Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Показано, что тропомиозины с одинаковыми мутациями в обеих субъединицах белка (γγ-тропомиозин с мутациями R90P, E150A, A155T, E173A, ββ-тропомиозин с мутациями E41K, R91G и E139Х, и αα-тропомиозин с мутациями A155T, E240K и R244G) способны встраиваться в мышечное волокно, ингибировать и активировать АТФазную активность и увеличивать или уменьшать чувствительность тропонин-тропомиозинового комплекса к ионам кальция. Повышенная Са2+-чувствительность была обнаружена для мутантных форм γγ-тропомиозина R90P, A155T, E173A, мутантных форм ββ-тропомиозина E139Х и R91G, а также для αα-тропомиозина с мутацией A155T. Наоборот, пониженная Са2+-чувствительностью показана для ββ-тропомиозина с мутацией E41K. Впервые было показано, что мутантные формы тропомиозина, которые вызывают повышение Са2+-чувствительности (R90P, R91G, E139Х и E173A), обладают высокой гибкостью и при моделировании практически всех стадий АТФазного цикла располагаются между закрытой и открытой позициями. В присутствии этих мутантных тропомиозинов относительное количество «включенных» мономеров актина при низких концентрациях Са2+ уменьшается, тогда как количество головок миозина, сильно связанных с актином, существенно возрастает. На основании полученных данных было предположено, что высокая Са2+-чувствительность, наблюдаемая для тонких нитей, содержащих мутантные формы тропомиозина, не связана с ингибированием способности тропонина выключать мономеры актина. Поэтому использование реагентов, снижающих чувствительность тропонина к ионам Са2+, представляется неадекватным для лечения миопатий, ассоциированных с этими мутантными формами тропомиозина. Установлено, что тропомиозин с мутацией A155T может подавлять способность тропонина выключать мономеры актина при низкой концентрации Са2+. Такой тропомиозин обладает высокой жесткостью и при низких концентрациях Са2+ заметно смещается в открытую позиции, т. е. в позицию, которая позволяет миозину формировать с актином сильную форму связывания. Таким образом, причина высокой Са2+- чувствительности тонких нитей, содержащих тропомиозин с мутацией A155T, связана с тем, что при низкой концентрации Са2+ тропонин не «выключает» мономеры актина в достаточной мере, а положение тропомиозина оказывается существенно сдвинутым к открытой позиции. Показано, что замена E41K в ββ-тропомиозине при моделировании различных стадий цикла гидролиза АТФ вызывает смещение тропомиозина в направлении блокирующей позиции, ингибирует «включение» мономеров актина и образование сильной формы связывания между актином и миозином при высоких концентрациях Са2+. Такие изменения характера связывания поперечных мостиков с актином приводят к ослаблению сократительной функции мышечной ткани. На основании полученных данных мы предполагаем, что критическое значение для определения характера развития дисфункции мышечной ткани, ассоциированной с точечными мутациями тропомиозина, имеет аномальное поведение мутантного тропомиозина в цикле гидролиза АТФ: «замораживание» тропомиозина недалеко от открытой позиции вызывает появление высокой Са2+-чувствительности тонких нитей, наоборот, «фиксация» тропомиозина недалеко от блокирующей позиции инициирует понижение Са2+-чувствительности нитей. Дальнейший характер развития дисфункции мышечной ткани определяется поведением поперечных актомиозиновых мостиков в цикле гидролиза АТФ.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Для исследования молекулярных механизмов дисфункции скелетных мышц, связанной с наследственными миопатиями, в отчетном году был получен ряд рекомбинантных тропомиозинов (продуктов экспрессии генов TPM1, TPM2 и TPM3), несущих точечные мутации. Для выявления эффектов этих мутаций каждый мутантный тропомиозин был встроен в тонкие нити одиночного мышечного волокна и с помощью метода поляризационной микрофлуориметрии были изучены изменения в конформационных перестройках актина, тропомиозина и головок миозина на нескольких стадиях АТФазного цикла в присутствии ионов Са2+ в высоких и низких концентрациях. Кроме того, были исследованы структурно-функциональные свойства мутантных тропомиозинов с использованием ряда методов, таких, как измерения АТФазной активности миозина, кругового дихроизма, соосаждения белков, электрофоретического разделения белков мышечных волокон, конфокальной микроскопии. Если на прошлом этапе проекта были получены разрозненные предварительные данные о влиянии группы мутаций в разных изоформах тропомиозина на механизмы регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия, то