Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Оптимизирована генетическая конструкция для in vitro трансляции библиотек потенциальных дегронов, в которую будет интегрирована бицистронная кассета-репортер для одновременной продукции двух флуоресцентных беков-репотреров (репортерного белка, несущего сигнал протеасомной деградации и нормировочного флуоресцентного белка). Показано, что наиболее оптимальной комбинацией обладает вектор lRBS, который предусматривает использование одного промотора T7 и двух сильных RBS, несущих ε-последовательность. При этом между первым стоп-кодоном и вторым RBS интегрирован линкер, аналогичный первому 5’-UTR. Для создания клеточного дисплея сконструирована и валидирована кассета, в которую будет клонирована библиотека потенциальных дегронов, слитных с TagGFP2, и будет включать в себя сайт внутренней посадки рибосомы IRES (internal ribosome binding site) и синий флуоресцентный белок BFP в качестве репортёра. Разработан биоинформатический алгоритм разбивки белков протеома на короткие кодирующие их нуклеотидные последовательности (n порядка 200 000), которые будут получены путем высокопроцессивного матричного синтеза олигонуклеотидов. В рамках выполнения пункта Программы была создана панель из 8 баркодированных убиквитинов для дальнейшего получения слитных конструкций с красным фотоактивируемым белком PA-TagRFP. Проведена количественная идентификация представителей библиотеки путем широкомасштабного секвенирования баркодируюших участков с использованием платформы Illumina. Дальнейший анализ стабильности PA-TagRFP, слитного с различным числом убиквитинов, показал уменьшение количества белка при достижении длины цепи в два и более убиквитинов. При введении поправки, учитывающей линейность полиубиквитиновой цепи, результирующее количество убиквитинов при пересчёте на К48 составляет около 4, что полностью соответствует классическим представлениям. Созданы варианты убиквитина, содержащие только по одному функциональному лизину, в то время как все остальные заменены на аргинин (варианты К0 с возвратными заменами UbK0 R6K, UbK0 R11K, UbK0 R27K, UbK0 R29K, UbK0 R33K, UbK0 R48K, UbK0 R63K). Последовательности ДНК, кодирующие данные варианты убиквитина в единой рамке считывания с пептидом LAP2, были интегрированы в лентивирусные векторы, кодирующие слитный белок BFP-LplA (AAG), где BFP – мономерный вариант синего флуоресцентного белка. LAP2-Ub и BFP-LplA(AAG) соединялись сайтом внутренней посадки рибосомы (IRES, Internal Ribosome Entry Site). Полученные варианты убиквитина были протестированы на предмет их функциональности. Показано накопление полиубиквитиновых цепей каждого типа ветвления в клетках, обработанных PS-341. Полиубиквитиновые цепи, составленные из всех вариантов Ub, кроме К0 и К0 R6K, в явном виде накапливались в присутствии ингибитора протеасомы. Полученные конструкции в дальнейшем планируется использовать для широкомасштабного профилирования стабильности полиубиквитиновых цепей различного типа ветвления. http://www.poisknews.ru/theme/science/30263/ https://ria.ru/science/20161214/1483564695.html http://rscf.ru/ru/node/2619

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
– На уровне человеческого протеома было подтверждено выдвинутое ранее в отношении основного белка миелина (MBP) предположение, что главным фактором его ассоциации с протеасомой выступает не специфическая аминокислотная последовательность, а наличие в его составе большого числа основных аминокислот, таких как лизин и аргинин и, как следствие, высокий положительный заряд. Показано универсальная роль заряда в убикивтин-независимом протеолизе белков. – Определено время полужизни молекулы убиквитина в клетках млекопитающих. Показано, что убиквитин подвергается гидролизу преимущественно протеасомой, так как при добавлении ингибитора протеасомы происходит резкое замедление его метаболизма. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что время полужизни Ub в полиубиквитиновых конъюгатах составляет приблизительно 4 часа. – Проведена оценка средневзвешенного количества молекул убиквитина, конъюгированных с белками, подвергающимися протеасомной деградации. Полученные данные свидетельствуют, что, во-первых, в случае ингибирования протеасомы происходит перераспределение убиквитиновых конъюгатов в сторону более легких. Во-вторых, большая часть «супер-убиквитинированных» белков не подвергалась гидролизу протеасомой. Построение зависимости интенсивности флуоресценции резоруфина от массы убиквитиновых конъюгатов вместе с наложением распределения молекулярных масс белков человеческого протеома показало, что динамическое равновесие между убиквитинированием и деубиквитинированием достигается в диапазоне 6-7 мономеров убиквитина на белковую молекулу. Ранее считалось, что цепочка из 4 молекул убиквитина является минимально достаточной для узнавания протеасомой, наши же результаты свидетельствуют о том, что оптимальным количеством является не менее 6 молекул убиквитина с верхним лимитом 12-15 мономеров на белковую молекулу. Еще одним важным выводом является то, что полиубиквитинированные белки, ковалентно связанные с более чем 20 мономерами убиквитина, не являются оптимальными субстратами для протеасомы, тогда как активность деубиквитинирующих ферментов по отношению к этим конъюгатам увеличивается логарифмически в соответствии с их длиной. – Проведен широкомасштабный анализ стабильности полиубиквитиновых цепей различного типа ветвления на уровне отдельных клеток. Как и следует из имеющихся литературных данных, полиубиквитиновые цепи, ветвящиеся по лизинам K11 и K48, были наименее стабильны и в значительной степени стабилизировались в результате добавления PS-341. Полиубиквитиновые цепи со связями через лизины K29, K33 и K63 показали изначально большую стабильность и менее выраженную реакцию на добавление ингибитора протеасомы. Интересно отметить, что цепи с ветвлением по лизину K6 были неустойчивыми и одновременно были индифферентны к добавлению PS-341, тогда да как цепи с ветвлением по лизину K27 были наиболее стабильными, но аналогично К6 не реагировали на добавление ингибитора протеасомы. Таким образом, обработка клеток ингибитором протеасомы приводила к накоплению различных вариантов полиубиквитиновых цепей, что подтверждает способность протеасомы распознавать неканонические полиубиквитиновые цепи. – Полученные нами данные свидетельствуют о синхронизации моноубиквитинирования гистона Н2А и протеасом-опосредованного метаболизма убиквитина, таким образом, убиквитин-лигазы цитоплазматической и ядерной локализации конкурируют между собой за пул убиквитина, находящийся в состоянии динамического равновесия. При этом нами была зафиксирована более интенсивная диффузия убиквитина через ядерную мембрану, чем это предполагалось ранее. Проведенное сравнение скорости разрушения убиквитина дикого типа и варианта UbК0 R27К дает основания предположить депонирование убиквитина, ассистируемое убиквитин-лигазой Е3 RNF168, в виде ковалентного конъюгата с Н2АХ с его последующим высвобождением в общедоступный клеточный пул.