Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Для выделения стероидных сапонинов из листьев T. terrestris были предложены ультразвуковая экстракция (УЭ), экстракция кипящим растворителем (ЭКР), метод экстракции кипящим растворителем при пониженном давлении (ЭКРП) и экстракция в аппарате Сокслета (СЭ). Такие параметры экстрагирования, как в случае УЭ: растворитель (метанол, этанол, изопропанол и ацетонитрил), соотношение фаз при экстракции, концентрация изопропанола и ацетонитрила, время экстракции, в случае ЭКР: компонент растворителя (изопропанол и ацетонитрил), соотношение фаз при экстракции, концентрация растворителя и для СЭ – время экстракции, были оптимизированы в ходе однофакторного эксперимента. В ходе оптимизации методов ЭКР и СЭ была обнаружена термическая нестабильность протодиосцина, что приводит к его разложению в случае продолжительной экстракции. Время экстракции и температура были оптимизированы с помощью двухфакторного эксперимента для наиболее перспективных методов извлечения – ЭКР и ЭКРП. Сорбент Acclaim RSLC C18 использовался для ВЭЖХ разделения экстрактов с последующим масс-спектрометрическим детектированием определяемых соединений в режиме мониторинга выделенных ионов. Извлечение методом УЭ в водно-органическом растворителе сравнивали с ЭКР, ЭКРП и СЭ, для которых был установлен одинаковый максимум выхода экстракции в оптимизированных условиях извлечения, и показано, что он был примерно в 1.2 раза лучше выхода последовательной УЭ. Также была продемонстрирована возможность полного извлечения протодиосцина и диосцина на первой стадии экстракции в ходе многоэтапного эксперимента для методов ЭКР и ЭКРП. Хорошие показатели открываемости были достигнуты для всех четырех методов экстракции в оптимизированных условиях, но термическое разложение протодиосцина наблюдалось после 90 минут ЭКР, поэтому рекомендуемое время экстракции составило 60 минут (при 92 °C, используя 50% раствор изопропанола в воде в качестве растворителя). Результаты работы были апробированы на 3-ем съезде аналитиков России http://www.rusanalytchem.org/car2017/Publications/2017-Abstracts.pdf и на международной конференции Euroanalysis 2017 http://euroanalysis2017.se/Poster_Presentation_Abstracts_2017-08-26.pdf и подготовлены для публикации в журнале "Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants". Разработана методика экстракции и хроматографического разделения вогонина, скутелларина, байкалина и байкалейна в экстрактах из растительного сырья с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Предложенный подход был испытан в лаборатории авторов на образцах экстрактов Scutellariae baicalensis. Для хроматографического разделения аналитов использовали сорбент Acclaim RSLC с обращенной фазой. Обнаружение проводили методом тандемной масс-спектрометрией с отрицательной ионизацией при электрораспылении в режиме регистрации выбранных ионных переходов. Хорошая линейность наблюдалась в диапазоне от 20 до 2000 нг/мл, а достигнутые пределы обнаружения составили 10 нг/мл для байкалеина, 1 нг/мл для байкалина и 0.5 нг/мл для вогонина и скутелларина.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Первым этапом проделанной за 2-ой год работы был поиск оптимальных параметров экстракции для выделения сахаров и сахароспиртов из хвойной листвы. Для этого применялся экспериментальный дизайн Тагучи-L9. Были установлены параметры, при которых достигаются наиболее высокие степени извлечения компонентов: концентрация MeOH - 30% (вода - 70%), время экстракции - 30 мин, температура 60 °C. Далее для проверки данных условий был использован метод последовательной экстракции. Он показал, что более 90% каждого компонента извлекается из растительного сырья на первой же стадии экстракции. Аналогичная работа по оптимизации параметров была проделана для извлечения активных компонентов из клеточной культуры и растительного сырья D. deltoidea. Для этого использовали экспериментальный дизайн латинского квадрата. Были установлены следующие параметры экстракции для клеточной культуры: время экстракции, 60 мин; соотношение ацетонитрил:вода в экстрагенте, 50%; отношение объема растворителя и навески образца, 400 мл/г. В свою очередь для выделения тех же соединений из растительного материала оптимальными оказались следующие параметры: время извлечения, 90 мин; ацетонитрил:вода, 50%; отношение объема растворителя и навески образца, 400 мл/г. Также как и в предыдущем эксперименте, для проверки параметров проводили последовательную экстракцию. Проверка показала, что в указанных условиях из растительного материала при однократной экстракции извлекается 65-75% от содержания аналитов. Для клеточной культуры результаты экстракции были значительно выше – более 98%. Далее, для разделения и выделения сахаров, сахароспиртов и их производных из компонентов растительного сырья использовали гидрофильную хроматографию. Наилучшее разделение достигалось при температуре колонки 40 °С, градиентном режиме элюирования с уменьшением содержания ацетонитрила с 94 до 60%. Дополнительно было показано, что добавление модификаторов в подвижную фазу не приводит к улучшенному разделению пар изомерных компонентов, а также, что удерживание моносахаридов растет с увеличением числа гидроксильных групп в структуре. Другим направлением наших исследований являлось создание универсальной стратегии оценки качества растительного сырья, основанной на определении характерных компонентов исследуемых растений, то есть биомаркеров. Исходя из наличия уникальных биомаркеров в экстрактах различных растений, были предложены три разные схемы анализа сырья. Первый – если уникальных биомаркеров в составе один или несколько. В таком случае для идентификации выбирают два наиболее интенсивных MRM перехода и их соотношение из масс-спектра выбранного биомаркера. Второй – биомаркеров в экстракте группа и они схожи по структуре. Тогда используется метод «отпечатков пальцев», используя сканирование выбранных ионов, а полученные профили используют для идентификации. Третий путь – растения не содержат уникальных биомаркеров и идентификация проводится путем сравнения соотношений концентраций распространенных соединений, как правило, флавоноидов. Такой подход был применен на 30 растениях с определением 61 биомаркера. Результаты работы были апробированы на международной конференции «XXII International Mass Spectrometry Conference»: http://www.rsc.org/events/detail/30849/xxii-international-mass-spectrometry-conference, подготовлены статьи в журналах: Journal of Chromatography B (http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2018.06.005; http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2018.02.012) и Biomedical Chromatography (http://dx.doi.org/10.1002/bmc.4363).

