КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-14-01169

НазваниеСоздание первой в мире генетически кодируемой системы автономной биолюминесценции эукариот

РуководительЯмпольский Илья Викторович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения2017 - 2019

КонкурсКонкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словабиолюминесценция, биолюминесцентные грибы, люциферин, люцифераза, автономная биолюминесценция, светящиеся растения

Код ГРНТИ34.15.00


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Предлагаемый проект посвящен разработке новой генетически кодируемой автономной биолюминесцентной системы эукариот. Биолюминесценция – это явление холодного свечения живых организмов. Как правило, видимый свет излучается в результате химической реакции окисления молекулы люциферина кислородом воздуха под действием фермента, который называют люциферазой. На явлении биолюминесценции основано большое разнообразие современных аналитических методов, таких как тесты на различные аналиты in vitro и in vivo, иммунологические исследования, высокопроизводительный скрининг для разработки лекарственных препаратов, анализ по генам-репортерам, биолюминесцентный имиджинг. На сегодняшний день только бактериальная биолюминесцентная система может быть полностью закодирована в живом организме с помощью lux оперона. Остальные биолюминесцентные системы могут быть применены только при условии добавления субстрата биолюминесценции (люциферина) извне перед каждой процедурой анализа. Биолюминесцентная система бактерий не может быть широко применимой в организмах эукариот не только из-за проблем, связанных с экспрессией бактериальных генов, но и в связи с токсичностью бактериального люциферина. Автономная биолюминесцентная система, пригодная для создания эукариотических биолюминесцентных организмов, найдет применение в подавляющем большинстве современных биолюминесцентных аналитических методов. Единственным на данный момент перспективным кандидатом такого рода является биолюминесцентная система высших грибов (базидиомицетов). Благодаря прогрессу в изучении биолюминесцентной системы базидиомицетов авторами данного проекта, были выявлены основные субстраты биолюминесцентной системы высших грибов и белки, ответственные за их синтез. В связи с этим разработка уникальной автономной биолюминесцентной системы и новых гетерологических систем в эукариотах на их основе становится реалистичной задачей, и логичным первым шагом станет создание автономно светящихся растений. Также мы видим возможность экспрессии биолюминесцентной системы базидиомицетов и в других организмах. В результате работы по данному проекту впервые будет получена автономная генетически кодируемая люминесцентная система, пригодная для создания эукариотических организмов. Абсолютная уникальность данной системы (возможность экспрессии в эукариотических клетках) обеспечивает развитие целого пласта новых конкурентноспособных аналитических биолюминесцентных методов на ее основе (в том числе биоимиджинга). Также выполнение данного проекта внесет существенный вклад в развитие современных разделов биохимии и протеомики, посвященных светящимся организмам.

Ожидаемые результаты
Основным результатом выполнения данного проекта станет разработка первой в мире автономной биолюминесцентной системы эукариот. Реализация данного результата будет осуществлена путем установления первичной структуры генов, кодирующих белки биолюминесцентной системы грибов, изучение и оптимизация векторных последовательностей для экспрессии генов в организмах-хозяинах, сборка вектора с кассетой генов автономной биолюминесцентной системы. Финальным результатом станет получение культуры автономно люминесцентных клеток эукариот (на примере клеток растений). Полученная генетически кодируемая автономная биолюминесцентная система эукариот на основе биолюминесцентной системы грибов восьми видов (Armillaria gallica, Armillaria mellea, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, Mycena citricolor, Neonothopanus nambi, Omphalotus olearius, Panellus stipticus) и все ее компоненты будут запатентованы. Абсолютная уникальность данной системы (возможность экспрессии в эукариотических клетках) обеспечивает развитие целого пласта новых конкурентноспособных аналитических биолюминесцентных методов на ее основе (в том числе биоимиджинга). Результаты работы будут опубликованы в ведущих научных журналах, таких как журналы Nature Publishing Group, Journal of American Chemical Society, Angewandte Chemie, Photochemical and Photobiological Sciences, Biochemistry и др.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Нами были обнаружены и секвенированы гены люцифераз биолюминесцентных грибов Armillaria gallica, Armillaria mellea, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, Mycena citricolor, Neonothopanus nambi, Omphalotus olearius, Panellus stipticus. Функция белков, закодированных данными генами, была подтверждена в гетерологической системе экспрессии (культура клеток млекопитающих HEK293T). Среди люцифераз различных грибов была выбрана самая эффективная для использования в гетерологической системе: люцифераза гриба Neonothopanus nambi. Путем анализа геномного контекста обнаруженных генов люцифераз и идентификации метаболических кластеров генов определены первичные структуры ДНК генов гиспидинсинтазы и гиспидин-3-гидроксилазы биолюминесцентной системы базидиомицетов; Получены отдельные векторные конструкции для экспрессии генов гиспидинсинтазы (HispS), гиспидин-3-гидроксилазы (H3H) и люциферазы (Luz) в дрожжах Pichia pastoris. Наработаны и очищены рекомбинантные белки (гиспидин-3-гидроксилаза, люцифераза) в количествах, достаточных для последующих биохимических исследований. Наработка и очистка белка гиспидинсинтазы из грибов признана нецелесообразной в силу большого размера данного белка (185 kDa по предсказаниям). Полученные векторы оптимизированы для экспрессии генов в организмах-кандидатах на создание гетерологических систем автономной биолюминесценции эукариот (дрожжи, культура клеток млекопитающих). Основным результатом работы над проектом на данной стадии является определение генов, кодирующих белки биолюминесцентной системы грибов (hisps, h3h и luz), а также предсказание белка, необходимого для функционирования HispS: 4-фосфопантетеинилтрансфераза (NpgA из Aspergillus nidulans). Новости проекта публикуются на сайте лаборатории http://www.ibch.ru/structure/groups/TotalSynthesis

