Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Исследования, проведенные в 2017 году, были посвящены решению актуальных задач молекулярной фармакологии методами ЯМР и программными средствами, разработанными или модифицированными на предыдущих этапах выполнения проекта. Продолжено исследование белков, входящих в состав теломеразы из термофильных дрожжей Hansenula (Ogataea) polymorpha - N-терминального домена (TEN) основной каталитической субъединицы TERT и белка Est3. Механизм действия теломеразы основан на динамических взаимодействиях ее каталитической субъединицы (TERT) с нуклеиновыми кислотами - теломеразной РНК, теломерной ДНК и ДНК/РНК-гетеродуплексом. В ходе проведенных исследований идентифицированы аминокислотные остатки TEN, которые участвуют во взаимодействии с теломеразной РНК (TER) и в распознавании «вилки», образующейся при синтезе ДНК на матрице РНК. Полученные данные позволяют предполагать, что роль TEN домена TERT состоит в ограничении размера гетеродуплекса в ходе синтеза теломерных повторов. Полученные экспериментальные результаты позволили также предложить структурную модель активного комплекса TERT Hansenula polymorpha, где TEN домен участвует в ограничении длины гетеродуплекса путем образования стерического барьера аналогично тому, как это происходит в механизме действия РНК полимеразы. Методом ЯМР исследован белок Est3, играющий важную регуляторную функцию in vivo. Получено практически полное отнесение сигналов 1H, 13С и 15N белка Est3 из дрожжей Hansenula polymorpha. Полученные данные депонированы в международную базу данных химических сдвигов BioMagResBank (код BMRB-27146). Идентифицирована вторичная структура белка, исследованы динамические свойства белковой цепи Est3. Структурное выравнивание аминокислотных белков Est3 из дрожжей и белков TPP1 млекопитающих позволило выявить сходство в их структурной организации. Методом ЯМР определена структура белка Est3 в растворе. Установлено, что белок имеет топологию бета-бочки, окруженной пятью альфа-спиралями. Методами ЯМР на ядрах 31P изучена АТФ/ГТФ-азная активность Est3. Установлено, что в отличие от Est3 из дрожжей Saccharomyces cerevisiae белок из термофильных дрожжей Hansenula polymorpha не обладает заметной АТФ/ГТФ-азной активностью, что говорит о том, что такой вид активности не связан с функциональными свойствами Est3 в составе теломеразы. Изучено взаимодействие Est3 Hansenula polymorpha c фрагментами ДНК, соответствующими теломерным повторам. Установлено, что Est3 из Hansenula polymorpha не имеет высокой аффинности по отношению к одноцепочечным фрагментам ДНК. Методами виртуального скрининга проведен поиск потенциальных ингибиторов основной каталитической субъединицы теломеразы. Найдено соединение из библиотеки Интербиоскрин, потенциально способное связываться с активным центром фермента. Продолжен поиск ингибиторов C. freundii метионин гамма-лиазы – потенциальных антибактериальных соединений. Методами виртуального скрининга отобрана группа соединений, способных связываться с ферментом и имеющих структурное соответствие с ранее найденными соединениями-лидерами. Указанные соединения исследованы экспериментально методами ЯМР скрининга. Найдено соединение, обладающее высокими ингибирующими свойствами. Продолжена работа по отладке и модификации наиболее эффективных методов ЯМР скрининга, начатая на предыдущих этапах выполнения проекта. Целью этого направления исследований является создание эффективно работающего инструментария. В 2017 году отлажена методика проведения ЯМР экспериментов по детектированию лигандов, способных связываться с мишенями мегадальтонного размера. Исследование было проведено с использованием в качестве мишени полноразмерной бактериальной рибосомы. Установлены границы применимости методов ЯМР, в частности диапазон констант связывания низкомолекулярных лигандов, в котором удается наблюдать эффекты связывания лиганд-биомишень. Отработана методика SLAPSTIC, основанная на применении белков, модифицированных стабильными радикалами. Оптимизированы методы ЯМР для детекции лигандов, взаимодействующих с модифицированной мишенью. Показано, что наиболее эффективным методом детекции связывания в этом случае является разностная спектроскопия ЯМР в сочетании с применением