в отчетный период мы смогли проанализировать эффекты этих мутаций, выявить общие и отличительные особенности поведения мышечных белков в присутствии мутантных тропомиозинов и соотнести эти особенности с определенными заболеваниями. Кроме того, была освоена методика получения гетеродимерных форм тропомиозина, содержащих мутацию только в одной из двух субъединиц молекулы, и мы надеемся получить эти формы белка в достаточном для исследований количестве и охарактеризовать свойства мутантных гетеродимеров тропомиозина. Сравнительный анализ конформационных перестроек мышечных белков в присутствии мутантных форм тропомиозина показал, что все точечные мутации приводят к аномальному поведению тропомиозина в АТФазном цикле и к связанным с этим отклонениям в работе сократительной системы мышечного волокна. Оказалось, что мутации можно классифицировать по вызываемым ими эффектам следующим образом. Замены R90P и E173А в γγ-тропомиозине, диагностированные у пациентов с врожденной диспропорцией типов мышечных волокон (CFTD), вызывали типичное «замораживание» тропомиозина в открытой позиции, включение мономеров актина и резкое увеличение количества поперечных миозиновых мостиков, сильно связанных с актином, на разных стадиях АТФазного цикла, даже при моделировании слабой формы связывания актина и миозина. Такие же эффекты вызывала замена E150A, первично диагностированная при кэп-миопатии (Cap), и R91G, диагностированная при дистальном артрогрипозе (DA). Мутации Q147P и E139Х в ββ-тропомиозине, диагностируемые при Cap, и мутации A155T в γ-тропомиозине, E117K и E41K в ββ-тропомиозине, обнаруженные при немалиновой миопатии (NM), характеризовались, наоборот, смещением и/или «замораживанием» тропомиозина в блокирующей позиции, резким уменьшением количества включенных мономеров актина и поперечных миозиновых мостиков в конформации сильного связывания. Для всех исследованных мутантных форм тропомиозина, вне зависимости от локализации мутации и характера миопатии, была обнаружена корреляция между изменением относительного количества миозиновых поперечных мостиков в конформации сильного связывания при низких концентрациях Са2+ и изменением Са2+-чувствительности тонких нитей. Молекулярные механизмы изменения Са2+-чувствительности могут существенно отличаться для разных мутаций. Так, увеличение чувствительности к ионам Са2+ может быть связано как с тем, что головки миозина ингибируют выключение тонкой нити тропонином, так и с ингибированием включения тонкой нити самой головкой миозина. Кроме того, Са2+-чувствительность может возрастать в связи с появлением областей тонкой нити, не содержащих тропомиозин – «голых» областей тонкой нити (как это может происходить в случае мутаций E139Х и Q147P в ββ-тропомиозине). По нашим оценкам, в тонких нитях, содержащих E139Х- или Q147P-мутантные тропомиозины, «голые» участки занимали до 10-15% тонкой нити, что, по-видимому, способствовало увеличению Са2+-чувствительности. Уменьшение Са2+-чувствительности коррелирует с аномальной локализацией мутантного тропомиозина ближе к внешним доменам актина. Несмотря на то, что количество головок миозина в конформации, характерной для сильного связывания с актином, и Са2+-чувствительность могут увеличиваться или уменьшаться в зависимости от мутации в тропомиозине, результат этих нарушений одинаковый – мышечная слабость. Для эффективной работы миозиновых мостиков, прохождения ими полного цикла и генерации силы важно не только сильное связывание миозиновых головок с актином, но и расслабление. Появление аномально высокого количества поперечных миозиновых мостиков, образующих с актином сильную форму связывания, в цикле гидролиза АТФ при высоких концентрациях Са2+, а также появление ригорных мостиков при расслаблении мышечного волокна, могут привести к падению сократительной способности мышечной ткани, возникновению ригора и появлению разрывов миофибрилл и морфологических изменений мышечной ткани, типичных для Cap или DA. С другой стороны, фиксация тропомиозина недалеко от блокирующей позиции вызывает уменьшение количества поперечных мостиков, существенных для развития мышечного напряжения, что также может привести к падению сократительной способности мышечной ткани, типичному для большинства наследственных миопатий человека. Несомненно, что для разработки стратегии предотвращения и прогрессирования мышечной слабости при миопатиях необходимо точно диагностировать заболевание. Диагностика миопатий затрудняется тем, что одна и та же мутация встречается у разных пациентов с