 

Публикации

1. Минлянг Юань, Ксяоджи Ма, Тьяну Джианг, Юки Гао, Яньян Куи, Чаочао Жанг, Ксинге Янг, Юн Хуанг, Люпеи Ду, Илья Ямпольский, Миньонг Ли Prolonged bioluminescence imaging in living cells and mice using novel pro-substrates for Renilla luciferase Organic & Biomolecular Chemistry, Org. Biomol. Chem., 2017, Advance Article (год публикации - 2017).

2. Н. Маркина, А. Гороховатский, А. Котлобай, К. Саркисян, Ю. Мокрушина, И.Ямпольский Hispidin-3-hydroxylase: a luciferin biosynthesis enzyme of glowing fungi The FEBS Journal, The FEBS Journal 284 (Suppl. 1) (2017) 106 (год публикации - 2017).

3. Тьяну Джанг, Ксинге Янг, Юбин Жоу, Илья Ямпольский, Миньонг Ли New bioluminescent coelenterazine derivatives with various C-6 substitutions Organic & Biomolecular Chemistry, Org. Biomol. Chem., 2017, 15, 7008-7018 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В первый год выполнения проекта мы идентифицировали и клонировали гены, предположительно кодирующие ферменты биосинтеза люциферина грибов, а именно: ген гиспидин-синтазы (HispS) и гиспидин – гидроксилазы (H3H). Мы предположили, что HispS синтезирует гиспидин из кофейной кислоты и малонил-CoA, а H3H окисляет гиспидин в 3-гидроксигиспидин, который, как было установлено ранее, и является люциферином грибов. Также мы предположили, что для корректной работы гиспидин-синтазы необходим фермент 4-фосфопантетеинилтрансфераза и клонировали соответствующий ген (Npga из Aspergillus nidulans). Основной задачей отчетного этапа было экспериментальное подтверждение функций этих ферментов и изучение их свойств, а также оптимизация условий для их функционирования в модельном организме. Анализ аминокислотной последовательности гиспидин-гидроксилазы выявил ее сходство с 3-гидроксибензоат 6-монооксигеназами, которые окисляют 3-гидроксибензоаты, используя NADH и кислород. Превращение гиспидина в люциферин происходит похожим образом (окислением ароматического кольца). Используя данные о третичной структуре гомологов гиспидин-гидроксилазы (салицилат-гидроксилазы и других), мы предложили модель третичной структуры этого белка. Используя полученную модель, мы предположили возможное строение участка, связывающего кофактор, и собственно активного центра. Выявленные нами предположительные аминокислоты активного центра являются консервативными как у ближайших гомологов гиспидин-синтазы из высших грибов, так и у 3-гидроксибензоат 6- монооксигеназ. Анализ первичной последовательность гиспидинсинтазы выявил два домена: один гомологичен ацил-СоА-лигазам, второй гомологичен стирилпирон-синтазам. Такая мультидоменная структура характерна для поликетидсинтаз, осуществляющих синтез разнообразных вторичных метаболитов. Для подтверждения предполагаемых функций этих генов мы экспрессировали их в эукариотических гетерологичных системах. В качестве модельных организмов для экспрессии изучаемых генов были выбраны дрожжи Pichia pastoris и культура клеток млекопитающих НЕК293Т. Для детекции образования люциферина использовалась люцифераза грибов. Мы установили, что при коэкспрессии гиспидин-гидроксилазы и люциферазы в модельных организмах при добавлении к ним гиспидина возникает хорошо детектируемая люминесценция. При этом при одиночной экспрессии этих генов при добавлении гиспидина люминесценция отсутствует. Таким образом, клонированный нами ген H3H действительно является геном гиспидин-гидроксилазы. Затем мы проверили работу гиспидин-синтазы. Для этого в модельных организмах были одновременно экспрессированы люцифераза, гиспидин-гидроксилаза и гиспидин-синтаза. Однако при добавлении кофейной кислоты люминесценция отсутствовала, что свидетельствовало о неактивности гиспидин-синтазы. Для решения этой проблемы мы коэкспрессировали четыре гена – люциферазу, гиспидин-гидроксилазу, гиспидин-синтазу и 4-фосфопантетеинилтрансферазу в дрожжах. При добавлении к полученному штамму кофейной кислоты возникала яркая люминесценция, видимая невооруженным глазом. В случае отсутствия хотя бы одного из вышеперечисленных генов добавление кофейной кислоты не приводило к возникновению люминесценции. Таким образом, клонированый нами ген HispS действительно является геном гиспидин-синтазы, а кодируемый им белок требует посттрансляционной модификации – фосфопантетеинилирования. Добавление в модельную систему гена ацетил-КоА-карбокислазы (ACC1), синтезирующей малонил-CoA, не приводило к увеличению люминесцентного сигнала. Также мы попытались повысить эффективность биолюминесцентной системы путем слияния люциферазы и гиспидин-синтазы в одну полипетидную цепь. Для этого мы клонировали соответствующие открытые рамки считывания, соединив их последовательностью, кодирующей линкерный участок. Были созданы три различных варианта соединения люциферазы и гиспидин-гидроксилазы, однако активность (люминесценция) таких белков при экспрессии в клетках млекопитающих была ниже, чем при коэкспрессии отдельных плазмид, кодирующих люциферазу и гиспидин-гидроксилазу. Этот эффект наблюдался как при добавлении гиспидина, так и при добавлении люциферина, что говорит о снижении активности как минимум люциферазы в составе белка слияния. Также мы получили препарат гиспидин-гидроксилазы и продемонстрировать его ферментативную активность in vitro. Таким образом, в результате выполнения отчетного этапа проекта мы описали и экспериментально подтвердили путь биосинтеза люциферина высших грибов из кофейной кислоты и продемонстрировали возможность переноса соответствующего каскада в эукариотический организм. Добавление в этот каскад ранее изученных генов биосинтеза кофейной кислоты из тирозина позволит создать генетически кодируемую автономную биолюминесцентную систему, не требующую для свечения добавления экзогенного люциферина. Результаты работы опубликованы в журнале PNAS: https://www.pnas.org/content/pnas/115/50/12728.full.pdf.

