Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Фундаментальная научная проблема, на решение которой направлен проект, заключается в изучении функциональных последствий повреждения митохондриальной ДНК. Раскрытие этих ассоциаций даст новые знания об атерогенезе как возрастном дегенеративном патологическом процессе и создаст основу для разработки новых подходов к диагностике, профилактике и лечению атеросклероза. Результаты исследования ассоциации повреждения митохондриального генома и функциональных свойств клеток в модельных условиях позволят установить особенности и закономерности патологии сосудистого старения. Проект предлагает использование клеточных моделей на основе цитоплазматических гибридов (цибридов), которые в настоящее время являются одними из лучших для изучения митохондриальной дисфункции, и, в частности, роли мутаций митохондриального генома в развитии клеточной патологии. В 2017 году оптимизирована техника получения жизнеспособных безмитохондриальных rho0-клеток на основе линии THP-1. Оптимальным способом из протестированных вариантов с учётом подобранных условий культивирования оказались условия с добавлением 500 нг/мл этидиума бромида и 200 мкг/мл уридина. При этих условиях жизнеспособность безмитохондриальных клеток достигала 68% при достижении совокупной массы митохондрий 4% от такового в нативной линии THP-1. Были подобраны доноры тромбоцитов пациенты с нейтральным уровнем мутационной нагрузки митохондриального генома клеток крови, но с изолированным преобладанием определенных мутантных вариантов мтДНК. У всех кандидатов на включение в исследование в качестве доноров тромбоцитов были исследованы реактивные свойства моноцитов крови. Функциональный анализ активации моноцитов заключался в измерении концентраций цитокинов ФНО и CCL18, секретируемых клетками в стандартных условиях в ответ на провоспалительную стимуляцию интерфероном-гамма или противовоспалительную стимуляцию интерлейкином-4. Из обследованных лиц были отобраны 12 человек, у которых, с одной стороны, профиль мутантных вариантов мтДНК соответствовал заданным требованиям, а с другой стороны, показатели базальной и стимулированной секреции ФНО и CCL18 были абнормальными. Были проведены эксперименты по цитоплазматическому переносу мтДНК с выбранными точечными мутациями в безмитохондриальные rho0-клетки на основе линии THP-1 методом ПЭГ-слияния. Получено 12 различных цибридных линий на основе клеток THP-1, различающихся исключительно по содержанию митохондрий от разных доноров. Жизнеспособность полученных цибридных линий составляла от 86% до 98%, а совокупная масса митохондрий составляла от 85 до 112% по сравнению с клетками нативной линии THP-1. Возможность многократного пересева с сохранением жизнеспособности была подтверждена пересевами вплоть до 9 пассажа, а также путем контролируемого замораживания и размораживания с последующим наращиванием клеточной массы в культуре. Проведено полногеномное секвенирование мтДНК клеток полученных цибридных линий на платформе секвенирования следующего поколения Roche 454, произведена сборка консенсусной последовательности митохондриального генома, получены подробные последовательности митохондриального генома для каждой цибридной линии. Продемонстрировано, что все цибридные линии накапливают холестерин в результате инкубации с модифицированными ЛНП, но степень накопления варьировала от 37% до 112%. Таким образом, линии цибридных клеток существенно различаются по данному показателю функциональной активности. Проведено предварительное сравнительное изучение полученных цибридных линий в отношении ряда показателей метаболизма митохондрий и митохондриальной дисфункции. Цибридные клетки характеризовались более высокой скоростью потребления кислорода по сравнению с исходными нативными клетками линии THP-1, а также высокой вариабельностью реакции на добавление сукцината и разобщителей окислительного фосфорилирования. Такие характеристики, как пул NADH, редокс-индекс и накопление активных форм кислорода существенно варьировали между цибридными линиями, и ни одна из цибридных линий не воспроизводила фенотип исходной нативной линии THP-1. Таким образом, цибридные клетки, полученные из однородной линии THP-1, приобретают совершенно различающиеся функциональные свойства, и эти изменения обусловлены исключительно функциональной активностью донорских митохондрий и свойствами привнесенной донорской мтДНК.