали несколько подходов. Первый заключался в предварительном обмене аксиального ацетат-иона на цитрат с последующим добавлением к нему золя диоксида церия без стабилизатора на поверхности. Для изучения обмена аксиального лиганда использовали цитрат натрия и аммония, который наиболее часто применяют для стабилизации золей диоксида церия. Однако, использование такого подхода для получения гибридных материалов оказалось мало эффективным. Второй способ состоял во взаимодействии водного раствора [Sc(CR4Pc)OAc] с водным золем диоксида церия, стабилизированного цитратами натрия или аммония. Исходя из данных ЭСП, было показано, что именно цитрат натрия оказывает наибольшее солюбилизирующее/мономеризирующее воздействие на фталоцианинат скандия. С другой стороны, методом DLS было установлено, что цитрат натрия хуже стабилизирует исходный золь нанокристаллического диоксида церия по сравнению с цитратом аммония. Тем не менее было показано, что при взаимодействии [Sc(CR4Pc)OAc] с цитрат-стабилизированными золями диоксида церия в итоговом растворе появляются частицы с гидродинамическим радиусом примерно вдвое большим, чем в случае исходного раствора фталоцианина, а также в растворе практически полностью отсутствуют частицы исходного золя нанокристаллического диоксида церия. Это может свидетельствовать об успешном образовании гибридных частиц фталоцианина с наночастицами CeO2. Для выявления устойчивости таких гибридов и их склонности к ассоциации, полученные при взаимодействии раствора [Sc(CR4Pc)OAc] и золя диоксида церия системы были повторно охарактеризованы методом DLS спустя четверо суток. Полученные данные свидетельствуют о том, что распределение и гидродинамические радиусы гибридных частиц практически не меняются, что указывает на устойчивость полученной системы. Таким образом, найденный подход может быть успешно применен для формирования гибридных материалов – фталоцианин/диоксид церия. По полученным результатам было опубликовано 4 статьи (ChemCom; Nanosystems: physics, chemistry, mathematics; Nano Hybrids and Composites; Электрохимия), 2 статьи поданы в редакции журналов Scientific Reports и J. Porphyrins&Phthalocyanines. В рамках выполнения работы руководитель представила 3 пленарных доклада на профильных конференциях, а исполнители проекта – 3 устных доклада.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На данном этапе проекта с целью получения новых водорастворимых фотосенсибилизаторов было выбрано несколько стратегий. Первая из них заключалась в получении карбоксизамещенных фталоцианинатов металлов, не склонных к агрегации. С этой точки зрения были разработаны подходы к получению фенокси-замещенных фталоцианинов, содержащих карбоксильные группы в ароматических заместителях, которые за счет возникновения стерических препятствий должны существовать в водных растворах преимущественно в мономерном виде. И действительно, подбор условий синтеза исходного фталонитрила с последующей темплатной сборкой целевого фталоцианина и дополнительной стадией гидролиза сложноэфирных групп позволил получить целевой фотосенсибилизатор ZnPc(COONa)16 в виде водорастворимой натриевой соли. Спектральные исследования показали, что полученный фотосенсибилизатор действительно находится в преимущественно мономерном состоянии в водном растворе, что является одним из важным критериев его эффективности. Изучение поведения данного фотосенсибилизатора в водных растворах с различным рН позволило установить границы его дальнейшего применения. Так, одним из перспективных применений полученного карбоксифталоцианина является получение на его основе гибридных органо-неорганических материалов. На примере слоистого гидроксида европия Eu2(OH)5Cl·xH2O была изучена возможность интеркаляции полученного фталоцианина в полости этого неорганического материала. Согласно данным рентгенофазового анализа и ИК-спектроскопии было установлено что при взаимодействии комплекса ZnPc(COONa)16 с избытком Eu2(OH)5Cl·xH2O в водном растворе при pH=7.1 происходит встраивание молекулы фталоцианина в структуру слоистого материала с расположением плоскости молекулы параллельно слоям гидроксида европия. Другим способом получения материалов на основе гексадекакарбоксифталоцианина является синтез металлорганических пористых полимеров. Проведенные сольвотермальные реакции комплекса ZnPc(COONa)16 с нитратами цинка, никеля и кобальта в диметилформамиде в присутствии избытка бензойной кислоты приводили к образованию рентгеноаморфных гелей, перспективы применения которых требуют дальнейшего детального изучения. С целью расширения серии катионных порфиринов, растворимых в полярных средах, на данном этапе были предприняты попытки синтеза имидазопорфиринов, содержащих пиридильные и 4-диметиламинофенильные группы с их дальнейшей кватернизации. Однако на стадии получения нитропроизводных целевых порфиринов мы столкнулись с проблемой их низкой растворимости. Другим подходом к получению анионных порфиринов, растворимых в полярных средах, является ацилирование амино-производных дикарбоновыми кислотами. Мы осуществили последовательность трансформаций, заключающуюся в нитровании порфирина в бета-положение, восстановлении нитро-группы и ацилировании полученного 2-аминопорфирина