Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В отчетном году работы по Проекту велись согласно плану, в нескольких направлениях. Поскольку основной целью Проекта является понимание на уровне пространственной структуры цепочки событий, происходящих при активации мембранных белков I типа, необходимо получать информацию о структуре объектов исследований в условиях, максимально приближенных к нативным. Дополнительно, правильное окружение важно при решении задач по ренатурации крупных фрагментов мембранных белков, полученных в клетках бактерий Поэтому, остро встает вопрос разработки мембраноподобных сред, максимально адекватно моделирующих окружение объектов исследований. В прошлом году нами был проведен существенный объем работ по характеризации различных мембраноподобных сред и разработке новых систем, не вызывающих денатурацию водорастворимых доменов мембранных белков. В отчетном году работы в данном направлении были посвящены методикам доказательства адекватности мембраноподобных сред, а также разработке сред с более нативным липидным составом. Были разработаны несколько пакетов программного обеспечения для автоматического серийного анализа размера частиц мембраноподобных сред при различных температурах с применением различных методов анализа и расчета ошибок; для деконволюции и автоматического поиска сигналов в одномерных спектрах; для определения свободной энергии димеризации трансмембранных доменов белков в бицеллах, с учетом предложенных ранее геометрических моделей частиц. Поскольку холестерин является важнейшим компонентом клеточных мембран, нами были разработаны протоколы приготовления фосфолипидных бицелл с содержанием холестерина. Была изучена температурная стабильность таких систем, показано, что холестерин влияет на увеличение размера бицелл при нагреве, а также на стабильность систем ниже температуры фазового перехода липида. Показано, что влияние холестерина может быть в определенной степени воспроизведено его полярным аналогом, холестерина гемисукцинатом. Разработанные протоколы и полученные характеристики позволят в будущем как проводить исследования специфических взаимодействий белок-холестерин, так и изучать неспецифические эффекты данного липида, связанные с изменением параметров липидного бислоя. Важнейшей характеристикой липидных мембран является их способность претерпевать фазовые переходы между жидкокристаллическим и гелевым агрегатными состояниями липидов. Достаточно давно ведутся споры о том, что изотропные бицеллы малого размера, используемые при исследованиях методом спектроскопии ЯМР недостаточно хорошо воспроизводят липидный бислой и не содержат выраженного участка липидного бислоя. Наличие фазовых переходов в таких частицах позволило бы разрешить противоречие. В отчетном году были проведены исследования методами спектроскопии 31Р, которые позволили разработать методику детекции фазовых переходов в изотропных бицеллах. Нам удалось показать, что фазовые переходы между гелевым и жидкокристаллическим состояниями действительно происходят в бицеллах, причем в частицах даже самого малого размера. При этом фазовые переходы являются фракциональным - частицы с различным состоянием бислоя сосуществуют в растворе в широком диапазоне температур. Показано, что уменьшение размера бицелл приводит к понижению критической температуры. Помимо свойств бислоя мы изучили влияние размера бицелл на структуру и стабильность встроенных в них мембранных белков. Мы показали, что размер частиц не влияет существенным образом ни на пространственную структуру ни на энергию димеризации модельного трансмембранного домена белка HER4. Таким образом, впервые была однозначно подтверждена способность бицелл воспроизводить свойства клеточной мембраны. В рамках второго направления был проведен существенный объем работ в области белковой инженерии. Был осуществлен широкий поиск условий продукции и ренатурации белков NADE, CARD домена RIP2, TIR доменов рецепторов TLR1 и TLR3, внутриклеточного домена TrkA, связок трансмембранного и внутриклеточного доменов мутантной формы рецептора р75 и TrkA. Были созданы десятки различных генетических конструктов, опробованы сотни различных условий ренатурации белков. Проведенные работы позволили достичь значительных результатов. Так, был получен ковалентный димер трансмембранной и внутриклеточной части рецептора р75 в нативно свернутом виде в липид/белковых нанодисках, что соответствует практически нативному окружению. Для данной конструкции было проведено исследование пространственной структуры и подвижности различных участков белка, которое позволило оценить влияние ковалентной димеризации на поведение