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На основании результатов полногеномного секвенирования митохондриальной ДНК из клеток 12 линий цитоплазматических гибридов (цибридов) было сформировано 3 группы таких клеточных линий: цибриды с преобладанием анти-атеросклеротических вариантов мтДНК; цибриды с нейтральным (равновесным) сочетанием анти-атеросклеротических и про-атеросклеротических вариантов мтДНК; цибриды с преобладанием проатеросклеротических вариантов мтДНК. На основании известных ассоциаций ряда вариантов мтДНК с атеросклерозом и измеренных показателей гетероплазмии в образцах мтДНК из клеток цибридных линий был рассчитан показатель суммарной (интегральной) мутационной нагрузки мтДНК. Была изучена базальная пролиферативная активность клеток цибридных линий, которую оценивали по экспрессии генов пролиферации PCNA, циклина B1 CCNB1 и циклина D1 CCND1. Были также изучены изменения пролиферативной активности клеток цибридных линий в условиях накопления холестерина, индуцированного модифицированными липопротеидами низкой плотности. Была изучена базальная синтетическая активность клеток цибридных линий, которую оценивали по экспрессии мРНК генов синтеза белка и коллагена - РНК-полимеразы 1 типа POL I, РНК-полимеразы 3 типа POL III и субъединицы 1 коллагена 6 типа COL6A1. Были также изучены изменения синтетической активности клеток цибридных линий в условиях накопления холестерина, индуцированного модифицированными липопротеидами низкой плотности. Была изучена базальная способность клеток цибридных линий к активации по провоспалительному (М1) типу, которая была оценена по экспрессии гена фактора некроза опухоли TNF. Была также изучена способность клеток цибридных линий к активации по провоспалительному (М1) типу в условиях накопления холестерина, индуцированного модифицированными липопротеидами низкой плотности. Была изучена способность клеток цибридных линий к активации по противоспалительному (М2) типу, которая была оценена по экспрессии гена С-С мотива 18 лиганда CCL18. Была также изучена способность клеток цибридных линий к активации по противоспалительному (М2) типу в условиях накопления холестерина, индуцированного модифицированными липопротеидами низкой плотности. Была изучена активность внутриклеточного метаболизма липидов клеток цибридных линий, оцениваемая по экспрессии мРНК генов холестеринэстеразы LIPA, ацилкоэнзим А : холестерин ацилтрансферазы ACAT1, триглицеридлипазы LIPC и синтетазы жирных кислот FASN, как базальной, так и в условиях накопления холестерина, индуцированного модифицированными липопротеидами низкой плотности. Была проведена оценка активности процессов апоптоза в клетках цибридных линий по экспрессии мРНК генов, ассоциированных с апоптозом (CASP3, CASP9, ENO1, NTN1, NTN4 и UNC5A), как базальной, так и в условиях накопления холестерина, индуцированного модифицированными липопротеидами низкой плотности. Была проведена оценка воспалительного статуса цибридных линий по экспрессии генов CD14, IL1B, CASP1 и APAF1, ассоциированных с воспалением, как базальной, так и в условиях накопления холестерина, индуцированного модифицированными липопротеидами низкой плотности.. Был изучены метаболизм митохондрий и проявления митохондриальной дисфункции в клетках цибридных линий путем измерения скорости поглощения кислорода клетками, измерения степени поляризации митохондрий, а также по экспрессии мРНК гена маркера митофагии LAMP1. Был выполнен биоинформационный анализ связей между вариантами мтДНК и измененными функциональными свойствами цибридных линий. Было установлено, что любая из клеточных цибридных линий характеризовалась уникальным сочетанием митохондриального генотипа, суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома и фенотипических характеристик. Учитывая происхождение цибридных линий от одного типа клеток линии THP-1, обладающих одинаковым ядерным геномом, все наблюдаемые различия их фенотипов следует объяснять исключительно прямой или регулирующей ролью митохондриального генома, в том числе, за счет его вариабельности. Для определения суммарной мутационной нагрузки были использованы показатель гетероплазмии мтДНК по 10 вариантам (del652G. m.3336T>C, m.3256C>T. m.5178C>A, m.12315G>A, m.15059G>A, m.1555A>G, m.13513G>A, m.14459G>A и m.14846G>A). Тем не менее, в формировании суммарной мутационной нагрузки мтДНК определяющую роль играли варианты