различными клиническими и гистологическими признаками. При отсутствии каких-либо структурных аномалий в мышечной биопсии и при гипотрофии волокон первого типа (медленных) по сравнению с волокнами второго типа (быстрыми) с порогом диспропорции не менее 12% ставится диагноз CFTD. Тем не менее, малые по размеру волокна первого типа являются общей структурной особенностью всех миопатий, исследованных нами. В мышечной биопсии могут быть обнаружены немалиновые тельца или кэп-структуры, или то и другое одновременно. Появление таких белковых агрегатов в саркомере, как нам представляется, вызвано компенсаторными процессами в мышечном волокне вследствие тех структурных и функциональных нарушений свойств мышечных белков, которые были обнаружены в нашем исследовании. Таким образом, система диагностики скелетных миопатий имеет ряд недостатков, что затрудняет разработку подходов к коррекции изменений сократительной функции саркомера. Одним из критериев, позволяющих провести точную идентификацию заболевания, может служить характер изменения количества миозиновых поперечных мостиков в конформации сильного связывания в АТФазном цикле при высокой концентрации Ca2+. Увеличение количества таких мостиков было типичным для мутаций, ассоциированных с CFTD и DA. В противоположность этому, в аналогичных экспериментальных условиях при Cap и NM наблюдалось уменьшение количества таких мостиков. При этом мутации, ассоциированные с NM, как правило, вызывали более сильное уменьшение количества поперечных миозиновых мостиков при высоких концентрациях Са2+, чем мутации, ассоциированные с Cap. Согласно этому критерию, ранее не исследованную замену E150A в γγ-тропомиозине следует отнести к CFTD (диагностирована как Cap), а замену A155T в γγ-тропомиозине - к Cap (диагностирована как NM). Вместе с тем было показано, что поведение сократительной и регуляторной систем для разных мутаций, ассоциированных с одной и той же миопатией, могут существенно отличаться друг от друга. Различия могут состоять в способности тропонина и/или миозина включать или выключать актиновые мономеры и перемещать тропомиозин в закрытое, блокирующее или открытое положение. Например, было обнаружено, что мутация R90P в γγ-тропомиозине, связанная с CFTD, ингибирует способность тропонина включать мономеры актина при высокой концентрации Са2+, в отличие от мутаций E173A и E150A в γγ-тропомиозине, которые активируют включение актиновых мономеров при высоких концентрациях Са2+. Следовательно, использование агентов, которые ингибируют активацию мономеров актина при высокой концентрации Са2+, может быть неприемлемым для лечения миопатии, связанной с мутацией R90P. Использование ингибиторов работы тропонина, по-видимому, является неадекватным подходом в лечении миопатии, связанной с заменой A155T в γγ-тропомиозине, которая вызывает появление высокой Са2+-чувствительности тонкой нити, поскольку эта мутация не препятствует способности тропонина выключать мономеры актина при низких концентрациях Са2+. Таким образом, следует искать другие подходы к восстановлению работы сократительной системы в этих случаях, а для этого необходимо иметь полную информацию на молекулярном уровне о влиянии мутации, связанной с этой болезнью, на поведение регуляторных и сократительных белков мышечного волокна. Проведённая нами работа по выявлению особенностей функционирования сократительной системы в присутствии различных мутаций в тропомиозине, как нам представляется, является важным шагом к ранней и точной классификации скелетных миопатий и правильному выбору фармакологических агентов для нормализации мышечной функции. Сравнительное исследование влияния точечных замен в αα-, γγ- и ββ-тропомиозине, ассоциированных с различными наследственными заболеваниями скелетной мускулатуры человека, позволило выявить критические изменения конформации тропомиозина, актина и миозина в АТФазном цикле, которые играют важную роль в возникновении миопатий. Предложено использовать характер изменения позиции тропомиозина и количества миозиновых мостиков в конформации сильного связывания с актином в АТФазном цикле в качестве тестов для точной диагностики наследственных миопатий человека и для раннего выявления нарушения Са2+-чувствительности мышечного волокна. Результаты исследования были представлены на 47-й Европейской мышечной конференции в виде 5 стендовых докладов и опубликованы в 3 статьях в журналах с высоким импакт-фактором и в 1 статье в журнале Цитология.