КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-14-00585

НазваниеМолекулярный механизм убиквитин-независимого протеолиза белков протеасомой и его роль в норме и патологии

РуководительБелогуров Алексей Анатольевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2017 - 2018

КонкурсКонкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словапротеасома; иммунопротеасома; основной белок миелина; гидролиз; гистоны; убиквитин; рассеянный склероз; презентация антигенов

Код ГРНТИ34.15.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Протеасома – высокомолекулярный белковый комплекс, обладающий протеолитической активностью с широкой субстратной специфичностью. 20S протеасома в качестве протеолитического ядра входит в состав 26S протеасомы. Основная функция протеасомы – деградация "отслуживших" и дефектных клеточных белков. Около 90% короткоживущих и 70% долгоживущих белков разрушаются 26S протеасомой по убиквитин-зависимому пути. Для распознавания протеасомой белок, который необходимо разрушить, должен быть связан с одной или несколькими молекулами убиквитина – полипептида, содержащего 76 аминокислотных остатков. Маркировку белков осуществляет сложная система ферментов, называемая системой убиквитинилирования. Данная система включает в себя до 1000 белков, что составляет примерно 5% всего генома, которая обеспечивает тотальный контроль за любым белком по той или иной причине подвергающимся протеасомной деградации. Несмотря на невероятное количество работ, посвященных убиквитину и процессам полиубиквитинилирования, до сих пор отсутствует чёткое понимание ряда важнейших характеристик образования и разрушения полиубиквитиновых цепей, а также метаболизма самого убиквитина. В последнее время в научной литературе появилось ряд свидетельств о возможности убиквитин-независимой деградации полипептидов. При этом маркером для деградации может служить или аминокислотная последовательность внутри самого белка, или некая вспомогательная молекула-переносчик. Принимая во внимание, что в этом случае взаимодействие субстрат-протеасома выходит за рамки регуляторной функции системы убиквитинилирования, данный факт однозначно свидетельствует о важности внимательного изучения подобных исключений. Существующие данные по убиквитин-независимым протеасомным дегронам по большей части разрозненны и нуждаются в создании глобальной концепции, которая охватила бы все имеющиеся факты убиквитин-независимого протеолиза. В этой связи проект планируется продолжить по двум направлениям, (1) комбинаторная селекция и рациональный дизайн убиквитин-независимых дегронов. (2) Изучение внутриклеточного метаболизма убиквитина.