T1ρ(T2) фильтров. С использованием алгоритмов анализа траекторий молекулярной динамики, разработанных на предыдущих этапах выполнения проекта, исследовано поведение четырех различных тетрапептидных фрагментов цинк-связывающего домена бета-амилоида человека в активном центре ангиотензинпревращающего фермента. Завершено начатое ранее исследование строения, конформационных и динамических свойств синтетических полипептидов пептидов из класса β-пролинов. По итогам проведенных в 2017 году исследований опубликовано или принято к печати две статьи, одна находится на стадии рассмотрения после внесения минорных исправлений, рекомендованных рецензентами, еще одна статья – на стадии рецензирования. Все журналы, в которых опубликованы или рассматриваются работы, реферируются WoS, Scopus и РИНЦ. Два из четырех журналов являются высокорейтинговыми (Q1). Успешно защищена диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по тематике настоящего проекта. Члены трудового коллектива принимали участие в работе международных конференций и международных научных школ, где было сделано 9 докладов, в том числе несколько приглашенных и устных.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Исследования, проведенные в 2018 году, выполнялись в соответствии с планом работ и были посвящены решению актуальных задач молекулярной фармакологии методами ЯМР и программными средствами, в том числе разработанными на предыдущих этапах выполнения проекта. Получен фрагмент 1-195 TEN-домена каталитической субъединицы теломеразы Tetrahymena thermophila. Измерение спектров гетероядерной корреляции 1H-15N этого белка показало, что он обладает существенно более низкой стабильностью в сравнении с аналогом из Hansenula polymorpha и склонен к агрегации. Указанные свойства не позволяют использовать методы ЯМР для определения его структуры и функциональных свойств. Методом ЯМР определена структура высокого разрешения в растворе белка Est3 теломеразы из Hansenula polymorpha. Для расчета структуры белка использовано 2262 ограничения на расстояния между протонами, полученными из анализа спектров NOESY, и 228 двугранных углов, полученных из анализа химических сдвигов атомов основной белковой цепи. Координаты атомов семейства из 20 структур ЯМР депонированы в банк белковых структур (PDB ID 6Q44). Белок Est3 содержит структурированное ядро (остатки 22 – 172), а также неструктурированные N- и C-терминальные хвосты. Ядро белка сформировано пятью β-листами и шестью α-спиралями. Структура центральной части белка имеет высокий уровень структурной гомологии с белком Est3 из Saccharomyces cerevisiae (PDB ID 2M9V) и теломерным белком человека TPP1 (PDB ID 2I46). Укладка белковой цепи Est3 имеет т.н. OB-фолд характерный для белков, связывающихся с олигосахаридами и/или олигонуклеотидами (например, TPP1). Проведен поиск вероятных партнеров Est3 по связыванию среди фрагментов ДНК и/или РНК, соответствующих вероятному окружению белка в теломеразном комплексе. Для мониторинга специфического белок-НК взаимодействия использовали Est3, обогащенный изотопом 15N, и методы гетероядерной корреляции 1H-15N. Исследования проводили как на системах Est3-НК, так и на тройных системах Est3-TEN-НК. В числе исследованных нуклеиновых кислот были фрагменты одноцепочечной РНК, одноцепочечной ДНК, квадруплексные структуры ДНК, РНК шпилька, РНК-ДНК гетеродуплексы, РНК-ДНК вилка. Во всех случаях специфического связывания Est3 с нуклеиновыми кислотами не наблюдали. Вероятно, оно происходит только в случае полностью собранного теломеразного комплекса, или же для взаимодействия Est3-НК необходим еще один белковый партнер (например, теломеразный белок Est1). Для ДНК аптамера RA-36 (ингибитор тромбина, 31 нуклеотидных остатков) изучены условия формирования квадруплексных структур в присутствии ионов калия и бария. RA-36 состоит из двух одинаковых фрагментов, каждый из которых способен образовывать G-квадруплексную систему из двух G-квартетов при действии одновалентных или двухвалентных ионов. Два фрагмента соединены коротким линкером из одного остатка тимидина. Формирование G-квартетов отслеживали по появлению характеристичных резонансов иминных протонов в области 10-12 м.