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Одной из главных задач работы в 2019 г. было показать возможность выяснения молекулярных механизмов нарушения регуляции мышечного сокращения при патологии скелетной мышечной ткани вследствие точечной мутации в тропомиозине, присутствующей только в одной из двух цепей молекулы (в гетеродимере тропомиозина) на основании информации об эффектах мутации в обеих цепях этой молекулы (в гомодимере тропомиозина). В качестве объекта исследования был выбран тропомиозин, содержащий мутацию Arg133Trp в β-субъединице αβ-гомодимера и ββ-гетеродимера тропомиозина, идентифицированную при немалиновой миопатии, дистальном артрогрипозе и врожденной диспропорции типов мышечных волокон человека. Последовательности кДНК α- и β-тропомиозинов, экспрессирующихся в скелетных мышцах человека - изоформ Тpm1.1 и Tpm2.2 – были встроены в плазмиду pMW172. Для получения мутантных форм тропомиозина в кДНК Tpm2.2 с помощью сайт-направленного мутагенеза встраивали мутацию, приводящую к аминокислотной замене в β-тропомиозине Arg133Trp. С целью получения гетеродимеров в кДНК β-тропомиозина также встраивали последовательность, кодирующую полигистидиновую вставку в N-концевой области (His6tag) и сайт узнавания для протеазы Factor Xa. После культивирования бактериальной культуры плазмидную ДНК выделяли и амплифицировали. Для проверки правильного клонирования образцы каждого клона секвенировали, а результаты секвенирования сравнивали с известными последовательностями ДНК. Рекомбинантные белки получали в системе бактериальной экспрессии Escherichia coli в клетках BL21(DE3)pLysS. Формы тропомиозина, не содержащие полигистидиновую вставку, очищали с использованием ионообменной хроматографии. Те формы тропомиозина, которые содержали вставку His6tag (His6-меченные) очищали с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA. αβ-гетеродимерные формы тропомиозина получали при смешивании немеченных гомодимеров тропомиозина и His6-меченных в соотношении 4:1. Тропомиозины, несущие полигистидиновую вставку, отделяли друг от друга с использованием аффинной хроматографии TALON. Полигистидиновую вставку удаляли путем инкубации образцов в растворе, содержащем протеазу Factor Xa. С помощью метода конфокальной микроскопии проверяли способность тропомиозина встраиваться в компартменты тонких нитей теневых мышечных волокон. С помощью метода электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле, cистемы гель-документирования BioRad ChemiDoc MP и программного обеспечения ImageJ, проанализированы чистота препаратов мышечных и рекомбинантных белков и состав модельных мышечных волокон, используемых в работе. С помощью метода поляризационной флуоресцентной микроскопии исследованы эффекты мутации Arg133Trp в β-субъединице αβ-гетеродимера и ββ-гомодимера тропомиозина на способность тропонина Са2+-зависимым образом оказывать влияние на пространственную организацию тропомиозина, актина и субфрагмента-1 миозина. Результаты о конформационных перестройках актина, миозина и тропомиозина в присутствии мутантного тропомиозина были получены непосредственно в высокоупорядоченной системе одиночного мышечного волокна, что, несомненно, является главным преимуществом метода поляризационной микрофлуориметрии и разработанных подходов. Для этого регуляторную систему одиночных теневых мышечных волокон реконструировали с использованием полученных рекомбинантных тропомиозинов и тропонина. Были измерены параметры поляризованной флуоресценции зондов 1,5-IAEDANS, FITC-фаллоидина, и 5-IAF, связанных с головками миозина (в виде субфрагмента-1), актином и тропомиозином, соответственно, при моделировании в мышечном волокне различных функциональных состояний тонких нитей и стадий АТФазного цикла. Выявлены и охарактеризованы неизвестные до настоящего времени особенности в регуляции Arg133Trp-мутантным αβ- и ββ-тропомиозином взаимодействия миозина с актином в цикле гидролиза АТФ. Обнаружено, что мутация Arg133Trp препятствует смещению тяжей тропомиозина в открытую позицию в тонких нитях, деактивирует мономеры актина и уменьшает относительное количество головок миозина, сильно связанных с Ф-актином. Как результат, уменьшается эффективность работы миозиновых поперечных мостиков. При низкой концентрации Ca2+ количество головок миозина в сильно связанной с актином конформации также уменьшается по сравнению с контрольным тропомиозином, что свидетельствует о снижении чувствительности миофиламентов к Ca2+ в присутствии замены Arg133Trp в тропомиозине. Обнаруженные критические изменения конформационного состояния актина, миозина и тропомиозина, ассоциированные с мутацией