Ожидаемые результаты
В рамках представляемого проекта предполагается получить следующие важнейшие результаты: параметры метаболизма убиквитина в физиологических условиях; динамика роста и разрушения полиубиквитиновых цепей; параметры равновесной средней длины полиубиквитиновой цепи; характер транспорта убиквитина через ядерную мембрану, в том числе убиквитинилирование гистона Н2А; влияние разветвления цепи на узнавание полиубиквитиновых цепей протеасомой; создание убиквитин-независимых дегронов рациональным дизайном; селекция убиквитин-независимых дегронов из комбинаторных библиотек с применением клеточного дисплея и микрофлюидных технологий. К публикации планируется серия статей в высокорейтинговых научных изданиях и глава в монографии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Оптимизирована генетическая конструкция для in vitro трансляции библиотек потенциальных дегронов, в которую будет интегрирована бицистронная кассета-репортер для одновременной продукции двух флуоресцентных беков-репотреров (репортерного белка, несущего сигнал протеасомной деградации и нормировочного флуоресцентного белка). Показано, что наиболее оптимальной комбинацией обладает вектор lRBS, который предусматривает использование одного промотора T7 и двух сильных RBS, несущих ε-последовательность. При этом между первым стоп-кодоном и вторым RBS интегрирован линкер, аналогичный первому 5’-UTR. Для создания клеточного дисплея сконструирована и валидирована кассета, в которую будет клонирована библиотека потенциальных дегронов, слитных с TagGFP2, и будет включать в себя сайт внутренней посадки рибосомы IRES (internal ribosome binding site) и синий флуоресцентный белок BFP в качестве репортёра. Разработан биоинформатический алгоритм разбивки белков протеома на короткие кодирующие их нуклеотидные последовательности (n порядка 200 000), которые будут получены путем высокопроцессивного матричного синтеза олигонуклеотидов. В рамках выполнения пункта Программы была создана панель из 8 баркодированных убиквитинов для дальнейшего получения слитных конструкций с красным фотоактивируемым белком PA-TagRFP. Проведена количественная идентификация представителей библиотеки путем широкомасштабного секвенирования баркодируюших участков с использованием платформы Illumina. Дальнейший анализ стабильности PA-TagRFP, слитного с различным числом убиквитинов, показал уменьшение количества белка при достижении длины цепи в два и более убиквитинов. При введении поправки, учитывающей линейность полиубиквитиновой цепи, результирующее количество убиквитинов при пересчёте на К48 составляет около 4, что полностью соответствует классическим представлениям. Созданы варианты убиквитина, содержащие только по одному функциональному лизину, в то время как все остальные заменены на аргинин (варианты К0 с возвратными заменами UbK0 R6K, UbK0 R11K, UbK0 R27K, UbK0 R29K, UbK0 R33K, UbK0 R48K, UbK0 R63K). Последовательности ДНК, кодирующие данные варианты убиквитина в единой рамке считывания с пептидом LAP2, были интегрированы в лентивирусные векторы, кодирующие слитный белок BFP-LplA (AAG), где BFP – мономерный вариант синего флуоресцентного белка. LAP2-Ub и BFP-LplA(AAG) соединялись сайтом внутренней посадки рибосомы (IRES, Internal Ribosome Entry Site). Полученные варианты убиквитина были протестированы на предмет их функциональности. Показано накопление полиубиквитиновых цепей каждого типа ветвления в клетках, обработанных PS-341. Полиубиквитиновые цепи, составленные из всех вариантов Ub, кроме К0 и К0 R6K, в явном виде накапливались в присутствии ингибитора протеасомы. Полученные конструкции в дальнейшем планируется использовать для широкомасштабного профилирования стабильности полиубиквитиновых цепей различного типа ветвления. http://www.poisknews.ru/theme/science/30263/ https://ria.ru/science/20161214/1483564695.html http://rscf.ru/ru/node/2619

 

Публикации

1. - Биохимик: лекарство от рассеянного склероза появится через 2-3 года РИА Новости, - (год публикации - ).

2. - Отбить атаку. Российские ученые предлагают способы борьбы с опасными недугами Еженедельная газета научного сообщества "Поиск", № 46(2017) (год публикации - ).

3. - REG-alpha/beta heptamers coordinate autoimmune attack on the myelin sheaths ab intra FutureBiotech, - (год публикации - ).

4. - Российские ученые нашли два способа борьбы с рассеянным склерозом РНФ, - (год публикации - ).

5. Белогуров А., Кудряева А. Immunoproteasomes equipped by REG alpha/beta heptamers coordinate autoimmune attack on the myelin sheaths ab intra FEBS JOURNAL, Том: 284 Стр.: 301-301 Приложение: 1 (год публикации - 2017).

6. Кудряева А., Белогуров А. Proteasome-mediated hydrolysis of myelin basic protein: charge instead of ubiquitination FEBS JOURNAL, Том: 284 Стр.: 302-302 Приложение: 1 (год публикации - 2017).