д. Установлено, что присутствие ионов калия индуцирует образование одного из двух квадруплексов. При этом образуется конформационно подвижная система. В присутствии ионов бария формируются два G-квадруплекса и система становится конформационно жесткой. Изучение серии полинуклеотидов с одиночными заменами остатков гуанозина на инозин и тимидина на дезоксиуридин позволило сделать отнесение всех сигналов в спектрах ЯМР G-квадруплексных систем. Продолжены исследования возможностей использования методов ЯМР-скрининга для изучения взаимодействия низкомолекулярных лигандов с мишенями мегадальтонного размера, на примере бактериальной рибосомы. Установлено, что для таких больших мишеней эксперименты ЯМР могут быть информационно полезными лишь в довольно узком диапазоне величин Kd. Тем не менее, в условиях равновесия между свободными и связанными с рибосомой формами лигандов, можно наблюдать эффекты INPHARMA и ILOE, характеризующие взаимное расположение лигандов в сайте связывания. Методы ЯМР были использованы для определения структуры двух антибиотиков, найденных методами высокопроизводительного скрининга. В отчетный период проведены исследования по применению комплексов парамагнитных ионов лантанидов в экспериментах по ЯМР-скринингу. Такие комплексы вызывают парамагнитное усиление релаксации и псевдоконтактные сдвиги близкорасположенных сигналов белка и лигандов. Эти эффекты могут быть использованы для идентификации лигандов, способных связываться с белком. Синтезированы комплексы ионов гадолиния, диспрозия, европия и тербия. Получены образцы человеческого сывороточного альбумина (HSA), модифицированного комплексами лантанидов. Модифицированный белок использован в экспериментах ЯМР на модельной системе, содержащей L-триптофан и D-глюкозу. Показано, что сигналы триптофана, связывающегося с HSA, уширяются в случае модификации белка комплексами, содержащими гадолиний. При использовании HSA, модифицированного комплексами диспрозия, индуцирующего псевдоконтактные сдвиги, в спектрах ЯМР наблюдаются изменения химических сдвигов некоторых сигналов триптофана. Эти эффекты могут быть использованы для получения структурной информации о положении лиганда по отношению к парамагнитной метке, связанной с белком. Написана и отлажена импульсная последовательность для измерения профиля дисперсии релаксации сигналов 1Н лигандов, находящихся в равновесии между свободной и связанной с биомишенью формами. Эксперименты по дисперсии релаксации позволяют определить скорость диссоциации лиганда из комплекса с мишенью. Оптимизированы условия проведения эксперимента ЯМР с использованием спинового замка. Проведены измерения на тестовой системе, содержащей L-триптофан и бычий сывороточный альбумин, а также на найденных на предыдущих этапах выполнения проекта ингибиторах метионин гамма-лиазы. Проведено теоретическое исследование по оценке качества структур биомолекул, определенных методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ЯМР. Отобраны наборы структур из PDB, определённых этими методами. Разработан способ описания распределения атомов на поверхности молекулы белка. Написана программа для вычисления поверхности, доступной растворителю на уровне отдельных атомов белковых структур. Разработан и реализован в виде компьютерной программы способ сравнения распределений атомов на поверхности различных групп белковых структур. Показано значимое отличие в распределении атомов на поверхности структур белков, определённых методами РСА и ЯМР. Найдено теоретическое объяснение причины этого различия. Также показано, что структуры ЯМР имеют в среднем более рыхлую укладку, чем структуры РСА. В 2018 году опубликован обзор по методам ЯМР-скрининга, представляющий результаты проведенных исследований и современные достижения мировой науки в этой области. Три статьи находятся в редакциях журналов на различных стадиях рецензирования или внесения изменений после получения замечаний рецензентов. Все журналы, в которых опубликованы или рассматриваются работы, реферируются WoS, Scopus и РИНЦ и находятся в первой квартиле (Q1) списка WoS. Успешно защищена диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по тематике настоящего проекта. Члены трудового коллектива принимали участие в работе трех международных конференций и пяти международных или российских научных школ.