Arg133Trp, оказались схожи с изменениями, выявленными для мутаций Glu41Lys и Glu117Lys в β-тропомиозине. Таким образом установлено, что мутации Glu41Lys, Glu117Lys и Arg133Trp в β-тропомиозине по молекулярному механизму влияния на сократительную функцию могут быть отнесены к одному и тому же патологическому варианту скелетной миопатии, с аналогичными последствиями для функции и структуры саркомера. Это указывает на то, что для предотвращения и/или компенсации последствий нарушения механизмов регуляции этими мутантными формами тропомиозина актин-миозинового взаимодействия возможно применение единых терапевтических подходов. На основании полученных данных предложено использовать выявленные критические изменения конформации в качестве тестов для ранней диагностики немалиновой миопатии и мишеней для поиска путей восстановления сократимости при данном заболевании. Сделан вывод о том, что целесообразным для восстановления мышечной функции у пациентов с мутациями Glu41Lys, Glu117Lys и Arg133Trp в тропомиозине будет использование реагентов, которые активируют работу миозина. Проведен сравнительный анализ влияния мутации Arg133Trp в одной и обеих β-субъединицах αβ-гетеродимера и ββ-гомодимера тропомиозина на механизмы регуляции взаимодействия миозина с актином, что важно для анализа функциональных нарушений в саркомере in vivo при гетерозиготных мутациях, а также для оценки возможности использования информации о молекулярных механизмах нарушения регуляции мышечного сокращения, полученной в присутствии мутаций в обеих цепях молекулы тропомиозина. Установлено, что относительное количество сильно связанных с актином головок миозина и количество «включенных» мономеров актина (способных активировать гидролиз АТФ в миозине) существенно ниже в присутствии мутации в обеих субъединицах ββ-гомодимера тропомиозина, чем в одной β-субъединице αβ-гетеродимера. Кроме того, амплитуда конформационных перестроек при переходе головки миозина из слабой в сильную форму связывания с актином снижается наибольшим образом в присутствии мутантного ββ-гомодимера тропомиозина, что указывает на снижение эффективности работы поперечных миозиновых мостиков в цикле гидролиза АТФ. Несмотря на количественные различия, качественный характер тех критических изменений конформационного состояния актина, миозина и тропомиозина, которые происходят в результате аминокислотной замены Arg133Trp, был одинаковым для αβ-гетеродимера и ββ-гомодимера тропомиозина. В последнем случае ключевые аспекты нарушения регуляции сокращения проявлялись гораздо более отчетливее. Эти данные указывают на то, что для выяснения негативных эффектов мутаций в тропомиозине допустимо использование ββ-гомодимера тропомиозина. Выполнен сравнительный анализ эффектов мутаций Ala155Thr, Arg167His и Arg167Gly в двух изоформах тропомиозина – α (Tpm1.1) и γ (Tpm3.12). Обнаружено, что характер изменений конформационных перестроек актина, миозина и тропомиозина в присутствии этих мутации совпадает для α- и γ-тропомиозинов. Ala155Thr-мутантный α-тропомиозин, также как и γ-тропомиозин, смещен по направлению к внутренним доменам актина при низкой концентрации Са2+, по сравнению с тропомиозином дикого типа, что коррелирует с увеличением относительного количества головок миозина, сильно связанных с актином. В присутствии Arg167Gly-мутантных α- и γ-тропомиозинов происходит смещение тропомиозина в «открытую» позицию и появляется аномальное количество сильно связанных с актином головок миозина в цикле гидролиза АТФ. Замена Arg167His в α- и γ-тропомиозинах, наоборот, приводит к сдвигу тропомиозина в «блокирующую» позицию и вызывает уменьшение сильно связанных с актином головок миозина. Выявленные изменения структурного состояния сократительного аппарата могут быть причиной ослабления сократительной способности мышечной ткани, обнаруженной в мышечных волокнах, содержащих эти мутантные формы тропомиозина. Результаты исследований позволили выявить взаимосвязь между специфическими изменениями в функционировании актин-миозиновой системы при мутациях в тропомиозине и фенотипом миопатии. В качестве теста для классификации мутаций предложено использовать изменения в конформационных перестройках миозина и актина, происходящие в АТФазном цикле. Полученная информация имеет существенное значение для понимания фундаментальных основ мышечного сокращения в норме и при патологии мышечной ткани, необходима при поиске объектов терапевтического воздействия на ранних стадиях миопатии и может быть использована для тестирования потенциальных лекарственных препаратов.