 

Публикации

1. - Гриб-светильник: ученые смогут создать живые предметы обихода Газета Известия, https://iz.ru/816549/mariia-nediuk/grib-svetilnik-uchenye-smogut-sozdat-zhivye-predmety-obikhoda (год публикации - ).

2. - Российские биологи создали дрожжи, светящиеся в темноте РИА Новости, https://ria.ru/20181127/1533601876.html?referrer_block=index_archive_2 (год публикации - ).

3. - Ученые выяснили, как светятся грибы, и создали светящиеся дрожжи Газета.ру, https://www.gazeta.ru/science/news/2018/11/27/n_12340837.shtml (год публикации - ).

4. - Российские ученые создали светящиеся дрожжи телеканал 360tv.ru, https://360tv.ru/news/nauka/rossijskie-uchenye-sozdali-svetjaschiesja-drozhzhi/ (год публикации - ).

5. - Ученые нашли способ делать клетки светящимися с помощью ферментов биолюминесцентных грибов ТАСС, https://tass.ru/nauka/5840835 (год публикации - ).

6. - Ферменты из светящихся грибов заставили засветиться дрожжи Индикатор, https://indicator.ru/news/2018/11/27/griby-zastavili-drozhzhi-svetitsya/ (год публикации - ).

7. - Российские ученые смогут с помощью светящихся грибов обнаружить рак МК.РУ, https://www.mk.ru/science/2018/11/27/rossiyskie-uchenye-smogut-s-pomoshhyu-svetyashhikhsya-gribov-obnaruzhit-rak.html (год публикации - ).

8. - Ученые расшифровали биолюминесцентную систему грибов на генетическом и биохимическом уровнях Наука в Сибири, http://www.sbras.info/news/uchenye-rasshifrovali-biolyuminestsentnuyu-sistemu-gribov-na-geneticheskom-i-biokhimicheskom-ur (год публикации - ).

9. Котлобай А.А., Саркисян К.С., Мокрушина Ю.А., Марсет-Хубен М., Серебровская Е.О., Маркина Н.М., Сомермейер Л.Г., Гороховацкий А.Ю., Введенский А., Пуртов К.В., Петушков В.Н., Ямпольский И.В. и др. Genetically encodable bioluminescent system from fungi Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS, 2018, Vol. 115, No 50, 12728-12732 (год публикации - 2018).

10. Палкина К., Маркина Н., Мокрушина Ю., Чепурных Т., Саркисян К., Ямпольский И. Biosynthesis of hispidin by plant type III polyketide synthases in yeast and mammalian cell cultures FEBS Open Bio, FEBS Open Bio 8 (Suppl. S1) (2018) 107–496, p 172, P.07-024-Wed (год публикации - 2018).

11. Шимомура О., Стевани К., Каськова З.М., Царькова А.С., Ямпольский И.В. Bioluminescence: Chemical Principles and Methods (Third Edition) Chapter 9 Luminous Fungi World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. Singapore, - (год публикации - 2019).