m.3256C>T, m.5178C>A, m.12315G>A и m.1555A>G. Остальные варианты мтДНК оказывали модулирующее действие, влияя на отдельные показатели функциональной активности клеток. Суммарная мутационная нагрузка определяла следующие проявления фенотипа цибридных клеток: базальную пролиферативную активность; пролиферативную активность, синтетическую активность и синтез коллагена при накоплении внутриклеточного холестерина; активность внутриклеточной холестеринэстеразы при накоплении холестерина; подавление апоптоза при накоплении холестерина; активацию митофагии. Отдельные компоненты мутационной нагрузки мтДНК участвовали в перечисленных эффектах, а также оказывали собственное влияние на формирование фенотипа клеток цибридных линий. Получены следующие характеристики этих эффектов. Вариант мтДНК del562G влияет на потребление кислорода митохондриями, в частности, способствует подавлению АТФ-синтазы и гиперполяризации мембран усиливает синтез эфиров холестерина и подавляет синтез жирных кислот, активирует апоптоз при накоплении внутриклеточного холестерина через нетринный путь. Вариант мтДНК m.3336T>C влияет на потребление кислорода митохондриями, в частности, способствует подавлению АТФ-синтазы и деполяризации мембран, а также индуцирует митофагию. Вариант мтДНК m.3256C>T способствует гиперполяризации мембран, усиливает базальную пролиферативную активность, а также пролиферативную активность при накоплении холестерина в клетках; усиливает базальную синтетическую активность и при накоплении холестерина; стимулирует как гидролиз эфиров холестерина, так и их синтез; при внутриклеточном накоплении липидов усиливает синтез эфиров холестерина и гидролиз триглицеридов; блокирует каспазный путь при апоптозе, но при этом активирует рецепторы нетринного пути при накоплении холестерина, а также усиливает митофагию. Вариант мтДНК m.5178C>A усиливает базальную пролиферацию и пролиферацию при накоплении внутриклеточного холестерина, усиливает базальную синтетическую активность и синтетическую активность при накоплении холестерина в клетках; активирует базальный гидролиз триглицеридов; активирует митофагию. Вариант мтДНК m.12315G>A способствует сохранению активности АТФ-синтазы; активирует как гидролиз эфиров холестерина при их накоплении в клетках, так и их синтез, активирует базальный синтез эфиров холестерина и гидролиз триглицеридов; активирует провоспалительный ответ при внутриклеточном накоплении холестерина. Вариант мтДНК m.15059G>A стимулирует как базальную синтетическую активность, так и при накоплении холестерина; активирует как провоспалительный, так и противовоспалительный ответ на накопление холестерина. Вариант мтДНК m.1555A>G способствует деполяризации мембран, подавляет пролиферативную активность; подавляет как базальную синтетическую активность, так и при накоплении холестерина; подавляет гидролиз эфиров холестерина при накоплении липидов в клетке; подавляет базальный синтез эфиров холестерина; активирует апоптоз при накоплении холестерина в клетках. Вариант мтДНК m.13513G>A при накоплении холестерина в клетках активирует как противовоспалительный, так и провоспалительный ответ, а также ингибирует синтез жирных кислот. Вариант мтДНК m.14459G>A способствует гиперполяризации мембран; усиливает как базальный нетринный путь апоптоза, так и при накоплении холестерина в клетках; усиливает базальный провоспалительный статус клеток. Вариант мтДНК m.14846G>A препятствует накоплению холестерина в клетках, индуцированного атерогенными ЛНП; усиливает деполяризацию мембран; подавляет как базальную пролиферативную активность, так и при накоплении холестерина; подавляет синтетическую активность при накоплении холестерина; повышает как базальный провоспалительный статус клеток, так и при накоплении липидов; активирует как базальный апоптоз, так и при накоплении внутриклеточного холестерина. В результате завершения проекта получена принципиально новая информация, раскрывающая механизмы изменений функциональных свойств клеток, обусловленных наличием проатерогенных и антиатерогенных вариантов (мутаций) мтДНК. Публикации (DOI): 10.1016/j.atherosclerosis.2018.06.381 10.1016/j.atherosclerosis.2018.06.810 10.1016/j.atherosclerosissup.2018.04.312 10.1016/j.atherosclerosissup.2018.04.311 10.1155/2018/4647214 10.1155/2018/7620234 10.1016/j.dib.2018.02.068 10.1155/2018/9749457 10.25557/0031-2991.2018.01.4-10 10.2174/1381612824666180115120725 10.2147/TCRM.S154863