внутриклеточного домена рецептора. Было показано, что димеризация не приводит к структурированию линкерного участка между трансмембранным и глобулярным внутриклеточным доменом белка и не приводит к образованию устойчивого димера между внутриклеточными доменами. Данное наблюдение подтверждает высказанную нами ранее гипотезу о механизме активации рецептора р75. Для ряда белков (CARD домен RIP2 и TIR домен TLR1) удалось разработать протоколы получения в нативно свернутом состоянии. Данный результат позволяет рассчитывать на успешное определение структуры данных белков в будущем году, что будет являться прорывным результатом. Были продолжены и работы по изучению димеризации трансмембранных доменов белков I типа. Была разработана новая методика верификации и предсказания интерфейсов димеризации трансмембранных доменов белков на основе статистического анализа изменений различных измеряемых величин в ЯМР спектрах. Была проанализирована предсказательная сила различных параметров и показано, что наилучшим образом коррелирует с интерфейсом димеризации изменения скоростей вращения метильных групп, в то время как изменения химических сдвигов обладают малой предсказательной силой. Была исследована пространственная структура димера трансмембранного домена рецептора HER2 мутантной формы V659E. Данная мутация вызывает опухолевую трансформацию клеток. Показано, что мутация не влияет на общую энергию димеризации трансмембранных спиралей, однако приводит к стабилизации активной формы димера в мицеллах детергента, хотя для белка дикого типа активная форма наблюдалась исключительно в липидных бицеллах. Полученные данные позволяют судить о механизме влияния полярных замен в трансмембранных доменах на активацию рецепторов - мембранных белков I типа. Полученные в 2017 году в рамках Проекта результаты являются новыми и во многом опережают мировой уровень научных исследований в области проекта, более того, являются прорывными. В 2017 году в рамках Проекта были опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах из первого квартиля - Scientific Reports и Journal of Biomolecular NMR. Результаты работы были представлены на нескольких научных конференциях - международных конгрессах EUROMAR 2017, FEBS Congress 2017 и Объединенном научном форуме в Москве.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году работа в рамках Проекта велась по трем основным направлениям. Наибольшего успеха удалось добиться в области исследования свойств мембраноподобных сред. Коллективу Проекта удалось разработать методику оценки адекватности мембраноподобных сред на основе бицелл. В качестве критериев адекватности использовали форму зависимости размера частиц от соотношения липид/детергент, а также наличие фазовых переходов липидного бислоя. С использованием методики были проанализированы несколько десятков различных составов бицелл, в результате чего была получена информация, о том, какие липиды можно использовать для приготовления данного типа мембраноподобных сред, а каких компонентов следует избегать. Так, было показано, что не следует использовать дигептаноилфосфатидилхолин в качестве ободообразующего агента, что бицеллы на основе только анионных липидов не воспроизводят поведение липидного бислоя, а также, что этаноламины дестабилизируют растворы бицелл и со временем выпадают в осадок. При этом удалось получить бицеллы на основе сфингомиелина, а также смесей цвиттерионных и анионных липидов. Такие бицеллы воспроизводят ряд характеристик липидных бислоев того же состава, например, зависимость температуры фазового перехода от концентрации моновалентных и бивалентных катионов. Были разработаны и опробованы методики исследования взаимодействия между трансмембранными доменами и холестерином, однако для использованных объектов взаимодействие обнаружено не было. Разработанная в прошлом году методика для измерения свободной энергии димеризации трансмембранных доменов белков в бицеллах была применена для изучения влияния состава мембраны на взаимодействия между мембранными доменами рецептора HER4. Удалось показать, что структура димера белка оставалась неизменной в окружении четырех различных липидов, в то время как стабильность димера существенным образом зависела от толщины липидного бислоя. Данная работа - первое в мире экспериментальное исследование зависимости энергии белок-белкового взаимодействия от липидного состава окружения, проведенное не на модельных пептидах, а на реальном биологическом объекте. Данная часть работы была опубликована в трех статьях в международных рецензируемых журналах (Langmuir и BBA-Biomembranes), представлена на международных и российских