под действием янтарного ангидрида. Следует отметить, что несмотря на нестабильность амино-производных порфирина, стадия ацилирования протекает с выходом, близким к количественному и таким образом была решена задача получения нового типа водорастворимых порфиринов анионного типа. Поскольку первичным процессом, инициирующим фотодинамическую активность фталоцианиновых фотосенсибилизаторов, является поглощение света, то квантово-химическая интерпретация электронных спектров поглощения является важной задачей, а разработка адекватных подходов, предсказывающих электронные спектры фталоцианинов, позволит проводить направленный дизайн новых соединений с заданными свойствами. Среди таких подходов особое место занимает время зависимая теория функционала плотности (TD-DFT), активно используемая для предсказания энергий вертикальных переходов фталоцианинов и родственных соединений. Тем не менее, высокие требования к вычислительной мощности и длительность самих вычислений ограничивают возможности использования данного метода для интерпретации усложненных систем (расширенных фталоцианинов, многокомпонентных ансамблей и пр.), а также не позволяют проводить экспрессный скрининг спектральных свойств серий родственных соединений для выявления эффектов заместителей. На данном этапе работы нами было проведено сравнение результатов расчета с использованием полного TD-DFT и его упрощенной версии sTD-DFT на примере шести модельных фталоцианинов с использованием различных функционалов. Было установлено, что при использовании функционала CAM-B3LYP метод sTD-DFT характеризуется многократным уменьшением времени расчета и повышением точности по сравнению с полным TD-DFT, благодаря чему sTD-DFT может рассматриваться как перспективный подход к интерпретации спектральных свойств фталоцианинов и использоваться для дизайна новых фотосенсибилизаторов. Сравнительное изучение фотофизических свойств порфириновых фотосенсибилизаторов на поверхности бислойных липидных мембран (адсорбция на мембране и генерация синглетного кислорода) проводилось на 4-х водорастворимых порфиринах – анионном тетрасульфо-тетрафенилпорфирине (TPPS4) и трех производных бета-имидазо-порфиринов с положительно заряженными периферийными группами: свободный порфирин (Porph-N), а также комплекс цинка (Porph-N-Zn) и индия (Porph-N-In). Установлено, что в случае сульфопорфирина молекулы адсорбируются на липидной мембране в виде четырехзарядных анионов. В случае положительно заряженных порфиринов склонность к адсорбции на мембране увеличивались в ряду Porph-N-Zn < Porph-N < Porph-N-In. Также было установлено, что потенциалы, вызванные адсорбцией порфиринов зависят от рН среды: при этом закономерности изменения адсорбции положительно заряженных порфиринов значительно отличались от таковой для анионных тетрасульфированных порфиринов. Это можно объяснить тем, что протонированная форма тетрасульфопорфирина на мембране не адсорбируется, вследствие их агрегации в растворе. В случае положительно заряженных порфиринов такой агрегации, по-видимому, не происходит. Фотодинамическая эффективность порфиринов изучалась по скорости разрушения встроенных в мембрану молекул стирилового красителя di-4-ANEPPS при освещении мембраны фиолетовым лазером (длина волны 405 нм, мощность излучения 1 мВт). Сравнение скоростей разрушения di-4-ANEPPS для трех положительно заряженных порфиринов показало, что по степени фотодинамической эффективности эти порфирины различаются в той же последовательности, что и по величине потенциалов адсорбции: Porph-N-Zn < Porph-N < Porph-N-In. В случае всех изученных порфиринов эта скорость оказалась пропорциональна поверхностной плотности их молекул в мембране. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фотодинамическая эффективность этих порфиринов в значительной степени определяется эффективностью их связывания с липидной мембраной, а квантовый выход генерации синглетного кислорода в мембране для всех порфиринов различается незначительно. Изучение степени тушения молекулы стирилового красителя, расположенного на различных сторонах мембраны относительно фотосенсибилизатора позволило разработать математическую модель для оценки длины пробега синглетного кислорода между молекулами и источника и тушителя, а также резидентное время его нахождения в мембране. В зависимости от поведения тушителя можно также определять расположение фотосенсибилизатора в мембране. Таким образом нами показана перспектива как разработки новых типов фотосенсибилизаторов на основе порфиринов и фталоцианинов для фотодинамической терапии рака, так и первичного скрининга этих фотосенсибилизаторов с помощью разработанной в проекте методики адсорбции сенсибилизаторов на бислойных липидных мембранах и одновременного изучения фотофизического поведения этих молекул на поверхности моделей клеточных мембран. Таким образом, все задачи, поставленные на 2018 год, были выполнены. По полученным результатам было опубликовано 3 статьи в журналах Scientific Reports, J. Photochem.& Photobiol. и J. Porphyrins&Phthalocyanines, одна статья подана в редакцию журнала J. Phys.Chem. A. В рамках выполнения работы было представлено 4 доклада на профильных конференциях, 1-пленарный и 3 - устных.