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе исследований в течение 3-го года работы по проекту были исследованы 12 наиболее распространенных видов хвойных пород умеренных широт Евразии. Основными сахарами, в их составе оказались глюкоза, фруктоза, сахароза и раффиноза. Эти вещества были обнаружены в значительных количествах почти у всех исследованных видов растений. На долю главных углеводов приходилось от 97% до 100% от исследованных углеводов. Основную долю (около 91%), обнаруженных адаптогенных сахароспиртов, составляли циклические полиолы - циклитолы (инозитол, секвоитол и пинитол). У растений рода Abies суммарное количество циклитолов в хвое превышало его содержание у других исследованных видов в 4.2 раза. В растениях из этого рода содержание инозитола и пинитола по сравнению с другими исследованными растениями было выше в 9 и в 4 раза, соответственно. Для классификации видов хвойных растений на основании паттерна распределения сахаров и сахароспиртов были применены методы математической статистики, включая линейную регрессию, метод опорных векторов, метод случайного леса. Данные анализа обширного биологического материала, использованного в работе, свидетельствуют о том, что содержание исследованных соединений внутри конкретного вида растения, в пределах естественных ареалов произрастания, не сильно зависит от возраста и природно-климатических факторов. В рамках проведенных исследований были разработаны и апробированы на реальных образцах схемы извлечения и выделения стероидных гликозидов и агликонов тритерпеновых сапонинов женьшеня. Выбраны условия экстракции исследуемых соединений из разных образцов растительных материалов и клеточных культур. Разработаны схемы фракционирования полученных экстрактов методами жидкость-жидкостной экстракции, колоночной хроматографии и твердофазной экстракции. Выбраны условия хроматографического разделения интересующих компонентов, которые могут быть взяты за основу для препаративного выделения отдельных биоактивных соединений в промышленных масштабах. Выделены и охарактеризованы шесть основных компонентов стероидной фракции гликозидов диоскореи дельтовидной. Для их детектирования в смесях применяли ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения. В проведенных исследованиях были протестированы различные условия гидролиза для выделения основных действующих начал гинсенозидов женьшеня – агликонов протопанаксадиола и протопанаксатриола. Показано, что щелочной гидролиз дает меньше побочных продуктов, чем отщепление сахаров в присутствии кислот. Наилучших результатов удалось добиться, используя метилат натрия в ацетонитриле, так как в отсутствие подвижных протонов гидролиз проходил до конца в течение 4-6 часов. Эти эксперименты дали возможность также разработать новую методику определения суммарного содержания гинсеноиздов женьшеня в растительном сырье и продуктах на его основе. Разработанный метод ВЭЖХ-МС был проверен на линейность, пределы обнаружения, предел количественного определения, точность и достоверность. Сформирован банк ВЭЖХ-МС данных об основных и перспективных физиологически активных компонентах (всего около 100) в экстрактах из изученных растений, обладающих адаптогенными, антидепрессивными, антистрессовыми, антиоксидантными, тонизирующими и др. свойствам. Результаты работы были представлены на ведущих российских и международных конференциях (https://www.hplc2019-milan.org/download/Final_Program_HPLC_web_ver.pdf; https://ysm2019.weebly.com/uploads/1/6/0/8/16083628/book-of-abstract_final_a5.pdf), а также востребованы в исследованиях, проводимых на биологическом факультете МГУ имени М.В.Ломоносова и в институте физиологии растений (ИФР РАН). В опубликованных обзорных статьях рассмотрены и систематизированы различные варианты хроматомасс-спектрометрического анализа экстрактов из лекарственных растений, а также варианты интегрирования таких высокоинформативных инструментов в исследования по изучению биоактивности этих экстрактов и индивидуальных компонентов, Показаны основные направлении развития метода ВЭЖХ-МС в области анализа растительных материалов, с учетом, как результатов данного проекта, так и существующего мирового опыта, представленного в виде открытых публикаций в ведущих международных журналах. Предложена уникальная система классификации существующих аналитических процедур по типу извлекаемой информации об индивидуальном и структурно-групповом химическом составе натуральных продуктов (http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2019.460501).