7. Кудряева. А., Галатенко В.В., Мальцева Д.В., Хаустова Н.А., Кузина Е., Тоневицкий А.Г., Габибов А.Г., Белогуров А. The Transcriptome of Type I Murine Astrocytes under Interferon-Gamma Exposure and Remyelination Stimulus Molecules, 15;22(5). pii: E808 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
– На уровне человеческого протеома было подтверждено выдвинутое ранее в отношении основного белка миелина (MBP) предположение, что главным фактором его ассоциации с протеасомой выступает не специфическая аминокислотная последовательность, а наличие в его составе большого числа основных аминокислот, таких как лизин и аргинин и, как следствие, высокий положительный заряд. Показано универсальная роль заряда в убикивтин-независимом протеолизе белков. – Определено время полужизни молекулы убиквитина в клетках млекопитающих. Показано, что убиквитин подвергается гидролизу преимущественно протеасомой, так как при добавлении ингибитора протеасомы происходит резкое замедление его метаболизма. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что время полужизни Ub в полиубиквитиновых конъюгатах составляет приблизительно 4 часа. – Проведена оценка средневзвешенного количества молекул убиквитина, конъюгированных с белками, подвергающимися протеасомной деградации. Полученные данные свидетельствуют, что, во-первых, в случае ингибирования протеасомы происходит перераспределение убиквитиновых конъюгатов в сторону более легких. Во-вторых, большая часть «супер-убиквитинированных» белков не подвергалась гидролизу протеасомой. Построение зависимости интенсивности флуоресценции резоруфина от массы убиквитиновых конъюгатов вместе с наложением распределения молекулярных масс белков человеческого протеома показало, что динамическое равновесие между убиквитинированием и деубиквитинированием достигается в диапазоне 6-7 мономеров убиквитина на белковую молекулу. Ранее считалось, что цепочка из 4 молекул убиквитина является минимально достаточной для узнавания протеасомой, наши же результаты свидетельствуют о том, что оптимальным количеством является не менее 6 молекул убиквитина с верхним лимитом 12-15 мономеров на белковую молекулу. Еще одним важным выводом является то, что полиубиквитинированные белки, ковалентно связанные с более чем 20 мономерами убиквитина, не являются оптимальными субстратами для протеасомы, тогда как активность деубиквитинирующих ферментов по отношению к этим конъюгатам увеличивается логарифмически в соответствии с их длиной. – Проведен широкомасштабный анализ стабильности полиубиквитиновых цепей различного типа ветвления на уровне отдельных клеток. Как и следует из имеющихся литературных данных, полиубиквитиновые цепи, ветвящиеся по лизинам K11 и K48, были наименее стабильны и в значительной степени стабилизировались в результате добавления PS-341. Полиубиквитиновые цепи со связями через лизины K29, K33 и K63 показали изначально большую стабильность и менее выраженную реакцию на добавление ингибитора протеасомы. Интересно отметить, что цепи с ветвлением по лизину K6 были неустойчивыми и одновременно были индифферентны к добавлению PS-341, тогда да как цепи с ветвлением по лизину K27 были наиболее стабильными, но аналогично К6 не реагировали на добавление ингибитора протеасомы. Таким образом, обработка клеток ингибитором протеасомы приводила к накоплению различных вариантов полиубиквитиновых цепей, что подтверждает способность протеасомы распознавать неканонические полиубиквитиновые цепи. – Полученные нами данные свидетельствуют о синхронизации моноубиквитинирования гистона Н2А и протеасом-опосредованного метаболизма убиквитина, таким образом, убиквитин-лигазы цитоплазматической и ядерной локализации конкурируют между собой за пул убиквитина, находящийся в состоянии динамического равновесия. При этом нами была зафиксирована более интенсивная диффузия убиквитина через ядерную мембрану, чем это предполагалось ранее. Проведенное сравнение скорости разрушения убиквитина дикого типа и варианта UbК0 R27К дает основания предположить депонирование убиквитина, ассистируемое убиквитин-лигазой Е3 RNF168, в виде ковалентного конъюгата с Н2АХ с его последующим высвобождением в общедоступный клеточный пул.

 

Публикации

1. Белогуров А.А. Биохимические основы аутоиммунной нейродегенерации на правах рукописи, - (год публикации - 2018).

2. Гайнова К.М., Кудряева А.А., Белогуров А.А. Design of lipoate ligase library with following selection of variants for intracellular site-specific protein labeling by derivates of lipoic acids FEBS OPEN BIO, - (год публикации - 2018).

3. Кудряева А.А. Молекулярный механизм узнавания полипептидных субстратов регуляторными субчастицами протеасомы на правах рукописи, - (год публикации - 2018).

4. Кудряева А.А., Белогуров А.А. Протеасома: наномашинерия созидательного разрушения Biochemistry (Moscow), т. 59, 2019, с. 323–392 (год публикации - 2019).

5. Кудряева А.А., Белогуров А.А. Стохастика разрушения: аутофаголизосомная система клетки Акта Натура, - (год публикации - 2019).

6. Кудряева А.А., Кузина Е.С., Зубенко О.Д., Смирнов И.В., Белогуров А.А. Charge-mediated proteasome targeting FASEB J., - (год публикации - 2019).

7. Кудряева А.А., Тупикин А., Кабилов М., Белогуров А.А. Metabolism of different types of polyubiquitin chains FEBS OPEN BIO, - (год публикации - 2018).