конференциях, а также описана в публикации на сайте ИБХ РАН: http://www.ibch.ru/press/news/science/2635. Вторым направлением являлось изучение механизмов активации рецептора нейротрофинов р75. Коллективу удалось получить мутантную версию белка с заменой Т249С, которая является активной, независимо от присутствия лиганда. Проводилось исследование двух конструкций такого мутанта: трансмембранного домена (Т249С-ТМ) и связки трансмембранного и внутриклеточного доменов (Т249С-ТМДС). Для конструкции Т249С была получена пространственная структура димера, которая не проявила существенных отличий от структуры домена дикого типа. Связка Т249С-ТМДС была встроена в нанодиски и бицеллы в форме ковалентного димера, были получены спектры ЯМР, измерены параметры ЯМР-релаксации ядер 15N. Как оказалось, наличие остатка цистеина в положении 249 никак не влияет на поведение внутриклеточной части белка. Более того, добавление восстановителя, который разрушает межмолекулярную дисульфидную связь данного остатка, приводит к изменениям в спектрах ЯМР, локализованных исключительно в области N-конца белка и не передается через мембрану. Полученные данные подтверждают, что состояние внутриклеточной части р75 не связано со структурой внеклеточного домена, что требует пересмотра предложенного ранее механизма активации белка. Результаты работы были представлены в стендовом докладе на конгрессе FEBS Congress 2018. Помимо непосредственно рецептора р75, в рамках Проекта было проведено исследование структуры внутриклеточного адаптерного белка RIP2, который участвует в запуске сигнального каскада, инициируемого рецептором. В отчетном году удалось определить пространственную структуру высокого разрешения CARD домена RIP2 крысы. Структура позволила выявить значительные ошибки в опубликованной ранее конформации гомологичного белка человека. При этом, было обнаружено особенное рН-зависимое поведение белка. В то время, как при рН около 4.0, белок существовал в виде мономеров, при рН близком к 6.0 белок преимущественно образовывал олигомеры высокого порядка и выпадал в осадок при физиологических значениях, что согласуется с информацией о том, что RIP2 может образовывать фибриллы in vivo. Для описания данного явления были проведены дополнительные эксперименты, измерены рКа всех ионогенных групп домена, изучена зависимость олигомеризации домена от ионной силы раствора. В результате было показано, что олигомеризация CARD доменов вызвана электростатическими взаимодействиями. Были проведены эксперименты по титрованию связки трансмембранного и внутриклеточного доменов р75 CARD доменом белка RIP2. Было показано, что при физиологических условиях взаимодействия не наблюдается, RIP2 преимущественно формирует олигомеры высокого порядка, не взаимодействующие с доменом смерти р75. Таким образом, несмотря на то, что при кислых рН и в условиях изолированных доменов, можно наблюдать взаимодействия между белками, в более нативном окружении - в присутствии мембраны и трансмембранного домена, взаимодействие не наблюдается, что в очередной раз демонстрирует важность исследований, проводимых в контексте конструкций, содержащих несколько доменов мембранных белков. Результаты работы были опубликованы в журнале PLOS One. Отдельно стоит отметить работу коллектива по установлению структуры толл-подобных рецепторов (TLR). В текущем году была изучена пространственная структура внутриклеточного TIR домена рецептора TLR1. Было проведено отнесение сигналов в спектрах ЯМР, спектры были проанализированы, были получены ограничения на расстояния, на основании которых рассчитана пространственная структура. Эффективное разрешение структуры составляет 1.7 А. Сравнение со структурой, полученной методами рентгеноструктурного анализа выявило значительные различия, вызванные замыканием внутримолекулярной дисульфидной связи, происходящим при кристаллизации домена даже в присутствии восстанавливающего агента. На основании данных ЯМР-релаксации был проведен модель-независимый анализ внутримолекулярной подвижности домена, что позволило определить участки молекулы, которые совершают быстрые (в пс-нс диапазоне) и медленные (в мкс-мс диапазоне) движения. Эксперименты по разбавлению позволили выявить наличие короткоживущего димерного состояния и локализовать возможный интерфейс димеризации. Результаты по данному направлению являются прорывными и представляют собой первое в мире исследование структуры и подвижности TIR домена TLR в растворе, результаты работы были представлены в стендовом докладе на конгрессе FEBS Congress 2018. Все запланированные на 2018 год работы были выполнены, все запланированные результаты были достигнуты.